Summary
Ovariale kankercel invasie in de mesotheellaag van het peritoneum is een dynamisch proces in de tijd. Gebruik te maken van een real-time analyzer, kan de invasieve capaciteit van eierstokkanker cellen in een bolvormige-mesothelial cel co-cultuur model gekwantificeerd worden gedurende langere perioden, het verstrekken van inzicht in factoren die de het metastatische proces.
Abstract
Eierstokkanker uitzaaien door het afstoten in de peritoneale vloeistof en verspreiden naar distale sites binnen het buikvlies. Monolaagkweken niet nauwkeurig modelleren het gedrag van kankercellen bij een hechtende omgeving kankercellen inherent aggregeren tot multicellulaire structuren die bijdragen aan het metastatische proces door aan en invasie van de peritoneale voering secundaire tumoren vormen. Voor het modelleren van deze belangrijke fase van eierstokkanker metastase, meercellige aggregaten, of bolvormige deeltjes, kunnen worden gegenereerd uit gevestigde eierstokkankercellijnen onder nonadherent voorwaarden gehandhaafd. De peritoneale micro waarmee tumorcellen in vivo na te bootsen, werd een sferoïde-mesotheelcellen co-cultuurmodel gevestigd waar voorgevormde sferoïden worden uitgeplaat op een humane mesotheelcellen cel monolaag gevormd over een extracellulaire matrix barrière. Methoden werden vervolgens ontwikkeld met behulp van een real-time cel analysator om kwantitatieve real voerentijdmetingen van het invasieve vermogen van verschillende eierstokkanker cellijnen gekweekt als sferoïden. Deze aanpak zorgt voor de continue meting van de invasie over lange perioden van tijd, wat een aantal voordelen ten opzichte van traditionele eindpunt assays en het imago meer bewerkelijke realtime microscopie analyses heeft. Kortom, deze methode maakt een snelle bepaling van factoren die de interacties tussen eierstokkanker bolvormige cellen invasie door mesothelial en matrix barrières in de tijd te regelen.
Introduction
Eierstokkanker heeft het hoogste sterftecijfer van alle gynaecologische kankers 1. Wereldwijd zijn er ~ 230.000 gevallen en meer dan 100.000 doden als gevolg van de ziekte elk jaar 1. De meeste patiënten (> 75%) zijn gediagnosticeerd na de kanker al is uitgezaaid, wanneer de behandeling verder wordt gecompliceerd door verhoogde weerstand tegen chemotherapie en de prognose is slecht 2. Patiënten met stadium III-IV gemetastaseerde ziekte hebben 5 jaarsoverleving van slechts 30-40% 3. Er is dus een dringende behoefte aan een beter inzicht in de cellulaire gedrag onderliggende eierstokkanker metastase om effectief te behandelen gevorderde ziekte.
Het huidige model van eierstokkanker metastase stelt verschillende stappen in het metastatische proces, elk plaatsvindt in een afzonderlijke micro die effecten op gedrag van de tumor. Uitzaaiende eierstokkankercellen aanvankelijk worden vergoten is van de primaire tumor en overleven in een nonadherent staat binnen de peritoneale vloeistof als enkele cellen of driedimensionale meercellige structuren, genoemd meercellige aggregaten of sferoïden 2,4,5. Cellen die niet sferoïden in suspensie behoren, zijn gevoeliger voor anoikis 2,4,5. Sferoïden ook vertonen verhoogde resistentie tegen chemotherapeutica, bijdragen aan residuele ziekte en vervolgens herhaling van kanker 2,4,5. Een tweede cruciale stap in eierstokkanker metastase is de overgang van de aggregaten van vrij zwevende clusters aan gevestigde secundaire tumoren in de peritoneale muur en omentum 5,6. Cel-cel en cel-substraat interacties zijn betrokken bij aggregaatvorming, overleving en hechting aan de extracellulaire matrix (ECM) geproduceerd door de mesotheellaag van het buikvlies 4-11. Vooralsnog zijn deze processen slecht begrepen.
