Summary
Æggestokkene cancercelleinvasion i mesothelial foring af bughinden er en dynamisk proces over tid. Ved hjælp af en realtid analysator, kan den invasive kapacitet kræft i æggestokkene celler i en kugleformet-mesothelial celle co-kultur model kvantificeres over længere tidsperioder, der giver indsigt i faktorer, der regulerer metastatisk proces.
Abstract
Ovariecancer metastaserer ved at udgyde i peritonealvæske og sprede til distale steder i bughinden. Monolagskulturer ikke nøjagtigt modellere adfærd af kræftceller i en nonadhærente miljø, som kræftceller sagens natur aggregere til flercellede strukturer, der bidrager til den metastatiske proces ved at knytte til og invaderer peritoneal foring til at danne sekundære tumorer. For at modellere denne vigtige fase af kræft i æggestokkene metastase, flercellede aggregater eller spheroids, kan genereres fra etablerede ovariekræft cellelinjer holdt under adhærerende forhold. At efterligne den peritoneale mikromiljø stødt af tumorceller in vivo blev en sfæroid-mesothelial co-kultur model, der som præformede sfæroider udplades på toppen af en human mesothelial cellemonolag, der er dannet i løbet af en ekstracellulær matrix barriere. Metoder blev derefter udviklet ved hjælp af en real-time celle analysator til at gennemføre kvantitativ realtidsmålinger af invasive kapacitet forskellige ovariecancer cellelinier som spheroids. Denne fremgangsmåde giver mulighed for kontinuerlig måling af invasion over lange perioder, som har flere fordele frem for traditionelle endpoint assays og mere omstændelig realtid mikroskopi billede analyser. Kort sagt, denne metode giver mulighed for en hurtig, bestemmelse af faktorer, der regulerer samspillet mellem kræft i æggestokkene kugleformede celler invaderer gennem mesothelial og matrix barrierer over tid.
Introduction
Kræft i æggestokkene har den højeste dødelighed af alle gynækologiske kræftformer 1. På verdensplan er der ~ 230.000 tilfælde og over 100.000 dødsfald som følge af sygdommen hvert år 1. De fleste patienter (> 75%) er diagnosticeret efter kræften allerede har spredt sig, når behandlingen kompliceres yderligere af øget resistens over for kemoterapi og prognosen er dårlig 2.. Patienter med stadium III-IV metastatisk sygdom har fem år overlevelsesraten for kun 30-40% 3. Således er der et presserende behov for en bedre forståelse af de cellulære adfærd underliggende kræft i æggestokkene metastaser for effektivt at behandle fremskreden sygdom.
Den nuværende model af kræft i æggestokkene metastaser foreslår flere trin i den metastatiske proces, som hver især forekommer i en særskilt mikromiljø som har indvirkning på tumor adfærd. Metastaserende kræft i æggestokkene celler indledningsvis er kastet fra den primære tumor og overleve i en nonadherent stat inden for peritonealvæske som enkelte celler eller tredimensionelle flercellede strukturer, kaldet flercellede aggregater eller sphæroider 2,4,5. Celler, der ikke udgør spheroids i suspension er mere modtagelige for anoikis 2,4,5. Spheroids også udviser øget resistens over for kemoterapi, der bidrager til residual sygdom og efterfølgende tilbagefald af kræft 2,4,5. Et andet afgørende skridt i kræft i æggestokkene metastaser er overgangen af aggregater fra fritflydende klynger til etablerede sekundære tumorer i bugvæggen og omentum 5,6. Celle-celle og celle-substrat interaktioner har været impliceret i samlet formation, overlevelse, og tilslutning til den ekstracellulære matrix (ECM) produceret af mesothelial foring af bughinden 4-11. Endnu er disse processer dårligt forstået.
