Summary
細胞の浸透水透過係数（P fは ）測定することは、アクアポリンの調節機構（AQPs）を理解するのに役立ちます。ここに提示球状植物細胞プロトプラストにおけるP fの決定は、プロトプラストの単離および一定の浴潅流の間の浸透圧のチャレンジの結果としての体積変化のそれらの初期速度の数値解析を伴う。
Abstract
AQP調節機構を研究することは、細胞および全植物の両方のレベルでの水関係の理解のために重要である。ここで紹介するようなカエル卵母細胞などの他の球状の細胞にも原理的に適用可能な植物プロトプラストにおける浸透水透過係数（P fを ）決定するための簡単かつ非常に効率的な方法です。アッセイの最初のステップは、適切な等張液と室内への酵素的消化により関心対象の植物組織からのプロトプラストの単離である。第二段階は、浸透圧の挑戦アッセイで構成されています。室の底に固定化されたプロトプラストは、等張液で始まる定数灌流に提出し、低張液が続いている。細胞膨張は、ビデオ記録される。第三のステップでは、画像は体積変化を得るために、オフライン処理され、体積変化の時間経過をosmola変化の時間経過と相関しているチャンバ灌流培地のrity、P fで得た、Matlabの（ 'PfFit'）で記述された曲線当てはめ手順を使用する。
Introduction
水の取り込みと細胞膜を横切って流れるが、細胞および全植物の両方のレベルでの植物の存在の基本的な要件です。細胞レベルでは、アクアポリン（AQPs）は、細胞膜1-3の浸透水透過係数（P fの ）の調節において重要な役割を果たす。
現在までに、いくつかの方法は、異なる植物器官からのプロトプラストのfを内因Pを測定するために採用されている（ すなわち 、根、葉、内皮、 等 、ショーモンらによって概説4）。 P fを測定するためのアプローチの一つは、浸透チャレンジにプロトプラストを露出させるために、その体積変化（ すなわち 、体積変化の初期の線形位相の傾き）の初期速度を監視することである。二つの異なる方法が以前に両方の溶液の瞬間的な交換に基づいて、このアプローチに基づいて説明した。最初のものはimmobilizで構成されてい吸引マイクロピペットでプロトプラストをると溶液流5とマイクロピペット6を使用して別の溶液からプロトプラストを転送する第1の切り替え。高速の溶液交換の非常に開始時の画像取得を可能にするこれらのマイクロピペット吸引マイクロピペットの転送方法は、可能性が高いプロトプラストへの物理的なストレスを伴う、（体積変化の早い直線位相を捕捉する）と、特殊な装置や専門家のマイクロマニピュレーションを必要とします。
ここで説明する方法はマイクロマニピュレーションを伴わない浴潅流が瞬間的でない場合、P fの導出を可能にし、細胞への障害を最小限に抑えることができます。
酵素消化の後、等張液に沈めプロトプラストは、電荷相互作用によってプレキシガラス（別名ルーサイトまたはパースペックス）チャンバーのカバースリップガラスの底に固定化される。その後、一定の入浴灌流の間に、等張液をプロトプラストに低浸透圧の挑戦を生成する低張液によって洗い流されている。プロトプラストの膨潤は、映像を記録した後、浴灌流の時間経過および細胞膨潤の時間経過に関する情報を組み合わせることにより、P fは画像処理及び曲線適合手順によって決定される。
この方法の利点は、実験は非常に効率的であること、それが単一のアッセイにおいて同時に少数の細胞を監視することが可能であり、それは特別な機器や特定のマイクロマニピュレーション技術を必要としないこと、すなわち 。この方法のためのいくつかの応用が可能である。例えば、このような葉肉などの異なる組織や植物由来の細胞のさまざまなネイティブのP fの決定とシロイヌナズナの葉7、トウモロコシの葉の葉肉や根皮質細胞8-10または懸濁液培養細胞11,12から鞘細胞をバンドル。 additiでに、そのような卵母細胞11のような球状の動物細胞のP fはを決定することが可能である。 P fに貢献すると決意;もう一つの例は、プロトプラスト（ 例えば 、キナーゼの遺伝子またはいずれかの他の遺伝子に影響を与える場合があります）でのそれらの遺伝子の一過性発現によりAQP活動の検討を必要とする。例えば、トマトAQP SlTIP2の発現; PEG変換と決定SlTIP2によるシロイヌナズナ葉肉プロトプラストにおける2; 2関連P 13 F。最後に、溶液に添加異なる分子/物質（薬物、ホルモンなど）のfを Pに対する効果の検討もAQPブロッカーのHgCl 2 7の例について、調べることができる。
以下のプロトコルは、シロイヌナズナの葉肉細胞とそれらのP fの決定のプロトプラストの単離を記載している。
