Summary
Hücrelerin ozmotik su geçirgenliği katsayısı (P f) Ölçme aquaporins düzenleyici mekanizmaları (AQPs) anlamanıza yardımcı olabilir. Burada yer küresel bitki hücresi protoplastlarının P ön tespiti protoplast izolasyon ve sürekli Banyo perfüzyonu sırasında bir ozmotik meydan okuma sonucu olan hacim değişim başlangıç hızının sayısal analizini içerir.
Abstract
AQP düzenleme mekanizmaları incelenmesi hücresel ve tüm bitki düzeyde hem de su ilişkileri anlamak için önemlidir. Ozmotik su geçirgenlik katsayısı, bitki protoplastlarına (P f) örneğin kurbağa oositlerine gibi küresel hücrelerin de ilke olarak uygulanabilir belirlenmesi için basit ve çok etkili bir yöntemdir burada sunulmuştur. Deneyin birinci aşaması, uygun bir izotonik çözelti ile bir bölme içine enzimatik sindirme ile ilgi konusu bitki dokusundan protoplastların izolasyondur. İkinci aşama, bir ozmotik meydan deneyi oluşur: bölmenin altındaki hareketsiz protoplastlar hipotonik bir solüsyon ile bir izotonik çözelti ile sürekli bir başlangıç perfüzyon sunulmuş ve izlenmektedir. Hücre şişmesi video kaydedildi. Üçüncü aşamada, görsel birim değişikliklere yol isimli işlenir ve hacim değişikliklerini gösteren zaman süreci osmola değişimin zaman seyri ile ilişkilidiroda perfüzyon ortamının lik P f vermek üzere, Matlab ('PfFit') yazılmış bir eğri uydurma bir prosedür kullanma.
Introduction
Hücresel zarların arasında su alımı ve akış hücresel ve tüm bitki düzeyde hem de bitki varlığı için temel bir gerekliliktir. Hücresel düzeyde, aquaporinler (AQPs) hücre membranı 1-3 ozmotik su geçirgenlik katsayısı (P f) düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.
Bugüne kadar, çeşitli yöntemler farklı bitki organlardan Protoplastın endojen P f ölçüm istihdam edilmiştir (yani kökleri, mezofil, endodermis, vb., Chaumont'dan ve ark. 4 tarafından incelenmiştir). P f ölçmek için yaklaşımlardan biri ozmotik bir meydan protoplastlarını maruz ve hacmi değişim başlangıç hızını izlemek için (yani., Hacim değişimi erken doğrusal faz eğimi). İki farklı yöntemleri daha önce çözümlerin bir anlık değişimi bu yaklaşıma dayanarak tarif, hem esas alınmıştır. Birincisi Hareketsizleştirme oluşmaktadırbir emme mikropipet ile protoplast ing ve çözelti akışını 5 ve bir mikropipet 6 kullanarak bir çözümden protoplast aktarılması ikinci bir anahtarlama. Hızlı çözüm döviz çok başında görüntü toplama izin bu mikropipet emme ve mikropipet aktarılması yöntemleri, büyük olasılıkla protoplastlannda fiziksel stres içeren, (hacim değişim erken doğrusal faz yakalamak için) ve özel ekipman ve uzman Mikromanipülasyondan gerektirir.
Burada tarif edildiği gibi bir yöntem içerir Mikromanipülasyondan ve banyo perfüzyon anlık değilken p f türetilmesini izin verir hücrelere bozulmasını minimuma indirmesidir.
Enzimatik sindirimden sonra bir izotonik çözelti içinde suya batırılmış olan protoplastlar, yük etkileşimi ile lamel cam bir pleksiglas tabanı (aka Lucite veya pleksiglas) bölmesi üzerinde immobilize edilir. Daha sonra, sabit bir Banyo perfüzyonu esnasında,izotonik çözelti, protoplastlar için hypoosmotic talebin oluşturulması hipotonik bir solüsyon ile uzağa akıtılmaktadır. Protoplastın şişme video çekilir ve daha sonra, banyo perfüzyon bir zaman süreci ve hücre şişmesi zamanla ilgili enformasyonun birleştirilmesiyle, P f görüntü işleme ve eğri uydurma prosedürleriyle belirlenebilir olmasıdır.
Bu yöntemin avantajı, deney çok etkili olduğunu olan tek bir analizinde aynı anda birkaç hücre kontrol etmek mümkündür, ve özel ekipman veya belirli bir mikro manipülasyon beceri gerektirmez dikkat edilmelidir. Bu yöntem için çeşitli uygulamalar mümkündür. Örneğin, mezofil gibi farklı dokular ve bitkiler, bir hücre çeşitli doğal p f belirlenmesi ve Arabidopsis yaprağı 7, mısır yaprak mezofil veya kök korteks hücreler 8-10 ya da süspansiyonunda kültürlenmiş hücrelerden 11,12 ikinci kılıf hücreleri ile birlikte gelmektedir. Additi içinde, bir oosit bu hücreler 11 olarak küresel hayvan hücrelerinin P f belirlemek mümkündür. P f katkıları ve belirlenmesi; başka bir örnek protoplastlarında (örneğin Kinazlann genler veya herhangi diğer genlerin onları etkileyebilir) kendi geninin geçici ifade ile AQP faaliyet incelenmesini içermektedir; 2 PEG dönüşüm ve kararlılıkla SlTIP2 tarafından Arabidopsis'teki mezofıl protoplastlarında,, örneğin, domates AQP SlTIP2 ifadesi için 13 f P 2-ilişkili. Son olarak, (gibi ilaçlar, hormonlar,) farklı molekül / maddelerin P f üzerindeki etkisinin incelenmesi de AQP engelleyici HgCl 2 7 örneğin, incelenebilir çözeltilerine ilave edildi.