For at definere de mekanismer, der er involveret i udbredelsen af kræft i æggestokkene, kan spheroids være genereltated fra etablerede cancer cellelinjer hjælp adhærente dyrkningsmetoder, vedligeholdelse celler i suspension ved at tilføje methylcellulose til dyrkningsmedier 12,13 eller ved dyrkning af celler på lav-fastgørelsesplader 2,14. Når dyrket på denne måde, ovariecancerceller samle ind multicellulære aggregater eller sfæroider, som udviser lignende cellulære, molekylære og biokemiske egenskaber til dem i tumor aggregater findes in vivo 2,14. Efter dannelse kan spheroids efterfølgende høstet fra nonadhærente medium og genudplades på en bred vifte af faste overflader for yderligere funktionelle studier. Dette er et fremskridt i løbet af analyser i monolagskultur, som ikke nøjagtigt modellere adfærd af kræft i æggestokkene celler metastaserende inden en nonadhærente miljø som intraperitoneal væske.
Den invasive kapacitet kræft spheroids kan vurderes i traditionelle endpoint assays i Boyden kamre 2 15,16; imidlertid analyse af tidsforskydningen data er tidskrævende og kan være subjektiv. Heri er en hurtig, kvantitativ metode til vurdering af de invasive adfærd af kræft i æggestokkene spheroids i realtid beskrevet. For det første blev en kugleformet-mesothelial celle model etableret som repræsenterer den fase af kræft i æggestokkene metastaser når flercellede sphæroider tillægger og invadere peritoneal foring til at danne sekundære tumorer. Så metode for et Real Time Cell Analyzer (RTCA, se Materialer tabellen firmaoplysninger) blev tilpasset til at foretage kvantitativ real time målinger af invasive kapacitet forskellige ovariecancer cellelinier som spheroids og testet i denne model.
I RTCA iinstrument er cellulære reaktioner overvåges kontinuerligt i løbet af et assay, uden behov for udefra kommende etiketter ved at måle ændringer i elektrisk impedans. Specielt designet dyrkningspladerne har guld belagt mikroelektroder placeret under en mikroporøs membran på grænsefladen mellem de øvre og nedre kamre af en 2 chambered godt (»CIM« plader). Placeringen af elektroderne i det nedre kammer muliggør målingen af ændringer i elektrisk impedans som celler invaderer gennem en ECM-eller ECM / cellulær barriere. Membranen grænsefladen mellem de 2 kamre i hver CIM plade brønd først belagt med ECM komponenten af interesse. I sfæroid-mesothelial celle modelsystem, er grænsefladen overtrukket med et lag Matrigel (se Materialer tabellen firmadetaljer) at efterligne komplekse ECM underliggende mesothelial foring af bughinden, efterfulgt af et konfluent monolag af humane mesothelial ' mål 'celler. Endelig Forbøjede ovariecancer spheroids er adDED. Kræft i æggestokkene kugleformede celler skal aktivt invadere gennem targetcellerne lag og matrix for at nå bunden kammer og ændre elektriske impedans aflæsninger. Målceller på deres eget vurderes også at sikre, at de ikke invadere gennem matrixen lag og er egnede til anvendelse i dette assay.
Protocol
1. Udarbejdelse af celler, Medie og reagenser
- Fremstilling af methylcellulose indeholdende Medium
- 1,5 g methylcellulose opløses i 100 ml steril Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) (ingen tilsætningsstoffer) i en 250 ml kolbe.
- Varm løsning på lav i en mikrobølgeovn i 5 min; sørge for at undgå koge over.
- Når methylcellulose pulver er semi-opløst, tilsæt en ren magnetisk omrører og medier til at tage volumen til 125 ml.
- Bland, vendes, og der omrøres ved stuetemperatur i 1,5 time efterfulgt af omrøring ved 4 ° C natten over.
- Opdel løsning ligeligt i fire 50 ml rør og centrifugeres i 1,5 time ved 2.300 x g.
- Saml den klare, meget tyktflydende supernatant (ca. 90-95% af bestanden), alikvot i sterile 50 ml rør, og opbevares ved 4 ° C i op til 3 måneder.