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Protocol
溶液の調製
- 準備等張（600ミリオスモル）及び低張の10mMのKCl、1mMのCaCl 2、およびを含む（500ミリオスモル）ソリューション8 M 2（N-モルホリン） -エタンスルホン酸（MES）、pHが5.7との適切な量の浸透圧を調整するD-ソルビトール：等張および低張液440 mMのための540 mMの。浸透圧計を使用して（目標値の3％以内）の溶液の浸透圧を確認してください。
- 以下の酵素を含む「酵素ミックス」の乾燥原料の準備：0.55グラムセルラーゼ、0.1グラムのペクトリアーゼ、0.33グラムのポリビニルピロリドンK 30、0.33グラムのBSA（下記表1参照）、ボルテックスにより乾燥粉末を混ぜて、5.7 mgのアリコートを作成し、 -20℃で保存する。
シロイヌナズナ葉肉プロトプラストの単離2。
- 等張液の約6滴（約30μlの各）でペトリ皿（11センチ）を準備します。
- ピール背軸（下）シロイヌナズナの葉の表皮、C次いで溶液に触れ、下にさらさ背軸側に降下する等張液に正方形を配置し、約4×4 mm 2で正方形にむいた葉をUT。
- 、1.5ミリリットルチューブに165μlの等張液中の酵素ミックスの5.7ミリグラム（3.3％w / wで）に溶解し、溶解するまで分程度のためにピペッティングにより穏やかに混合し、同じペトリに酵素溶液を数滴を配置し、同様の一品。
- 酵素溶液が下がる上に、葉片を移し、パラフィルムの1ラウンドでふたを密封皿を閉じ、20分間インキュベート、28℃に設定した水浴中で料理をフローティング。
- 皿に等張液のより数滴（各酵素液滴当たり2滴）を追加します。番目のドロップ（酵素液を洗い流す）に、順次、その後、新たな等張液滴に各リーフピースを転送します。ピンセットを用いて、その縁による作品を持ち上げ、プロトプラストを解放する（ティーバッグのような）第二のドロップでそれを振る。1.5ミリリットルチューブにプロトプラスト（切り取ら100μlのピペットチップを使用して）で滴を収集します。
3低張挑戦アッセイ：シロイヌナズナ葉肉細胞膨張
- 低張液と等張液と別の列と1列を充填することによって灌流システム（ 図1A）を準備します。バルブを開き、すべての方法ダウンインレットマニホールド（ 図1B）にチューブを埋めるために、いくつかの溶液流（第一低張性、そして等張性）とする。トラップされた気泡が存在しないことを確認した後、バルブを閉じます。
- （; 図1Cに、チャンバの概略図を参照してください。図1B）プレキシガラススライド内チャンバのための底を作るために、シリコングリス（ 表1）を使用して、カバースリップを密封。プロトプラスト、コート用「スティッキー」（グリースリング内カバースリップの上に向けて露出面）をチャンバ底を作ってそれまたはポリ-L-リシン（水中0.1％、 表1）、正の電荷を担持する硫酸プロタミン（ 表1水中1％）を有する。ピペットチップを用いてカバースリップの上、この「糊」を広げ、1を待つ - 2分、3すすぎ - 等張液で4回、残りの溶液を離れて振る。
- 等張液でチャンバーを埋める。その後、切り取らピペットチップを用いて、チャンバに溶液を含むプロトプラストのドロップを追加し、3待つ - 落ち着くまでプロトプラスト4分。 （下の気泡をトラップ避ける）ソリューション面に触れ透明カバー（ 図1D、1E）とチャンバーカバー。
- （！チューブ内の気泡に対する保護）灌流システムおよびポンプに接続し、倒立顕微鏡台に（静かに！）スライドを配置し、1ミリリットル/分（より速い速度で一定の灌流のための等張液の流れをオンにする4ml /分）まで、使用することができる。
- 記録のために体積変化は、倒立顕微鏡は、20X対物レンズとし、PCコンピュータに接続されたCCDビデオカメラで使用されている。選択された不動のプロトプラストの60秒のビデオムービーを記録するためにImageJソフトウェアの「CMU 1394カメラのドライバ 'プラグイン（この二つのソフトウェア片のダウンロードアドレスについて特定の材料の表を参照）を使用してください（おそらく、一番下に貼り付けたもの） 1画像/秒（1Hz）での割合で。 （灌流の開始から合計60秒を完了するために）45秒低張液に切り替え、（これはベースラインを構成している）等張液の15秒洗浄で録音を開始します。 TIF形式のムービーを保存します。注：形状が球形とその最大周長（ 図2A）で十分に焦点を当てた細胞輪郭を持つ：以下の基準を満たす、できるだけ多くの細胞を用いて視野を選択してください。