Aşağıdaki protokol, Arabidopsis mezofil hücreleri ve bunların p f belirlenmesi protoplastların izole edilmesini tarif etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çözümleri 1. Hazırlık
- Hazırlama izotonik (600 mOsm) ve hipotonik 10 mM KCI, 1 mM CaCI2, ve ihtiva eden (500 mOsm) çözeltiler 8 M 2-(N-morfolin) -ethanesulphonic asit (MES), pH 5.7 ve uygun miktarda ozmolaritenin ayarlanması D-sorbitol: izotonik ve hipotonik çözüm için 440 mM 540 mM. Bir osmometre kullanılarak (veya hedef değerinin% 3 olan), solüsyonun osmolaritesini edin.
- Aşağıdaki enzimleri içeren "enzimatik kaynaşması bir kuru stok hazırlayın: 0.55 g, selülaz 0.1 gr pektoliyazdır 0.33 g polivinilpirolidon K 30, 0.33 gr, BSA (bakınız Tablo 1, aşağıda) vorteksle kuru toz karışımı, 5.7 mg alikotları olun ve -20 ° C'de saklayın.
Arabidopsis Mezofil protoplastlan 2. izolasyonu
- Yaklaşık 6 damla bir petri kabının (10 cm) hazırlanması (yakl. 30 ul her biri) izotonik çözeltisi.
- Peel abaxial (alt) Arabidopsis yaprak epidermis, cdaha sonra çözeltinin temas aşağı açıktaki yüzü alt yüzey damla izotonik çözelti üzerine yerleştirin kareleri, yaklaşık 4 x 4 mm 2 kareler halinde soyulmuş yaprak ut.
- , 165 ul, 1.5 ml bir tüp içinde izotonik çözeltisi (ağ / ağ% 3.3) enzim karışımı 5.7 mg çözülür çözülene kadar bir dakika kadar pipetleme yavaşça karıştırın ve aynı Petri enzimatik solüsyonun bir kaç benzer damla yerleştirmek çanak.
- , 28 ° C'ye ayarlanmış bir su banyosu içinde çanak yüzen parafilm bir yuvarlak conta kapağı çanak kapatın ve 20 dakika boyunca inkübe damla enzimatik solüsyon üzerine yaprak parçaları aktarın.
- Çanak izotonik çözeltinin daha birkaç damla (her bir enzim çözeltisi damla başına 2 damla) ekleyin. Yeni bir izotonik çözelti damla Her bir yaprak parçası aktarın, sonra art arda ikinci bir damla (uzakta enzimatik solüsyon yıkamak). , Forseps kullanarak kenarından parça kaldırın o protoplastlarını serbest bırakmak için (bir çay poşeti gibi), ikinci açılan sallayın.1.5 ml tüp içine (bir kırpılır 100 ul pipet kullanarak) protoplastların ile damla toplamak.
3. Hipotonik Mücadelesi Tahlili: Arabidopsis Mezofil Hücre şişmesi
- Hipotonik çözelti ile izotonik çözeltisi ve bir sütun ile bir sütun doldurarak perfüzyon sistemi (Şekil 1A) hazırlayın. Aşağı emme manifoldu (Şekil 1B) için boruya tüm yol doldurmak için bazı çözüm akışını (ilk hipotonik, daha sonra izotonik), vanayı açalım. Sıkışmış hava kabarcıkları vardır emin olun, ve sonra vanayı kapatın.
- (, Aynı zamanda Şekil 1C'de bölmenin şema Şekil 1B) pleksiglas slayt içinde odacık için bir alt yapmak için, silikon yağı (Tablo 1) ile, bir lamel Seal. Protoplastlar kat için "yapışkan" (gres halka içinde lamel yukarı bakacak açıkta kalan yüzeyini) odasının altını yapmak için buya da poli-L-lisin (su içinde% 0.1 Tablo 1), pozitif yük taşıyan protamin sülfat (Tablo 1 su içinde% 1). 2 dakika yıkayın 3 - 1 - beklemek, bir pipet kullanarak lamel boyunca bu 'tutkal' Spread 4 kez izotonik solüsyonu ile ve kalan çözümü uzakta sallayın.
- Izotonik solüsyonu ile odası kadar doldurun. Daha sonra, kırpılıp pipet kullanarak, bölmeye çözeltisi içeren bir protoplast damla ekleyin ve 3 bekleyin - protoplastlar yerleşmek için 4 dak. Şeffaf kapak (Şekil 1D, 1E) ile odasını (altında hava kabarcığı önlemek) çözelti yüzeyine dokunmadan örtün.
- (Hızlı oranları, bir mikroskop masaya (! Hafifçe) slayt yerleştirin perfüzyon sistemi ve (tüp! Hava kabarcıkları karşı koruma) pompaya bağlamak ve 1 ml / dakika sabit perfüzyon için izotonik çözelti akışına açmak 4 ml / dakika) kadar kullanılabilir.