- Kultur og mærkning af celler
- Bevar æggestokkene kræft cellelinjer i monolag i en TIssue kultur inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i passende vækstmedium (DMEM for KGN celler 17 og MCBD110: M199 for OVCA429 og OVCA433 cellelinier 18) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L -glutamin og 1% penicillin-streptomycin.
- Oprethold LP9 humane mesotelceller i M199: Hams F12-medier indeholdende 15% FBS, 10 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF) og 400 ng / ml hydrocortison, i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Seed celler i den ønskede kolbe størrelse og vokse til omkring 75% sammenflydning. Harvest celler ved trypsinbehandling under anvendelse af 0,05% trypsin / EDTA, centrifugering ved 186 xg i 5 minutter, og vask cellepellet to gange med PBS.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Valgfri Fluorescent cellemærkning Method
- Resuspender cancerceller i en slutkoncentration på 1 x 10 6 celler / ml i 1 ml forvarmet PBS/0.1% BSA.
- Tilsæt 2 pi 5 mM lager Cell Trace CSFE opløsning (eller en anden foretrukken celle etiket, som fastholdes på lang sigt) til cellerne til en slutkoncentration på 10 uM, og der inkuberes ved 37 ° C i 10-15 minutter i et vandbad.
- Stands reaktionen med 1 ml iskold medium indeholdende 10% FBS og re-pellet ved centrifugering. Resuspender i 10 ml af den passende forvarmet vækstmedium (se trin 1.2.1).
- Seed celler i en 75 cm2 filter-capped kolbe, og dyrkning ved 37 ° C, 5% CO2.
- Check celler under et fluorescensmikroskop for at kontrollere, at niveauet af fluorescens mærkning er tilstrækkelig til detektion. Når cellerne når cirka 75% konfluens, høst og tæller som i trin 1.2.3 og 1.2.4 ovenfor.
2.. Generering af Sfæroider i Methylcellulose
- Beregn mængden af kræft i æggestokkene celler fra afdeling 1, der er nødvendige for klumpformet generation (der kræves i alt 300.000 celler til hver fulde 96 brønde eksperiment). Nejte: hvis du bruger forskellige cellelinjer end præsenteret her, kan være nødvendigt at være optimeret til hver linje celletætheder for ensartet klumpformet generation.
- For at beregne fortynding af celler i methylcellulose medier, for det første trække cellevolumen kræves (trin 2.1) fra 15 ml.
- Tilsæt 3 ml methylcellulose stamopløsning (for at gøre 20% methylcellulose endelig) til et volumen på dyrkningsmedium passende for hver cellelinie, svarende til 15 ml minus volumen cellen og bland grundigt ved forsigtig inversion.
- Føj 300.000 celler til methylcellulose medium og blandes grundigt ved forsigtig inversion.
- Tilsæt 150 pi af celle / methylcellulose / media mix (i alt 3000 celler / brønd) i hver brønd i en 96-brønds konkav bund dyrkningsplade og kultur ved 37 ° C, 5% CO2 i 1-4 dage, eller indtil ensartede sfæroider danne (1 sfæroide / brønd typisk observeret).
3.. RTCA celleinvasion Analyser
NOTE: Impedans aflæsninger udtrykkes som Cell Index (CI), en dimensionsløs parameter, der er en relativ ændring i målte celle impedans repræsenterer cellens status. Til analyse, data import til et regneark, såsom Microsoft Excel.
- Plate Forberedelse
- Arbejde i grupper på 4 brønde på et tidspunkt, tilsættes 50 pi matrix (fortyndet 1:10 i serumfrit kulturmedium) til hver brønd i det øvre kammer af en 16-brønds RTCA CIM pladen for at sikre, at det samlede areal er dækket . Fjern 30 pi matrix samme, men langsomt, for at slippe af overskydende væske.
- Inkubér pladen ved 37 ° C i 4 timer før anvendelse i en vævskultur-inkubator.