ImageJのを用いた細胞体積変化4。分析
注：分析するには腫れセルの一連の画像は、「画像エクスプローラ」と（ザビエルDrayeによって書かれた）ImageJソフトウェア14の「プロトプラストアナライザ」プラグインを使用しています。彼らの最初の時点で選択されたプロトプラストを皮切りに、「プロトプラストアナライザ」プラグインは自動的にプロトプラストのエッジ（輪郭）を検出し、実験中にその地域の時間経過を計算します（プラグインは以下のPfFit解析プログラムで使用可能です） 。
- ImageJのを起動します。 「インポート」し、 '画像エクスプローラ」：彼らが展開としてムービーを開くには、連続して、ドロップダウンメニューに、その後、ImageJのパネル上の「ファイル」をクリックします。選択したムービーを強調表示して、それを右クリックして、「プロトプラストアナライザー」を左クリックします。実験中に大部分が不動のままプロトプラストを識別するために（プロトプラスト画像下部にあるスライダを使用して）、ムービーをブラウズ - これらが分析されます。戻る最初のIMA上GEは、マウスを使用して、その後現れた「検出パラメータ」の表に「OK」をクリックして、選択したプロトプラスト（ 図2B）の周囲（ImageJの描画ツールから採取）の円を描く。
- プロトプラスト検出アルゴリズムを起動するには、ドロップダウンメニューで、その後、プロトプラスト画像トップパネルの「プロセス」「ローカル」をクリックします。ムービー全体を通して、選択したプロトプラスト（ 図2C）の周りに緑の円を調べます。 Excelファイルの「結果」を保存します。 ImageJのを終了します。注：場合は赤い点が（悪い輪郭フィット感を示すために - 通常不良による画像コントラストに）表示され、異なるパラメータで再実行してください。
- 各セルに属する系統を分離するには、（ - 2つ以上のセルを同時に分析した場合には - 分析はフレーム毎に行われるため、絡み合っされます）、Excelで、セル番号欄（「オブジェクト」で保存されたデータを並べ替える）。
- DETEへP fの真の価値を得るためのピクセル対程度の変換係数をrmine、同じ20X顕微鏡対物レンズを経由してマイクロメートル定規のイメージをスナップ。定規イメージに沿って（ImageJの描画ツールから採取）のラインをドラッグして、ImageJのメインパネルの下部にある定規の長さに相当画素数をお読みください。 Excelファイル内の任意の画素領域の値は、以下2に変換します。テキストファイル（数値のみの2列）として（セルごとに個別に）領域の時間経過を保存します。注：これは、ボリュームフィット」PfFit 'プログラムに入力されます。
5。ImageJのとMatlabのプログラムP Fフィットを使用した実験室内での浸透圧の変化率をモデル化
- 等張液（ 'インジケーター色素'を生成するために）100mlに2mgのキシレンシアノール（ 表1、以下）を加える。
- インジケータ色素と非染めhの（3.1のように）灌流システムを準備しますypotonicソリューション。
- カバースリップ（前プロトプラストと同様に）でそれをカバーし、顕微鏡ステージ上に置き、ゆっくりインジケーター色素で室内を満たし、プレキシガラス室の底部にシリコングリスを使用してカバースリップを密封。
- 灌流システムとポンプにチャンバーを接続し、リットルml /分で一定灌流のためのインジケーター色素の流れをオンにします。
- 1Hzの速度で、60秒の動画を記録します。 45秒間の低張液に切り替えて、インジケーター色素の15秒で録画を開始します。撮影を停止します。インジケータ色素（少なくとも30秒間）と面一に、新しいムービーを開始します。 6回、すべての映画を保存する - 約5を繰り返します
- 変化する透過率の平均化時間経過を得るために、インジケーター色素の透過率のビデオ画像を分析するためにImageJソフトウェアを使用する。
- ImageJのを起動し、「ファイル」、そして、「開く」をクリックして、映画のために参照します。各映画のために、10ピクセル幅の縦型を描く映画の1 番目の画像上の任意の場所を矩形。 ImageJのメインパネル上の「イメージ」をクリックし、ドロップダウンメニューで「トリミング」をクリックします。