- Kayıt içinhacim değişiklikleri, bir inverted mikroskop ile bir 20x objektif ve bir bilgisayar bilgisayara bağlı bir CCD video kamera ile birlikte kullanılır. Seçilen hareketsiz protoplasmalar 60 saniye video film kaydetmek için ImageJ yazılım 'CMU 1394 Camera Driver' eklentisi (bu iki yazılım adet indirme adresleri için özel Malzemelerin Tabloya bakınız) kullanın (muhtemelen, altına sıkışmış olanlar) 1 resim / sn (1 Hz) hızında. Izotonik çözeltinin 15 saniye yıkama ile Kaydı (bu taban çizgisini teşkil) başlatın 45 saniye boyunca hipotonik bir solüsyon geçmek (perfüzyonun başlamasından itibaren toplam 60 saniye tamamlamak için). TIF formatında film kaydedebilirsiniz. Not: yani en büyük çevre uzunluğu (Şekil 2A) ile şekli ve iyi odaklanmış hücre konturuna sahip küresel: aşağıdaki kriterleri yerine mümkün olduğunca çok sayıda hücreleri ile bir görünüm alanı seçin.
ImageJ Kullanarak Hücre Hacmi Değişim 4. Analizi
NOT: analiz etmekBir şişme hücrenin görüntülerin dizi, 'Image Explorer' ve (Xavier DRAYE tarafından yazılmış) ImageJ yazılım 14 'Asal Analyzer' eklentileri kullanabilirsiniz. Ilk zaman noktasında seçilmiş protoplastları ile başlayarak, 'protoplast Analyzer' eklentisi otomatik protoplastlar kenarları (kontür) algılar ve (eklentileri altında PfFit analiz programı ile kullanılabilir), deney sırasında alanlarında zaman sürecini hesaplamak .
- ImageJ başlatın. Onlar açılmak gibi filmi açmak için, açılan menüleri ard arda, sonra, ImageJ panelde 'Dosya' tıklatın: 'Al' ardından 'Image Explorer'. Seçilen filmi vurgulayın, daha sonra üzerine sağ tıklayın, ardından 'Asal Analyzer' üzerine tıklayın bıraktı. Deney sırasında büyük ölçüde hareketsiz kalır protoplastlarını tanımlamak için (protoplast görüntü altındaki kaydırıcıyı kullanarak) film göz atın - bu analiz edilecektir. Geri ilk ima üzerindege, fareyi kullanarak, daha sonra ortaya çıkan 'Algılama parametrelerinin' tablosunda 'Tamam' ı tıklatın, seçili protoplastların (Şekil 2B) etrafında (ImageJ çizim araçları aldım) daireler çizin.
- Protoplast algılama algoritması başlatmak için, açılır menüden sonra, protoplast görüntü üst panelde 'Süreci' Yerel 'tıklayın. Film boyunca seçilen protoplastlarının (Şekil 2C) etrafında yeşil daireler inceleyin. Bir Excel dosyası 'Sonuç' kaydedin. ImageJ çıkın. NOT: Bir kırmızı nokta belirir durumda (kötü bir kontur uyum göstermek için - genellikle nedeniyle kötü bir görüntü kontrast) farklı parametreler ile yeniden.
- Her bir hücreye ait satırları ayırmak için (- İki veya daha fazla hücre eş zamanlı analiz edildi - eğer analiz çerçeve çerçeve yapılır, çünkü iç içe olacak), Excel, hücre sayısı sütunu ('nesne' tarafından kaydedilen verileri sıralamak ).
- DETE içinP f gerçek değeri elde etmek için piksel-um dönüşüm faktörü rmine aynı 20X mikroskop objektif ile bir mikrometre hükümdarın bir görüntü oturtun. Cetvel görüntüsü boyunca (ImageJ çizim araçları aldım) bir çizgi sürükleyin ve ImageJ Ana panelin altındaki cetvel uzunluğu piksel sayısı eşdeğer okuyun. Um 2 içine Excel dosyasındaki keyfi piksel alanı değerleri dönüştürmek. Bir metin dosyası olarak (her hücre için ayrı ayrı) (sayıların iki sütun yalnızca) alanlar zaman ders kaydedin. NOT: Bu birim-uydurma 'PfFit' programına bir giriş olacaktır.
5. ImageJ ve Matlab Programı P f Fit kullanarak Deneysel Odası'nda Ozmolarite Değişim Oranı Modelleme
- Izotonik çözeltisi ('endikatörü bir boya' üretmek için) 100 ml iksilen siyanol, 2 mg (Tablo 1, aşağıda) ekleyin.
- Gösterge Boya ve olmayan boyalı h (3.1 gibi) perfüzyon sistemi hazırlayınypotonic çözeltisi.
- Bir kayar kapak (daha önce olduğu gibi asal hücreler) ile örtün ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin, yavaşça bir işaret boya ile odacığını doldurmak, Pleksiglas odasının tabanına silikon yağı ile bir kapak kayma Seal.
- Perfüzyon sistemine ve pompa odasına bağlayın ve L. ml / dakika bir sabit perfüzyon için bir işaret boya akışını açın.
- 1 Hz hızında 60 saniye filmi kaydedin. Gösterge Dye 15 sn Kaydı başlatmak, 45 saniye boyunca hipotonik çözüm geçmek. Filme durdurun. Gösterge Dye (en az 30 saniye boyunca) ile aynı hizada, daha sonra yeni bir film başlar. 6 kez ve tüm filmleri kaydetmek - yaklaşık 5 tekrarlayın
- Değişen geçirgenliği bir ortalama zaman ders almak için Gösterge Boya geçirgenliği video görüntülerini analiz etmek ImageJ yazılımını kullanın.