- Tilsæt 30 ul af serumfrit medium (SFM) passende for hver cancer cellelinie til det øvre kammer og 160 pi medier med eller uden serum (som pr din eksperimentelle design) til det nederste kammer.
- Saml CIM pladen ved at klikke på det nedre kammer ind i det øvre kammer og equilibrspiste i en 37 ° C inkubator i 1 time i en vævskultur-inkubator.
- Programmering af RTCA Instrument
- Åbn RTCA programmet og vælg fanebladet 'Layout'. Fremhæv alle eksperimentelle brønde.
- Højreklik på brønde og vælg 'Tænd brønde; derefter udfylde eksperimentelle betingelser og celle navne som ønsket.
- Hvis du vil tilføje trin eller undertrin til programmet, skal du vælge fanen 'Schedule' og højreklik på 'Tilføj et skridt ". Det første skridt er en forprogrammeret baggrund sweep, som automatisk indarbejdet i programmet, når "tilføje et skridt" er valgt.
- Indtast de ønskede oplysninger om programmet til trin 2 i RTCA program, der skal registrere aflæsninger under etableringen af LP9 monolag. Tilføj tidsintervallerne mellem impedans aflæsninger ved at vælge fanen 'Interval' og indtaste '15 min '. Tilføj eksperimentel varighed ved at vælge 'Duration' fanen end ind i en tid mellem 12-24 timer.
- Hvis du vil tilføje efterfølgende trin, skal du vælge fanen 'Schedule' og højreklik på 'Tilføj et skridt "og indtaste oplysninger om de yderligere skridt, som ovenfor. Trin 3 i RTCA programmet vil lede instrument til at tage aflæsninger under klumpformet invasion; indtaste '5 min "under" Interval "fanen og '48 hr 'under fanen' Duration '.
- Vælg 'plade' på menubjælken og gem.
- Generering af LP9 monolag og måling af Sfæroide Invasion
- Placer CIM plade i RTCA instrument og åbent program fra trin 3.2 ovenfor. Før tilsætning af celler, skal du vælge 'Udfør' i menulinjen og derefter 'Start'. En baggrund feje vil automatisk blive udført (trin 1 i RTCA software instruktioner).
- Fjern CIM plade fra instrumentet efter baggrunden feje og sted i en vævskultur hætte.
- Plade 50,000 LP9 celler suspenderet i 160 ul SFM i det øverste kammer i hver CIM plade godt.
- Pladen anbringes i RTCA instrumentet og tage aflæsninger hver 15 min, mens LP9 Monolaget oprettelse natten over (Trin 2 i RTCA programmet).
- Harvest kræft spheroids genereret under Trin 2 'generation af spheroids i methylcellulose' ovenfor.
- Aseptisk, skæres 1 mm fra toppen af en 1 ml pipettespids og bruge til forsigtigt at hente indholdet af hver brønd. Overførsel til et sterilt rør.
- Centrifuge Spheroids ved 120 xg i 8 min, og fjerne methylcelluloseholdigt medium ved forsigtig aspiration.
- Vask sphæroider to gange mere med PBS, centrifugering ved 120 xg i 8 min til pelletering spheroids efter hver vask.
- For hver eksperimentel godt, resuspender alt 10 spheroids i 160 pi medium uden FBS.
- Pause i RTCA eksperimentet ved at vælge 'Udfør' i menulinjen og kontrol &# 8216; Pause ". Fjern CIM plade fra instrumentet, og læg i en vævskultur hætte. Aspirer off medier fra hver brønd og erstatte med klumpformet-holdige medier (10 kugler i 160 ul) eller frisk medier til LP9 kun kontrolhullerne.
- Retur pladen til RTCA instrumentet. Vælg 'Udfør' i menulinjen og tjek 'Afbryd skridt ". Programmet går automatisk til næste trin. For at genoptage eksperimentet, skal du vælge 'Udfør' i menulinjen og tjek 'Start / Fortsæt'. Trin 3 i RTCA programmet vil indlede.