- 「スタック」と「メイクモンタージュ」（列60、行1）：彼らが展開として一列に（60秒ムービーの）60フレームの位置を調整するには、もう一度「イメージ」をクリックしてから、ドロップダウンメニューに連続してクリックします。どこでも画像の行全体に沿って1ピクセルの高水平の矩形を描画し、ImageJのメインパネルで「分析」をクリックし、ドロップダウン·メニューで「プロットプロファイル」をクリックします。注：ウィンドウのモンタージュのプロット '（図示せず）が表示され、透過率データのリストは、そのメニューから開くことができます。映画の各画像は、その10ピクセル幅の四角形、結果的に「タイムベース」に由来する10透過率の値によって、このリストで表現されている（画像連番）が10倍長い。
- 透過率のdatのリストをコピーしますExcelファイルへ（動画ごとに1つのリスト）。インジケーター色素のフラッシュのいくつかの映画から得た透過率の時間のコースを平均。 0.1画像連番を乗算して実時間ベースを生成する。テキストファイルに平均化され、時間経過（2列）を保存します。注：平均化する前に、必要に応じて、いずれかの不規則性を拒否するように、個別の経時変化をプロットします。映画はインジケーター色素の定常状態の透過率の少なくとも5最後の秒が含まれていることを確認。
- 浸透圧の時間経過のさまざまなパラメータを計算するためのMatlabのフィッティングプログラムP Fフィット（「指標フィット」のパネル、 図3）を起動します。 NOTE：浴溶液中の既知の初期および最終濃度に基づいて、解の変化、浸透濃度の時間経過は（指標色素透過率から、今度は、計算された）濃度の経時変化から算出される、ことを仮定同じダイナミクスに従う色素濃度。 P Fフィットは無料で使用できるプログラムです。 「PfFit_Installer_web.exeは'からダウンロードできます。詳細な説明と定義を持つフィットユーザガイド「F P P Fフィットプログラムをユーザに理解するのに役立つ補足ファイルとしてJoveのを介してアクセス可能である。
- 「インジケータフィット」パネルで、インジケーター色素の透過率（「指標データファイル」、 図3A）の平均時間経過のデータをインポートし、手動で現在の実験パラメータおよびパラメータ'width'と'の初期推定を挿入「インジケーター色素濃度の経時変化を記述した（ 図3B。クリック」t_halfインジケーター色素濃度（実際のデータとフィット、 図4A）の経時変化のプロットを表示するには、ファイル名を指定して実行」、およびモデル化された（計算値）浴の浸透圧（ 図4B）注：AGOODデータにフィットする（推奨： 図3に示した値で始まる）が不可欠である。
6。MatlabのフィッティングプログラムP fのフィットを使用して、P fを決定
注：真と完璧な浸透圧計11とプロトプラストの挙動に関する基本的な仮定に加えて、P fの決定は、P fが P fのこのダイナミクスは、時間の根底にあることを、時間とともに変化することがあることを前提にかかっている細胞体積変化の過程と、その3つのパラメータは、それを記述するために十分である：Pの第 （P fの初期値）、スロープPfを （P fの線形変化率）とディレイ（浴の開始までの期間を細胞体積の変化開始までのオスモル濃度変化）。異なるモデルは、null値11を含む異なるこれらのパラメータの組み合わせとその値、を含む、試験することができる。 P
- 「ボリュームフィット」パネル（ 図5）に切り替えます。インポート用のエリア·データ·ファイル（分析されたプロトプラスト、 図5Aの「地域」の時間経過したテキストファイル）を選択します。パラメータ·ソースとして「最後のインジケータフィッティング」を選択してください（ 図5B;代替案のための「P fのフィットユーザーガイド」を参照してください）。注：これらのパラメータ（ 図5D）は 、手順を適合ボリューム用浴中の浸透圧の変化を再生するために使用される。
- 「ボリュームフィット」パネル（ 図5（c））では、（初期化P fは 、スロープPfのディレイ（推奨：）P fのパラメータに対する初期推定を埋めるIIで開始し、マーク：それぞれ、1で始まる1、および30）、 'クラス'（推薦モデルを選んだ嵌合する3つのパラメータすべて）のための「チェックする」。 「ファイル名を指定して実行」をクリックし、暫定的な図形（ 図5E）を眼球、必要に応じて、Delayパラメータとレコードの長さを調整します。
- 適合品質を評価し、フィット感のエラーを記録するために、結果のグラフ（ 図6）調べます。いくつかは、それぞれ倍の初期化パラメータを変更し、「-'Runを再。注：プログラムが動かなくなったときにがっかりしてはいけない - ちょうどプログラムを再起動！
- フィット誤差の最小値を目指して、初期化パラメータの異なる組み合わせを皮切りに、この手順を数回繰り返します。