- ImageJ başlayın, 'Dosya', ardından 'Aç' düğmesine tıklayın ve film için göz atın. Her film için, 10 piksel genişliğinde dikey çizinFilmin 1. görüntü üzerinde herhangi bir yere dikdörtgen. Sonra açılır menüsünde 'Crop' tıklayın, ImageJ ana panelde 'Image' tıklayın.
- 'Montage olun' Yığınlar 've (sütunlar 60, satırlar 1): onlar açılmak gibi yine' Image 'tıklayın, bir satır (60 sn film) 60 kare hizalamak için, ardından açılan menülerde arka arkaya tıklayın. Her yerde görüntülerin bütün satır boyunca 1 piksel yüksekliğinde yatay dikdörtgen çizin ve ImageJ ana panelde 'Analiz' ı tıklatın, sonra açılır menüden 'komplo profili' ı tıklatın. NOT: (gösterilmemiştir) görünecektir pencerede A 'Montage Plot', ve geçirgenlik verileriyle bir liste onun menüden açılabilir. Filmin her görüntü onun 10 piksel genişliğinde dikdörtgen ve dolayısıyla "zaman tabanı" menşeli 10 geçirgenlik değerleri ile bu listede temsil edilir (görüntü ardışık sayı) 10 kat daha uzundur.
- Geçirgenliği dat listelerini kopyalayınBir Excel dosyasına (film başına bir liste). Gösterge Boya sürgünlerinin çeşitli filmlerde elde geçirgenliği zamanlı kurslar ortalama. 0.1 ile görüntü sıralı sayısı çarpılarak gerçek zamanlı tabanı oluşturmak. Bir metin dosyasına ortalama zaman ders (iki sütun) kaydedin. NOT: Ortalamanın önce, eğer istenirse, herhangi bir usulsüzlük reddetmek, bireysel zamanlı kurslar arsa. Film Gösterge Dye kararlı durum geçirgenliği en az 5 Final sn de içerir emin olun.
- Ozmolaritenin zaman dersin çeşitli parametreleri hesaplamak için Matlab uydurma programı P f Fit ('Gösterge Oturan' paneli, Şekil 3) başlatın. Not: banyosunda çözeltinin bilinen ilk ve son yoğunluklara dayanan, çözeltinin ozmotik değişen konsantrasyon zaman süreci varsayılarak, (Gösterge Boya geçirgenliğinden, sırayla, hesaplanan) konsantrasyon zaman süresi hesaplanır aynı dinamikleri izlerboya konsantrasyonu. P f Fit ücretsiz olarak kullanabilecekleri bir programdır. P f Fit programı ile kullanıcıya tanıtmak için yardımcı bir Ek dosyası olarak vallahi erişilebilir detaylı açıklamalar ve tanımlar P f Fit Kullanım Kılavuzu ':' PfFit_Installer_web.exe 'dan indirebilirsiniz.
- 'Gösterge Oturan' panelinde, Gösterge Boya geçirgenliği ('Gösterge veri dosyası', Şekil 3A) ortalama süre dersin veri almak ve elle mevcut deney parametreleri ve parametrelerin genişliği 've' ilk tahminler takın t_half Gösterge Boya konsantrasyonunun zamanlı kurslar araziler (gerçek veri ve formda Şekil 4A) görüntülemek için Çalıştır 'Gösterge Boya konsantrasyonu (Şekil 3B zaman sürecini anlatan. Click' ve modellenmiş (hesaplanan) banyo ozmolaritenin (Şekil 4B) NOT:. agVerilere ood uygun esastır (bir öneri: Şekil 3'te gösterilen değerlerle başlatın).
6. Matlab Montaj Program P f Fit kullanarak P f Belirlenmesi
NOT: Bir doğru ve mükemmel osmometresi 11 gibi bir Protoplastın davranışı ile ilgili temel varsayımlara ilave olarak, P f belirlenmesi P f P f bu dinamikleri zaman altında yatan neden olduğunu, zamanla değişebileceğini karinesine dayanır hücre hacmi değişim seyri ve bu üç parametre bunu açıklamak için yeterli: P fi (P f başlangıç değeri), Eğim Pf (P f doğrusal değişim oranı) ve Delay (banyo baştan dönemi Hücre hacminin değişim başlamasından itibaren osmolarite fark). Farklı modeller null değerleri 11 dahil olmak üzere farklı bu parametrelerin kombinasyonları ve bunların değerleri, dahil, test edilebilir. P
- 'Ses Fit' paneli (Şekil 5) geçin. Ithalat için alanları veri dosyasını (analiz protoplastlarının, Şekil 5A bir 'alanlar' zamanı ders ile metin dosyası) seçin. Parametresi kaynak olarak 'Son Göstergesi Uydurma' seçin (Şekil 5B; alternatifler için 'P f Fit Kullanım Kılavuzu' bakınız). NOT: Bu parametreler (Şekil 5D) ve sonra prosedür montaj hacimleri için banyo ozmotikum değişim yeniden oluşturmak için kullanılır.