Om de bij de verspreiding van eierstokkanker mechanismen te definiëren, kan sferoiden alge wordenATED van gevestigde cellijnen met behulp nonadherent kweekmethoden, behoud van cellen in suspensie, hetzij door toevoeging van methylcellulose aan het kweekmedium 12,13 of door het kweken van cellen op low-bevestigingsplaten 2,14. Wanneer gekweekt op deze manier, eierstokkankercellen assembleren tot multicellulaire aggregaten of sferoïden die soortgelijke cellulaire, moleculaire en biochemische eigenschappen met tumor aggregaten in vivo 2,14 vertonen. Na het vormen kunnen sferoïden vervolgens geoogst uit het medium en hechtend opnieuw uitgeplaat op verschillende vaste oppervlakken voor functionele studies. Dit betekent een vooruitgang ten opzichte van assays in monolaag cultuur, die daarvan niet nauwkeurig model van de gedragingen van eierstokkanker cellen uitzaaiingen binnen een nonadherent omgeving zoals de intraperitoneale vloeistof.
De invasieve capaciteit van kanker sferoïden kan worden beoordeeld in de traditionele eindpunt assays in Boyden 2 15,16; echter analyse tijdsverloop gegevens is tijdrovend en kan subjectief zijn. Hierin wordt een snelle, kwantitatieve methode om de invasieve gedrag van eierstokkanker sferoïden realtime beschreven. Ten eerste werd een bolvormige-mesothelial celmodel opgericht, die het stadium van eierstokkanker metastase vertegenwoordigt als meercellige sferoïden hechten aan en dringen het peritoneale voering om secundaire tumoren vormen. Dan methodologie voor een Real Time Cell Analyzer (RTCA, zie Materialen tabel bedrijfsinformatie) aangepast kwantitatieve real-time metingen van het invasieve vermogen van verschillende eierstokkanker cellijnen gekweekt als sferoïden en getest in dit model voeren.
In het RTCA instrument, cellulaire reacties continu gevolgd gedurende het verloop van een test, zonder dat exogene etiketten, door het meten van veranderingen in elektrische impedantie. Speciaal ontworpen kweekplaten hebben goud gecoate micro-elektroden zich onder een microporeus membraan op het grensvlak tussen de bovenste en onderste kamers van 2 goed chambered (CIM "platen). De locatie van de elektroden in de onderste kamer maakt meting van veranderingen in elektrische impedantie cellen binnendringen via een ECM of ECM / cellulaire barrière. Het membraan interface tussen de 2 kamers van elke CIM plaat goed wordt eerst bekleed met de ECM component van belang. In de sferoïde-mesotheelcellen cel modelsysteem is de interface bekleed met een laag Matrigel (zie Materialen tabel bedrijfsinformatie), de complexe ECM onderliggende mesotheellaag van het peritoneum bootsen, gevolgd door een confluente monolaag van humane mesotheelcellen ' target 'cellen. Tenslotte voorgevormde eierstokkanker sferoïden zijn advertentieDED. Eierstokkanker bolvormige cellen moeten actief binnen te dringen door de doelcellen laag en matrix om de onderste kamer te bereiken en elektrische impedantie metingen veranderen. Doelcellen als zodanig worden ook beoordeeld om te garanderen dat zij niet bedreigen via de matrixlaag en zijn geschikt voor gebruik in deze assay.
Protocol
1. Bereiding van cellen, Media en reagentia
- Bereiding van methylcellulose bevattende Medium
- Oplossen in 100 ml steriele Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (geen additieven) in een 250 ml kolf 1,5 g methylcellulose.
- Verwarm de oplossing op een laag in de magnetron gedurende 5 minuten; zorg om te voorkomen overkoken.
- Zodra de methylcellulose poeder semi opgelost, voeg een schone magnetische roerder en media om het volume naar 125 ml.
- Meng, invertsuiker en roer bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur, gevolgd door roeren bij 4 ° C overnacht.
- Verdeel de oplossing gelijkmatig in vier 50 ml en centrifugeer gedurende 1,5 uur bij 2300 x g.
- Vang het heldere, zeer viskeuze supernatant (ongeveer 90-95% van de voorraad), hoeveelheid in steriele 50 ml buizen, en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
- Cultuur en etikettering van cellen
- Handhaaf eierstokkanker cellijnen monolaag in een tissue incubator bij 37 ° C, 5% CO2 in geschikte kweekmedia (DMEM de KGN cel 17 en MCBD110: M199 voor OVCA429 en OVCA433 cellijnen 18) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L -glutamine en 1% penicilline-streptomycine.