- 画面から直接フィット結果のリストをコピーし、またはTでそれらを見つける彼は「_FIT_Vol_Results.txt 'ファイルを生成されたPfFit。
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Representative Results
P fで決定し、異なるAQPsの活性を比較するために、シロイヌナズナの葉からの葉肉プロトプラストが用いられる。これらのプロトプラストは、低い基底（背景）P fはレベル 7を有することが見出されたかつ再現P fの測定を可能にするために機能的な発現系として働くことができる。
6週齢のシロイヌナズナ植物からの成熟葉からプロトプラストを単離し、3遺伝子は、シロイヌナズナからAQP遺伝子と構築（AtPIP2; 1）、トウモロコシ（ZmPIP1; 2及びZmPIP2; 4）（別途と）一過性であったPEG変換を用いて表現する方法15。プラスミドの多数にかかわらず、その性質のセルに適用され、他の植物系について以前に報告された一つのセルに二つのプラスミドの同期された一過性発現のために100％の成功率を示した結果に基づいて変換するためのイベントが同時であると仮定すると15,16は、それらは形質転換されたプロトプラスト（ 図7）を標識するために、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）をコードするベクターで同時形質転換した。
P fのアッセイのために、プロトプラストを、実験室（ 図1B）にセットし、それらは低張液（500ミリオスモル）で、その後、等張液（600ミリオスモル）で最初にフラッシュしながら、GFP標識されたプロトプラストを映像によりモニターし、灌流システム（ 図1A）を使用して。
まず、「画像エクスプローラ」と「プロトプラストアナライザ'プラグインは、細胞輪郭領域における変化の時間経過を生成するために使用された（ 図 ：細胞体積変化（ 図8A）のタイムコースは二段階で各細胞について得られた2）、次に、MatlabのフィッティングプログラムP Fフィットします（ 図5）は、テサロニケをインポートするために使用されたeは、地域やセルボリュームに変換します。 P f値 （ 図8C）は、インジケータの透過率変化のインポートを平均経時変化に、追加的に、細胞容積の経時変化に基づいて、P fはフィットプログラム（ 図5）を使用して、セルごとに導出し、そして色素（ 図3）は 、インジケーター色素濃度変化の経時変化に変換 その後（ 図4A）と-風呂浸透圧の変化（ 図4B、6Aおよび8B）の時間経過に。それはDELC、セル（CIN）での浸透濃度の違いとお風呂（COUT）、 すなわち 。で、水の流入のための駆動力は、ほとんど唯一Coutの変化（ 図6Aによるものであること、注目に値する）。この実験では、P fはアッセイ（ 図6B）の間に増加した。
P F 図8C）で形質転換された対照細胞のP fより有意に高かった。
図1：ボリューム·アッセイ系。 （A）実験：灌流システムは、溶液のリザーバを含んでいる（輸液列'Colsは'）顕微鏡台にセットプレキシガラススライドに接続され、チューブ（T）、バルブ（V）及び蠕動ポンプ（P）。 HS =低張液は、等張液、Cmのカメラ。（B）の実験室（CHR）と入口（イン）マニホールドコネクタを介して接続され、チューブとプレキシガラススライドの拡大図である。溶液をポンプに出口（アウト）を介してチャンバから吸引される。（C）の模式図プレキシガラススライド（反時計回り：トップビュー、長い側面図及び短側面図）：=ガラス製カバースリップ、中央チャンバ底; B =透明な粘着テープ（ 表1）、および中央室に通じる入口と出口ソリューション溝用のボトムとなる。スコッチテープ（たまにしか）交換されたとき、穴がチャンバーの下でそれに切断する。 cがスライドに接着プレキシガラスブロックを=; dは出口コネクタ穴を=。数字は、ミリメートルである（ただし、図面は正確な縮尺ではない）。（D）（また、プレキシガラス）、部分的に中央室（矢印）を覆う透明カバーをスライドの中央部分の拡大図、（E）概念図（上及び側面図）透明カバーの。透明カバーハンドル（Dにおける緑色プラスチック）の大きさは任意である。その他の詳細は、Cと同様である
2 / 51652fig2highres.jpg "幅=" 500 "/>