- 'Ses Fit' paneli (Şekil 5C) olarak, başlatılamadı (için ilk tahminler) P f parametreleri doldurmak: P f Eğim Pf ve Gecikme (bir öneri:, modeli 'Sınıf' Seçti sırasıyla 1, 1, ve 30,) ile başlar (bir öneri: II ve işareti ile başlayın her üç parametre için 'çek') takılacaktır. Daha sonra ara rakam (Şekil 5E) küresi ve gerekirse Gecikme parametre ve kayıt uzunluğunu ayarlamak, 'Run' tıklayın.
- Uyum kalitesini değerlendirmek ve uygun hatayı kaydetmek için sonuçlar grafiği (Şekil 6) inceleyin. Birkaç her kat başlatılırken parametrelerini değiştirmek ve '-'Run yeniden. NOT: Program takılıyor zaman cesaretini etmeyin - sadece programı yeniden başlatın!
- Uyum hata en düşük değer amaçlayan, başlatma parametrelerinin farklı kombinasyonları ile başlayan, bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.
- Ekrandan doğrudan uyum sonuçlarının listesini kopyalayın, ya da t onları bulmako _FIT_Vol_Results.txt 'dosyası oluşturulan PfFit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklı AQPs aktivitesini P f belirlenmesi ve karşılaştırılması amacıyla, Arabidopsis yaprağı mezofil protoplastlar kullanılırlar. Bu protoplastlar düşük bazal (temel) p f seviyeleri 7 sahip oldukları bulunmuştur ve yeniden üretilebilir bir p f ölçümleri etkinleştirmek için bir fonksiyon-ekspresyon sistemi olarak hizmet verebilir.
6 haftalık Arabidopsis olgun bir bitki yapraktan Asal hücreler izole edilmiştir ve üç gen Arabidopsis AQP genleri ile inşa (AtPIP2: 1) ve mısır (ZmPIP1 2 ve ZmPIP2 4) (ayrı ayrı) geçici olan PEG dönüşümü ile ifade yöntemi 15. Senkronize için bir dönüşüm etkinliği bildirilmiştir bir hücrede iki plazmid geçici ekspresyon için diğer bitki sistemlerinde daha önce% 100 başarı oranı göstermiştir sonuçlarına doğası ne olursa olsun hücreye uygulanır bazlı plazmid çok sayıda eş zamanlı olduğu varsayılarak15,16, bunlar, dönüştürülmüş bir protoplast (Şekil 7) etiketlemek için gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) kodlayan bir vektör ile birlikte transforme edilmiştir.
P f tahlilleri için, asal hücreler deney odası (Şekil 1B) yerleştirilirler ve izotonik solüsyonu (600 mOsm), daha sonra hipotonik çözelti ile (500 mOsm) ile yıkanmış, başlangıçta ise protoplast GFP etiketli video tarafından takip edildi, perfüzyon sistemi (Şekil 1 A) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Ilk olarak, 'Resim Explorer' ve 'protoplast Analyzer' eklentisi hücre dış alanındaki değişikliklerin zaman sürecini üretilmesi için kullanılmıştır (Şekil: hücre hacim değişikliklerini gösteren (Şekil 8A) zaman süreçleri iki aşamada, her bir hücre için elde edilmiştir 2), daha sonra Matlab uydurma programı P f Fit (Şekil 5) thes almak için kullanılanE alanları ve hücre hacimleri çevirebiliriz. P F değerleri (Şekil 8C) Göstergesi geçirgenliği değişir içe ortalama zaman içindeki seyrine, ilave olarak, hücre hacimleri zaman içindeki seyrine bağlı olarak P ön Uygun programı kullanarak her bir hücre (Şekil 5) için türetilen edildi ve Boya (Şekil 3), gösterge boya konsantrasyon değişikliği zaman süreci ile dönüştürüldü Daha sonra (Şekil 4A) ve - banyo osmolarite değişim (Şekiller 4B, 6A ve 8B) 'nin zaman süreci için. Bu delC, hücre (Cin) ozmotik konsantrasyonlarda fark banyo (Cout), yani. Yılında, su akını için itici güç, neredeyse sadece cout değişikliği (Şekil 6A nedeniyle olduğunu fazlalaştı ). Bu deneyde P f tahlilinde (Şekil 6B) boyunca arttı.
P f (Şekil 8C) ile dönüştürülmüş kontrol hücrenin P f göre anlamlı olarak yüksektir.