- Dataanalyse
- For at bestemme omfanget af klumpformet celle invasiv, trække de opnåede værdier for LP9 monolag kun fra de enkelte aflæsninger opnået for kræft i æggestokkene cellelinjer ved hvert tidspunkt.
- For at plotte 'kugleformet invasion', normalisere alle værdier til tidspunktet, hvor de sfæroider blev tilsat til pladen ved setting at tidspunkt til '0 '.
Representative Results
Ovariecancer spheroids kan genereres fra mange typer af cellelinjer ved dyrkning dem i suspension eller ved at høste primære tumorceller fra malign ascites 2,14. Her to epitelovariecancer cellelinjer, OVCA433 og OVCA429, og en æggestokkene granulosacelle tumor linje, KGN, er blevet brugt til at generere spheroids (figur 1a). I denne fremgangsmåde dyrkes celler i rundbundede brønde mens det er ophængt i medier, der er gjort tyktflydende ved tilsætning af methylcellulose. Under disse betingelser udviser mange ovariecancerceller en iboende evne til at aggregere til dannelse af sfæroider 13. Efter dyrkning natten suspenderet i methylcellulose / medier alle tre cellelinier dannet kompakte kugleformede strukturer på ca 400-500 um i diameter (figur 1A). I mellemtiden er RTCA CIM plade fremstilles først ved at overtrække den porøse membran interface med matrix og derefter en sammenflydende monolag af humane mesothelial celler (figur 1b). Når dannet, sfæroider overføres derefter til den tilberedte CIM pladen. Høstede cancer sfæroider udplades på toppen af LP9 monolag og vurderes som beskrevet nedenfor. Billeder under standard fase mikroskopi (eller under fluorescerende mikroskopi, hvis det valgfrie cellemærkning skridt blev fulgt) af parallelle kulturer er taget med jævne mellemrum at støtte i fortolkningen af de RTCA data (figur 1C).
Det er informativt at vurdere både det basale niveau af invasionen af en cancer cellelinje, såvel som kemoattraktant-induceret invasion. Typisk basal invasionsevne målt ved tilsætning af SFM både de øvre og nedre kamre. Complete media (10% FBS), som indeholder mange potentielle kemoattraktanter, der anvendes i den nuværende eksempel at undersøge 'kemoattraktant-induceret "invasion (figur 2). Parallelle undersøgelser af LP9 mesotelceller alene bekræftede, at disse celler er minimalt ivasive over 2 dage i henhold til enten basal eller "chemoattractant 'inducerede betingelser, og dermed var en god celletype at bruge i co-kultur assays med kræft i æggestokkene celler (figur 2A og 2B). I modsætning hertil ovariecancer spheroids genereret ved hjælp af en af de tre cellelinjer udviste evnen til at invadere mod en chemoattractant (FBS) (figur 2A-2C). Den største fordel ved at anvende de RTCA realtid instrumenter i forhold til traditionelle endpoint assays er, at ændringer i celle / sfæroid adfærd kan kvantificeres over tid. I løbet af de 2 dage assay KGN, OVCA429 og OVCA433 cellelinier alle udstillet evnen til at invadere mod en chemoattractant (indikeret ved at øge celle indekser), men lave basale niveauer af invasion (Figur 2C). De cellelinjer udviste tilsvarende satser for invasion, som indikeret af de parallelle skråninger af kurver (figur 2C); imidlertid OVCA429 kurve udviste en højere øvre asymptote,som viste en højere maksimal grad af invasion i forhold til de andre cellelinjer. Desuden cellelinjer udviste forskelle i deres tid til indtræden af invasion, med KGN cellerne hurtigt invaderer cellen og matrix barrierer og OVCA433 og OVCA429 celler tager 3-5x længere tid at invadere henholdsvis (figur 2D). Vigtigere er det, deres adfærd ved begyndelsen af invasionen ikke var prædiktiv for deres samlede kapacitet til invasion (figur 2C og 2D). Dette tyder på forskellige iboende evner i den cancer cellelinjer, men også kan indikere, at forskellige faktorer kan regulere tidlige og sene invasive adfærd sphæroider.