図2：「プロトプラストアナライザ」プラグインを使用してプロトプラスト画像を腫れの分析。 （A）は、A、プロトプラストとムービーの最初の画像、B、のような、しかし輪郭が自動検出される前に黄色の円が緑の円最後の画像までの最初から、C、、映画を見直した後に行われた選択を示しているしっかりと分析を受けて、「行儀」プロトプラストの輪郭に従う。（B）の正方形ピクセルでのエリア」、「プロトプラストの輪郭内の計算された領域の（（横軸上の画像数単位で）Time'コースプロットを' ）、各追跡（と番号）プロトプラストのため。（C）「プロトプラストアナライザ」プラグインのパラメータ入力パネル。四「検出パラメータは '微調整するプロトプラスト検出アルゴリズムを調整することができる。境界ピクセルの '数 'パラメータはプロトプラスト輪郭の最小厚さを設定する（デフォルト値：5）。 「相対的な重み」パラメータは、内部プロトプラストエリアと外側の境界の間のグレイレベル閾値差（デフォルト：2）影響を与える。 「最大円周率は「彼らの形状が円形から外れたときはいつでもプロトプラストを除外するためのしきい値を定義します。このパラメータは、プロトプラスト（：1.05デフォルト）と同面積の真円の円周にプロトプラスト円周の比率である。 「最大の面積増加 '（時間ステップごとに％増）パラメータは、パラメータ値（5％デフォルト値）上記の輪郭面積が増大してプロトプラストを除外します。最後に、プラグインは、小さなプロトプラストの動きを処理しますが、急速に移動するか、それが画像領域から消えプロトプラストの追跡を停止します。映画は、必要な回数だけ再実行することができ、単一のプロトプラストは、別途再分析することができる。.comの/ファイル/ ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：P Fフィットプログラムの「指標フィット」パネル 。この部分は風呂浸透圧の時間経過にインジケータ透過率の時間経過に変換します。（A）インジケータ色素の透過率変化の時間経過を含む保存されたデータファイルを参照します。（B）のいずれかの変数およびパラメータの以前に保存したリストを使用するか、 「true_C_init 'と' true_C_end '（初期浴溶液とバス経由で灌流し-assayソリューションF Pの浸透圧）、' t_start_wash：現在の実験の5変数値を手動で挿入する'（初期インジケータ色素レベルでのベースラインサンプリングの継続）、' threshold_％ '（プログラムが自動的にベースラインの透過率からの逸脱を検知したベースライン値の％; 1から5パーセントは通常、最も効果的である）、' N_steady_st_pts '（サンプル数 - 撮影し、すべてのインジケーター色素像を表す10個のサンプルでは、 - 浸透圧濃度にインジケーター色素濃度に変換するための重要な指標染料の最後の定常状態レベルで平均化されるため）と2のための初期推測インジケーター色素透過シグモイド時間経過の4つのパラメータ、「幅」およびt 半 （おおよそシグモイドの移行部の持続時間に関係し、それぞれその中間点に; トン半分は負のかもしれません！）。 「幅」およびt の半分に加えて、2つの最高のフィットパラメータは、初期推定値を必要とせずに得られるES：浸透圧の時間経過の説明（補足Pを参照するための物理的意味のないラグ（ 'flush_lag'）、槽内の液の到着にバルブ開度の間の時間、および 'C_init'が、必要フィットユーザーガイドF。
図4：浴中のインジケーター色素濃度および培地のモル浸透圧濃度（A）インジケータ色素濃度の経時変化を、データ（ドット）から直接計算し、それが洗浄されるようにベストフィットパラメータ（線）から離れてそれはインジケータ色素濃度の変化と同様の動態を仮定して、次の非着色された溶液（B）浴溶液のオスモル濃度変化の計算された時間経過による。
図5：P Fフィットプログラムの「ボリュームフィット」パネル（A）を分析プロトプラストの面積経時データファイルの参照（B）から、実験パラメータをインポートするには、「最後のインジケータフィッティング」オプションを選択します。 「インジケータフィット'から最後の実行（代替案のための補足P Fフィットユーザーガイドを参照）、（C）「モデルタイプ' / 'クラス'：クラスIは最も単純なモデル1、クラスIIが含ま-モデル2から5、クラスを。 III -モデルは、6 - 8。モデルは、パラメータが固定され、調整されている（。 すなわち 、自由に可変）フィッティング手順の間に（それは変えることができるようにボックスをチェック）、および'かどうかをされているかに関して異なるSlopePf 'および/または「遅延」はnullです。モードLS 1 - 6はMoshelion ら 11により詳細に論じている。 