Şekil 1: hacim tahlil sistemi. (A) Deneysel düzenek: Perfüzyon sistemi çözeltisi hazneleri içerir (infüzyon kolonlar, 'Sütunlar') mikroskop masada ayarlamak pleksiglas sürgüye bağlı olan hortum (T), vanalar (V) ve bir peristaltik pompa (P). HS = hipotonik çözelti, izotonik solüsyon, Cm makinesi. (B) Deney bölmesi (CHR) ve bir giriş (in) manifoldu yoluyla bağlı olan boru ile pleksiglas sürgünün bir büyütülmüş görünüşüdür. Çözelti, pompa bir çıkış (Out) yoluyla odacık emilir. (C) bölgesinin şematik bir çizimi pleksiglas slayt (saat yönünün: üstten görünüm, uzun yan görünüm ve kısa-yan görünüm): a = cam kapak kayma, merkez hücresi alt; B = berrak bir yapışkan bant (Tablo 1), ve merkezi bölmenin önde gelen giriş ve çıkış kanalları için çözelti, bir taban olarak işlev gören; Scotch bant (sadece bazen) değiştirildiğinde, bir delik odasının altında o kesilir; c slayta yapıştırılmış bir pleksiglas blok =; d bir çıkış konektörü delik =. Sayılar mm (ancak çekme ölçekli değildir). (D) kısmen bir merkezi bölme (oklar) kaplama (aynı zamanda pleksiglas) şeffaf bir kapak ile sürgünün orta kısmının büyütülmüş görünüşüdür. (E) şematik çizimi (üst ve yan görünümleri) şeffaf kapağı. Şeffaf kapak sapı (D yeşil plastik) boyutu keyfidir. Diğer ayrıntılar C. gibidir
2 / 51652fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 2: 'Asal Analyzer' eklentisi kullanarak Protoplastlar görüntüleri şişme analizi. Kontür son görüntü kadar ilk gelen, c autodetected önce (A), bir olarak protoplastlarında, b, ile filmin ilk görüntü, ancak sarı daireler, film inceledikten sonra yapılan seçimi göstermek yeşil çevrelerinde sıkıca analizi geçiren "uslu" protoplastların hatlarını izleyin. (B) Piksel kare Alanı ',' protoplast çizgileri içindeki hesaplanan alanların ((apsis görüntü sayısının birimleri ile) Time' ders araziler ' ), her izlenen (ve numaralı) protoplasttan için. (C) 'Protoplast analizörlerindeki' eklentisi parametreler giriş paneli. Dört 'saptama parametreleri' ince ayar protoplast algılama algoritması için ayarlanabilir. Sınır piksel 'sayısı 'Parametresi protoplast kontur kalınlığı en az ayarlar (varsayılan değer: 5). 'Nispi ağırlığı' parametresi iç protoplast alan ve dış sınırı arasındaki gri seviye eşik farkı (varsayılan: 2) etkiler. 'Maksimum çevresi oran' kendi şekil bir daire saptığında zaman protoplastlarını hariç için bir eşik tanımlar. Bu parametre, protoplast ile aynı alanı (: 1.05 varsayılan) ve mükemmel bir dairenin çevresi protoplast çevresinin oranıdır. 'Maksimum alanı artışı' parametresi (zaman adımı başına% artış) parametre değeri üzerinde kontür alanı artar (:% 5 varsayılan değer) ile protoplastlarını dışlar. Son olarak, eklenti, aynı zamanda küçük protoplastlardan hareketleri kolları ama hızlı hareket veya görüntü alanından kaybolur protoplastlarını izleme duracaktır. Film gibi gerektiği kadar yeniden edilebilir ve tek bir protoplastlardan ayrı reanalyzed edilebilir.com / files / ftp_upload / 51652 / 51652fig2highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: P f Fit programının 'Gösterge Oturan' paneli. Bu bölüm banyo ozmolaritesi zamanla içine göstergesi geçirgenliği zaman ders çevirir. (A) Gösterge Dye geçirgenliği değişikliklerin zaman ders içeren kaydedilmiş veri dosyası için göz. (B) Ya değişkenler ve parametreleri önceden kaydedilmiş listesini kullanın veya Mevcut deney elle 5 değişken değerlerinin girilmesi 'true_C_init' ve 'true_C_end' (ilk banyo çözeltisi ve banyosu ile perfüze P ön -testi ile ölçüldü çözeltinin osmolarities) 't_start_wash'(Ilk gösterge Boya seviyede başlangıç örnekleme süresi)' threshold_% '(program otomatik olarak başlangıç geçirgenliğinden dönüş tespit eden bir başlangıç değerinin%, 1-5%, genellikle en etkilidir)' N_steady_st_pts '(numune sayısı - alınan her bir işaret boya resmi temsil eden örnekler ile 10 - Gösterge Boya uç kararlı durum seviyesinde ortalama edilecek ozmotikum konsantrasyonuna işaret boya konsantrasyonunun dönüşümü için çok önemlidir) ve ilk iki tahminler Gösterge Boya geçirgenliği Sigmoidal zaman tabii dört parametre, width ve t yarısı (Kabaca sigmoid geçiş kısmının süresi ile ilişkili, ve, sırası ile, orta kadar; t yarısı negatif olabilir!). Width t yarısına ilaveten iki en uygun parametreleri, başlangıç tahmininden için gerek kalmadan elde edilmektedires: osmolarite zaman süresi açıklama (Ek P görmek için fiziksel bir anlam olmaksızın gecikme ('flush_lag'), banyo çözeltisinin varış valf açıklığı arasındaki süre ve 'C_init', ancak gerekli f Fit Kullanıcı Kılavuzu.
Şekil 4:. Banyosunda Gösterge Boya konsantrasyonu ve ortam ozmolaritesi (A), gösterge boya konsantrasyonunun zaman süreci, verileri (nokta) ile irtibata hesaplanır ve yıkanır olarak en uygun parametreler (satır) uzakta Gösterge Boya konsantrasyonu değişikliği ile aynı dinamikleri takip varsayarak olmayan bir çözelti boyalı. (B), banyo çözeltisinin ozmolaritesi değişim hesaplanan zaman süreci ile.