Figur 1 Sfæroide generation og model af eksperimentel oprettet A:.. Jegmagikere under fasekontrast mikroskopi af spheroids danner i methylcellulose / media (øverst) og den matchende cellelinie dyrket som et monolag (nederst) B:. Skematisk viser RTCA 2 kamre CIM plade godt sat op, hvor præ-formet æggestokkræft sfæroider udplades på toppen af et monolag af en LP9 mesothelial lag / matrix barriere i det øvre kammer og medier ± FBS som en kemoattraktant tilsættes til det nederste kammer. Elektroder nedenunder grænsefladen af 2 kamre foranstaltning stigende elektriske impedans som flere celler invaderer gennem barriererne for det nedre kammer C:. Billeder af KGN spheroids oven på LP9 monolag under fasekontrast mikroskopi (venstre) eller fluorescens mikroskopi (til højre). Skalapanelerne = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
.. Figur 2 Real time ovariecancer klumpformet invasion data A - B: Repræsentative resultater fra en RTCA invasion assay udført med og uden FBS i bunden kammer af et CIM-plade godt. KGN celleinvasion sammenlignes LP9 mesotelceller. Resultater er vist som middelværdi ± SD Cell Index fra tredobbelte brønde på 24 timers tidspunkterne (A) og over en hel to dage assayperioden (B) C - D:. En sammenligning af de invasive kapacitet KGN, OVCA429 og OVCA433 celle linjer afbildet over en 24 timers periode (C) og mere detaljeret måde over en 2,5 timers periode (D).
Discussion
Invaderende ovariecancerceller interagere med en række celletyper på overfladen af bughinden, herunder fibroblaster, adipocytter, og mesotelceller og tovejskommunikation mellem cancerceller og peritoneale celler menes at spille en vigtig rolle i at drive metastatiske proces 2. Når mestrer, protokollen beskrevet heri let kan tilpasses til studiet af disse interaktioner i den peritoneale mikromiljø, fx ved tilsætning af exogene cytokiner, vækstfaktorer, eller specifikke inhibitorer til de øvre eller nedre kamre i CIM pladen godt eller genetisk manipulation af kræft eller peritoneale cellelinier. Endvidere kan denne metode bruges med primær ovarie tumorceller høstet frisk fra malign ascites og / eller primære peritonealceller at få direkte indsigt i de regulatoriske signaler og cellulære interaktioner, som regulerer etableringen af en metastatisk læsion i bughulen Anvendelse af RTCA instrument til at måle invasive kapacitet af enkelte celler eller spheroids giver flere fordele i forhold til konventionelle enkelt endpoint assays og time-lapse billede analyser. Den RTCA Instrumentet måler cellulær invasion ved definerede intervaller kontinuerligt i løbet af en analyse, som kan være timer eller dage. Dette muliggør bestemmelse af ændringer i antallet af invasionen over tid, hvilket overvinder de begrænsninger af en enkelt endpoint assays. For eksempel undersøger invasions data fra de forskellige cancer cellelinjer på en enkelt endpoint (figur 2), fx 3 timer, kunne have ført til den fejlagtige konklusion, at KGN og OVCA433 celler var langt mere indgribende end OVCA429 celler. En anden fordel ved denne teknologi er, at RTCA Instrumentet måler ændringer i elektrisk impedans. Det betyder, at analyser kan køres uden mærkning af celler med en eksogen middel, hvilket kan have utilsigtede virkninger på celle Phenotype eller funktion. Dette bliver særlig vigtigt, når man studerer primær ovariecancer celler fra malign ascites, hvormed det er bydende nødvendigt at holde manipulationer til et minimum for at undgå at indføre molekylære og fænotypiske ændringer, som ikke er reflekterende af deres in vivo natur 2. Endvidere er anvendelsen af RTCA instrument muliggør indsamling af kvantitative data i realtid, som ikke kun undgår tidskrævende analyser forbundet med time-lapse mikroskopi, men giver også mulighed for hurtig bestemmelse af centrale eksperimentelle vinduer til analyse optimering. Dette er især nyttigt, når man sammenligner