「組み合わせ」は「モデルタイプ '/'クラス 'の選択によって規定パラメータの選択肢を示しています。同じようなフィット結果を持つモデルの中では - 最も簡単な選択してください！ 「P fを '、'スロープPfと '（' Slope_Pf '）と（下記Eにおける「遅延」についての詳細）に示すような「ディレイ」パラメータを初期化します。変化浴浸透圧の経時変化を記述した（D）、変数およびパラメータは、手動で、またはB.（E）に（計算体積変化の時間経過の「RUN」を押すことによって呼び出される中間プロットを、記載のように入力され、セルの輪郭領域から）「ディレイ」パラメータの初期値の選択を支援します。推定値、細胞容積の変化開始までの第 1 の観点から、ベースラインの全長をeyeballingによって（ '包括的なディレイ： 'T-開始ウォッシュ' + '遅れ' / 'フラッシュ·ラグ」+「生理」「遅延」）との合計。 （また補足P Fフィットユーザーガイドを参照）、再び「VolumeFit」パネルの「遅延」と「ファイル名を指定して実行」のための入力パラメータとして、この値を挿入します。
図6：フィッティングの結果は「舞台裏」（A）：2区画における浸透圧濃度の計算された究極のタイムコース：。風呂（Coutが、緑の線）とセル（CIN、青線; Cinがある「完全な真浸透圧計」11）、およびそれらの間の差の経時変化（DELC -プロトプラストの容積変化と原形質膜のみを水に対して透過性であるという仮定に基づいて計算水の流れのための推進力となって、赤い線）は、「EO-TLAG」は「フラッシュ·ラグ」と、ここで低張挑戦の始まり（わずか約21秒）の終わりを示します。レッドボックス：適合値の誤差（フィット-ERR、以下のB中の定義を参照）、（B）の体積の時間経過をフィッティングの最終的な結果;グリーンボックス：「入力変数'（ 図5Aの凡例に定義された）P Fフィット/' VolumeFit」パネルから入力された値である。ブラックボックス： 'exptl-巻」と「装着し、巻は「実験データとベストフィットパラメータを使用して計算量は、それぞれ、「EO-TLAG「Aと同じであり、「EO-ディレイ'マーク体積変化の開始。 '3％エリア'破裂することなく引き伸ばす細胞膜の能力に表面積が3％増加した音量、推定限界をマークします。 'Pfは（スケーリング）は「フィッティング-BAの時間経過である「P fのスパン」として赤いボックスの下に示されている値にまたがる、算出したP fは sedの。レッドボックス：「フィットされたパラメータは'最高のフィットパラメータの値は以下のとおりです。' PfはI '（初期のP f）を 、「遅延」の低張挑戦の発症および体積変化の開始との間（期間（、この実施例で使用したモデル5によれば、また、P f値の変化で開始）と、「スロープ-P fを 「P f値の変化（一定の割合である「fit_ERR 'に示す。 - Matlabのフィッティング手順の最小化目標は-ベースライン量の％として提示し、黒色の線から緑色のドットの「二乗平均平方根」偏差（ すなわち 、平均化され、二乗偏差の平方根））であること。異なるパラメータの初期値と繰り返しフィッティングの相対的な成功と判定されたことをこの値である。A注意書き：ベストフィットパラメータ値は誤差最小化手順で見つかった極小値の結果である可能性がありのように - グローバル最小値が判明していることを確認するために、いくつかの実行はこれら3つのパラメータに異なる初期値で必要とされる（と'平均VOLM％'を比較して計算プロトプラスト体積変化の程度と「平均面積％」です。デルタはフィット体積変化期間の終了までに発生した変更です：。最低fit_ERRはこれらの試みの間、ブルーボックスを求めるべきであるプロトプラスト表面積の相対的な変化である。セルの初期サイズは、プロトプラスト基底輪郭領域の平均値から導出「半径」によって与えられる。
図7：葉肉プロトプラストのエピ蛍光顕微鏡ビュー GFP、（A）と、PEG変換後送信された白色光と、（B）の下で488nmの励起および520nmの発光時。スケールバー：100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8：。体積変化と抽出された浸透水透過性、低張性チャレンジに曝露されると腫れプロトプラストのP fは 、（A）の時間経過（60秒）（平均±SE）、（B）の間に浴中の計算された浸透圧濃度を。低張挑戦。低張液の流れが15秒でスイッチを入れたが、それは後にのみ、お風呂に達したことに注意してくださいここで5.9秒の遅れ、（C）P F（平均±SE）。アスタリスクは、コントロール（P≤0.05）からの有意差を示す。 n個のプロトプラストの合計で各治療のために少なくとも3つの独立した実験からのデータ（コントロール：N = 52、AtPIP2; 1：N = 13、ZmPIP1; 2：N = 28、ZmPIP2; 4：N = 34）。