Şekil 5:. P f Fit programının 'Cilt Fit' paneli (A) analiz Protoplastın bölgesi zaman ders veri dosyası için göz (B) 'Uydurma Son Göstergesi' seçin seçeneğini gelen deney parametreleri almak için. . 'Gösterge Fit' (alternatifler için Ek P f Fit Kullanım Kılavuzu'na bakın) (C) 'Modeli Türü' / 'Sınıf' ile son çalışma: Sınıf I basit modeli 1 içerir, Sınıf II - modeller 2-5, sınıf III - modeller 6 - 8. modeller parametreler sabit ve ayarlanabilir edilmektedir (. yani serbestçe değişken) montaj işlemi sırasında (o farklı izin kutuyu işaretleyin) ve 'olsun veya olmasın edildiği açısından farklılık SlopePf 've / veya' Gecikme 'null. Modls 1 -. 6 Moshelion ark 11 tarafından uzun uzadıya tartışılmıştır. 'Birleşmeleri', Model Tipi '/' Sınıf 'seçimi tarafından dikte parametre seçimleri listeler. Benzer bir uyum sonucu modelleri arasında - basit seçin! 'P f', 'Yamaç Pf' ('Slope_Pf') ve (aşağıda E 'Delay' hakkında daha fazla bilgi) gösterildiği gibi 'Delay' parametreleri başlatılamıyor. (D) değişkenleri ve değişen banyo ozmotikumdan zaman ders anlatan parametreler giriş vardır ya B. (E) Bir ara arsa anlatıldığı gibi elle ya da, hacim değişim zamanı elbette, 'Run' vurarak çağrılır (hesaplanan hücre dış alanlardan) 'Gecikme' parametresi, başlangıç değerinin seçiminde yardımcı olmak için. Tahmin, "(hücre hacmi arasındaki değişim başlamasından itibaren 1. noktasından, taban toplam uzunluğu ile eyeballingdahil gecikmesi: 't-start-yıkama +' lag '/' floş-lag '+ "fizyolojik"' gecikme ') toplamı. (Ayrıca Ek P f Fit Kullanım Kılavuzu'na bakın) yine 'VolumeFit' panelinde 'gecikme' ve 'Run' için bir giriş parametresi olarak bu değeri yerleştirin.
Şekil 6: uydurma sonuçları (A) "sahneleri" Behind: İki bölümlerinde Ozmotikum konsantrasyonlarının hesaplanan nihai zaman kurslar:. Banyo (Cout, yeşil hat) ve hücre (Cin, mavi çizgi; Cin olduğunu "Mükemmel ve gerçek Ozmometre" 11) ve bunların arasındaki farkın zaman süreci (delC - protoplast hacim değişikliğine ve plazma zar sadece su geçirgen bir varsayıma dayanarak hesaplanırSu akışı için itici güçtür, kırmızı çizgi), 'Eo-tLag' 'floş-lag' ve burada hipotonik meydan başlangıcında (yaklaşık 21 sn) sonunu. Kırmızı kutu: fit değerinin hatası (fit-ERR, aşağıda B tanımına bakın) (B) hacim zaman ders uydurma nihai sonucu;. Yeşil kutu: 'GİRİŞ DEĞIŞKENLERİ' (Şekil 5A efsane tanımlanan) P f Fit / 'VolumeFit' paneli yoluyla girilen değerlerdir. Kara kutu: 'exptl-Vol' ve 'takıldı-Vol' deneysel veriler ve en uygun parametreler kullanılarak hesaplanan hacmi, sırasıyla, 'Eo-tLag', 'Eo-Delay' işaretleri A aynıdır hacim değişim başlangıç. 'Temizlik Alanı 3%' yüzeyi zarar vermeden uzatmak için hücre zarı yeteneği,% 3 tahminlere payının artırılması hangi ses işaretler. 'Pf (ölçekli)' uydurma-ba zaman derssed 'P f span' olarak kırmızı kutunun aşağıda belirtilen değerleri kapsayan, P f hesaplanmıştır. Kırmızı kutu: en uygun parametrelerin değerleri 'UYAN PARAMETRELER' şunlardır: 'Pf i' (ilk P f), 'gecikme' hipotonik meydan başlangıcı ve hacim değişim başlangıcı arasındaki (dönemi (, Bu örnekte kullanılan modelin 5'e göre, aynı zamanda, P f değerinde bir değişiklik başlangıç) ve "eğim-P f P F değerindeki değişim (sabit oran 'fit_ERR' de gösterilmektedir. - Matlab uydurma prosedürün minimize hedef - "kök ortalama kare" sapma (yani, bir ortalama kare sapma kare kökü) taban hacminin% olarak sunulan siyah çizgi bir yeşil nokta), It. farklı parametre başlatma değerleri ile tekrar montaj görece başarı olduğuna karar verilirse bu değeri gereğidir. birDİKKAT NOT: en uygun parametre değerleri hata küçültme prosedürü bulunan bir yerel minimum sonucu olabilir gibi - küresel asgari bulundu doğrulamak için, birkaç deneme bu üç parametrenin için farklı başlatma değerleri ile gerekli (ve olan 'ort Volm%' göreceli hesaplanan protoplast hacim değişikliğinin kapsamı ve 'ort Alan%' dir: deltalarda takılan ses değiştirme dönemi sonunda yaşanan değişiklikler şunlardır:. düşük fit_ERR bu girişimleri sırasında Mavi kutuyu alınmalıdır protoplast yüzey alanının nispi değişimdir. Hücrenin başlangıç boyutu protoplast bazal kontur alanının ortalama değerinden türetilen 'yarıçapı' ile ifade edilir.