effekten af en række faktorer på klumpformet invasion, kan lige så forskellige faktorer udøver deres maksimale virkninger på forskellige tidspunkter eller med meget forskellige profiler over tid. Selv om denne protokol er modtagelig for ændringer (f.eks brug af forskellige ECM-matrix, forskellige cancer cellelinjer, eller forskellige mål cells), hvis dette er det vigtigt at bemærke, at forskellige eksperimentelle betingelser først skal optimeres. For eksempel før påbegyndelse af studier af klumpformet invasion, det optimale antal af kræftceller / CIM plade vel skal først bestemmes ved analyse af celle nummer titreringer i monolagskultur. Det optimale antal sphæroider at bruge per godt derefter baseret på denne analyse. For eksempel i den nuværende metode, sfæroider omfatter cirka 3.000 celler hver, når først genereres. Hvis oprindelige celleantal titreringer viser, at 30.000 celler i monolag er optimale for påvisning i invasion analyser, derefter tilsættes 10 sfæroider pr CIM plade godt. Endvidere, når ledende co-kultur eksperimenter, er det vigtigt at studere adfærd af den "target 'cellemonolag separat for at afgøre, hvorvidt disse celler er i sagens natur invasive, da dette kan forvirre resultaterne. I eksemplet påvises, er cancer sfæroider udpladet på toppen af en LP9 celle Monolayer med og uden FBS tilsat til bunden samt en kemoattraktant. Sideløbende er LP9 celler dyrket alene, under hver behandling betingelse. Tilsvarende, når man studerer den invasive kapacitet af celler og sfæroider er det også vigtigt at undersøge deres vandrende kapacitet samt for at skelne mellem de to adfærd (dvs. invasion kræver proteolytisk spaltning af et ECM barriere mens migration ikke). For at gøre dette, udelade ECM barriere (trin 3.1.1 - 3.1.3) og gennemføre analysen parallelt med ECM barriere på plads. Sidstnævnte 'invasion' foranstaltning kan rettes til den tidligere "migration" foranstaltning, hvis det ønskes. Endelig er det vigtigt at bemærke, at oplysninger fra de foranstaltninger af elektriske impedans er begrænset i omfang: Når cellerne har invaderet i bunden kammer, kan ændringer i deres fastgørelse, spredning og spredning på undersiden af membranen bidrage til ændringer i impedans readings. Derfor er denne metode er mest informative, når de anvendes i forbindelse med andre assays af kugleformet cellelevedygtighed, adhæsion, migration og morfologi med henblik på grundig vurdering kugleformede celle adfærd. For eksempel ideelt, for fuldt ud at forstå kugleformede-mesotelial interaktioner, separate co-kulturer bør også afbildes periodisk under standard fasemikroskopi, så der kan foretages kvalitative vurderinger af sfæroid morfologi og sundhed parallelt med kvantitative RTCA assays af invasion. Hvis det valgfrie mærkning trin er udført, så den adfærd af enkelte kræftceller kan bestemmes under fluorescerende mikroskopi, da de løsrives fra klumpformet og interagere med de umærkede mesotelceller. En ekstra fordel ved fluorescerende mærkning af cancerceller ved co-dyrkning med en anden celletype er, at det så er muligt at bekræfte, at kun kræftcellerne har invaderet de barrierer celler og ECM.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en CASS Foundation Natur-og Sundhedsvidenskabelige Grant; (MB); en National Health & Medical Research Council i Australien Project Grant (KLS, 338.516); og af den victorianske regering operationelle infrastruktur Support Program (Australien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4,000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
- Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
- Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6 (2006).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
- Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
- Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
- Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).