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Discussion
ここで説明すると、他の球状の細胞にも原理的に適用可能な単離された植物プロトプラストのP fを 、 例えば 、カエル卵母細胞11を測定するための簡単かつ非常に効率的な手順です。この方法は、細胞への浸透性投与に応答して、P fは測定することに基づいている。このアプローチに基づく他の方法とは対照的に、しかし、浸透圧モル濃度の溶液の変化、 すなわち 、ベースライン細胞体積がである、等張溶液から始まる、一定浴灌流の間、瞬間が、緩やかではない確立された。さらに、この方法は、吸引ピペットを伴わないので、プロトプラストへの妨害を最小限にする。
ここで紹介するアプローチは、異なる植物または組織から、プロトプラストの多様からの測定を可能にします。しかし、計算を伴うための、唯一の球状の細胞を分析することができる。番目のも、酵素の単離Eプロトプラストとソリューションの浸透圧は、アッセイ細胞（例えば、トマトの葉肉プロトプラストの酵素の分離がかなり長くシロイヌナズナプロトプラストの場合よりも、時間ほどかかります）に調整される必要がある。
提示されたプロトコルに従ってシロイヌナズナ葉肉プロトプラストの単離は、プロトプラストの高い数を得、簡単、迅速かつ効率的である。注目すべきことに、これは、それらの低い基底P fのレベルとその高い形質転換効率（ 図8）と組み合わせ、異なるAQPアイソフォームによって誘導された、P fの定量的な比較を可能にするために、それらAQPsの機能発現のための魅力的なシステムになります。 （GFPなど）マーカー遺伝子を有するこれらのプロトプラストにおけるAQPsを表現するとき、人は簡単に解析するために、細胞を蛍光ための実験室でのプロトプラストをスクリーニングすることができる。
これは、システムが実行可能なalternativであるかどうかを確認することは価値があるでも、動物供給源からAQPsをアッセイするための卵母細胞への電子（機能性動物タンパク質は、植物細胞中で発現させることができることを既に17実証されている）。
P Fフィットプログラムを使用して、さらに2つのパラメータが、P fの横に、低張課題へのプロトプラスト応答の説明については、得られる：ディレイ、体積変化の発症や入浴灌流の開始までの時間、およびスロープPfと 、 （11号に詳細に記載）、浸透チャレンジの間にP fの変化率。
ボリュームフィッティング手順を設定し、各実験データについては、最終的に最も低い誤差とフィットを選択すること、これらのパラメータに異なる開始（初期）値を供給すること、複数回行う必要がある。このエラー最小化プロセスは、人間の中で、深さの異なる谷の風景の中に最も深い谷（「グローバル最小値」）を探しているとして描かすることができたyの丘、むしろ浅い谷（「極小値」）でキャッチすることはできませ試みる。
P fの二つのタイプの低浸透腫脹応答（ '初期F P'）の先頭にF、Pを取得し、腫脹の15秒の最後に計算されたP F、の最後から数えている 遅延（「P fを Fi の NAL '）。両者の違いはMoshelion らによって十分に議論されている。11、分析し6のモデルに関して。
プロトコルにおける2つの重要なステップがあります。まず、インジケーター色素濃度、腫脹、細胞の体積の時間的経過に第二、良いフィットの時間経過に良いフィット。
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Acknowledgments
この作品は、イスラエル科学財団エルサレム（から、FCへの研究（FNRS）C科学的ベルギー国民基金、大学間アトラクション極プログラム - ベルギー科学政策と「RecherchesConcertéesデCommunautéフランセーズデベルギー·アクション」からの補助金によってサポートされていましたMM（助成番号1311から1312）にISF）、およびNM（助成番号1312から1312）へ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
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