Şekil 7: mezofil protoplastların Epi-floresan mikroskop görüntüleri (B) GFP olan PEG değişim, (A) uygulanmıştır. Ölçek çubuğu:. 100 mikron bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8:. Hacim değişimi ile ekstre ozmotik su geçirgenliği, hipotonik mücadeleye maruz kaldığında şişme protoplast P f (a) zaman seyri (60 sn) (ortalama ± SE) (B) boyunca banyo hesaplanan ozmotikum konsantrasyonu. hipotonik meydan okuma. Hipotonik çözelti akışı 15 sn açık ise, sadece bir sonraki banyo ulaştığını dikkatBurada 5.9 sn. (C) P f lag (± SE) idi. Yıldız kontrolü (p ≤0.05) anlamlı farklılıklar göstermektedir. (:;: N = 13, ZmPIP1, 2, n = 28, ZmPIP2, 4, n = 34, n = 1 52, AtPIP2 kontrol), en az üç bağımsız n, protoplast füzyonu, toplam her bir muamele için deneylerden elde edilen bulgular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen başka bir küresel hücrelerin de, ilke olarak uygulanabilir izole bitki protoplast P, K, örn., Kurbağa oositlerine 11 ölçmek için basit ve çok etkili bir yöntemdir. Bu metot, hücredeki bir ozmotik teste karşı tepki olarak P f ölçülmesi esasına dayanır. Bu yaklaşıma göre, diğer yöntemlerin aksine, bununla birlikte, ozmolarite çözeltilerinin değişimi, yani, bazal hücre hacmi olan izotonik çözeltisi ile başlayarak sürekli Banyo perfüzyonu sırasında, anlık fakat kademeli değildir kurulmuştur. Buna ek olarak, bu yöntem, bir emme pipet yayılır ve bu nedenle protoplastlar için bozulmasını minimuma indirmesidir etmez.
Burada sunulan yaklaşım, farklı bitki ya da dokulardan protoplast çeşitli ölçümleri sağlar. Yine de, çünkü söz hesaplamalar sadece küresel hücreler analiz edilebilir. Th Ayrıca enzimatik yalıtımE protoplastlar ve çözeltilerin ozmolaritesi (örneğin, domates mezofil protoplastlannda enzimsel izolasyonu, Arabidopsis protoplastların durumunda önemli ölçüde daha uzun süre, yaklaşık bir saat sürer) tahlil hücrelere ayarlanması gerekir.
Sunulan protokol uyarınca Arabidopsis mezofil protoplastlannda izolasyonu protoplast yüksek sayıda, sonuçta, basit, hızlı ve etkilidir. Özellikle, bu, düşük bazal ön p seviyeleri ve yüksek transformasyon verimi (Şekil 8) ile birlikte, farklı bir AQP izoformları tarafından indüklenen p f kantitatif karşılaştırma sağlamak için, onları AQPs fonksiyonel ifadesi için çekici bir sistem sağlar. (GFP gibi) bir marker geni ile birlikte, bu protoplastlarda AQPs ifade edilirken, tek bir analiz hücreleri fluoresan için deney odası içindeki protoplast kolay taranabilir.
Bu sistem uygulanabilir bir alternativ olup olmadığını kontrol etmek için faydalıdırda hayvansal kaynaklardan AQPs test etmek için oosit e (fonksiyonel hayvansal proteinler, bitki hücrelerinde ifade edilebilir önce 17 gösterilmiştir).
P f Fit programı kullanılarak, iki parametre, P f yanında, hipotonik zorluklara protoplast yanıtların tanımı için elde edilir: gecikme, hacim değişim başlangıcı ve banyo perfüzyon başlangıç ve Yamaç Pf arasındaki süre, (11 detaylı olarak tarif edilmektedir) ozmotik cebine boyunca P f değişim oranı ölçülmüştür.
Ses uydurma yordamı ayarlamak Her deneysel veri sonunda en düşük hata ile uyum seçerek, bu parametreler için farklı başlangıç (başlatma) değerleri sağlayan, birkaç kez yapılması gerekmektedir. Bu hata minimizasyonu süreç adam arasında, farklı derinliklerde vadilerin bir manzara derin vadi ("küresel minimum") arayan olarak tasvir edilebiliry tepeler ve oldukça sığ vadi (bir "yerel minimum") yakalanmış değil çalışılıyor.
P f İki tip hypoosmotic çok başında P f ucundan sayarak, ('ilk f P') ve şişme 15 saniye sonunda hesaplanan f P şişme tepkisini, elde edilir gecikme ('P f fi nal'). Ikisi arasındaki fark Moshelion ve arkadaşları tarafından bir biçimde ele alınmaktadır. 11, analiz edilen 6 farklı model için gerekli görünmektedir.
Protokolde iki kritik adım vardır: ilk olarak, bir işaret boya konsantrasyonu, şişme hücrenin hacmi zamanla ikinci, iyi bir uyum zaman süreci için iyi bir uyum sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Araştırma (FNRS) c Scienti fi için Belçika Milli Fonundan hibe, İsrail Bilim Vakfı Kudüs FC Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar Programı-Belçikalı Bilim Politikası ve "Recherches Concertées de Communauté française de Belgique-Eylemleri", (tarafından desteklenen MM (Grant # 1311-1312) ISF) ve NM (Grant # 1312-1312) için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA? The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion? New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