- Handhaaf LP9 humane mesotheelcellen in M199: Ham F12 medium dat 15% FBS, 10 ng / ml epidermale groeifactor (EGF) en 400 ng / ml hydrocortison in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2.
- Zaad cellen in de kolf gewenste grootte en groeien tot ongeveer 75% confluentie. Oogst cellen door behandeling met trypsine met 0,05% trypsine / EDTA, rotatie bij 186 xg gedurende 5 minuten en spoel celpellet tweemaal met PBS.
- Tellen cellen met een hemocytometer.
- Optioneel TL Cell Labeling Methode
- Resuspendeer kankercellen bij een eindconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml in 1 ml voorverwarmd PBS/0.1% BSA.
- Voeg 2 pi van 5 mM voorraad Cell Trace CSFE oplossing (of andere gewenste cel etiket dat wordt vastgehouden op lange termijn) om cellen in een eindconcentratie van 10 uM en incubeer bij 37 ° C gedurende 10-15 min in een waterbad.
- Blus de reactie met 1 ml ijskoud medium dat 10% FBS en opnieuw pellet door centrifugeren. Resuspendeer in 10 ml van de juiste voorverwarmd groeimedium (zie stap 1.2.1).
- Zaad cellen in een 75 cm 2-filter bedekte kolf en cultuur bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Bekijk de cellen onder een fluorescentiemicroscoop te verifiëren dat het niveau van fluorescentie labeling is voldoende voor detectie. Zodra cellen te bereiken ongeveer 75% confluentie, oogst en tellen als in de stappen 1.2.3 en 1.2.4 hierboven.
2. Generatie van Sferoïden in Methylcellulose
- Bereken het volume van ovariale kankercellen rubriek 1 voor sferoïde generatie (totaal 300.000 cellen voor elk volledig 96-putjesplaat experiment). Geente: bij gebruik van verschillende cellijnen dan hier wordt gepresenteerd, kan het nodig zijn cel dichtheden voor uniforme bolvormige generatie te worden geoptimaliseerd voor elke regel.
- Om verwatering van cellen in methylcellulose media te berekenen, eerst trek de cel volume vereist (stap 2.1) van 15 ml.
- Voeg 3 ml methylcellulose stockoplossing (tot 20% methylcellulose def maken) tot een volume kweekmedium geschikt voor elke cellijn, gelijk aan het celvolume 15 ml verminderd en meng goed door voorzichtig omkeren.
- Toevoegen 300.000 cellen naar de methylcellulose bevattend medium en grondig gemengd door voorzichtig omkeren.
- Pipetteer 150 ul van de cellen / methylcellulose / media mix (in totaal 3000 cellen / putje) in elk putje van een 96-well plaat holle bodem cultuur en de cultuur bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 1-4 dagen of tot uniforme bolletjes vormen (1 spheroïde / goed wordt meestal waargenomen).
3. RTCA Cell Invasion Testen
NOTE: Impedantie metingen worden uitgedrukt Cell Index (CI), een dimensieloze parameter die een relatieve verandering in gemeten impedantie cel die de status cel. Voor de analyse, gegevens importeren in een spreadsheet, zoals Microsoft Excel.
- Plaat Voorbereiding
- Werken in groepen van 4 putjes per keer, voeg 50 ul matrix (1:10 verdund in serumvrij kweekmedium) aan elk putje van de bovenste kamer van een 16-wells plaat RTCA CIM dat de totale oppervlakte bedekt . Verwijder 30 pl matrix onmiddellijk, maar langzaam, om zich te ontdoen van het overtollige vocht.
- Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende 4 uur voor gebruik in een weefselkweek incubator.
- Voeg 30 ul van de serum-vrij medium (SFM) aangewezen voor elke kankercel lijn naar de bovenste kamer en 160 ul van media met of zonder serum (als je per proefopzet) aan de Tweede Kamer.
- Monteer de CIM plaat door te klikken op de onderste kamer in de bovenste kamer en equilibraten in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur in een weefselkweek incubator.
- Programmeren van de RTCA Instrument
- Open het RTCA programma en selecteer het tabblad 'Layout'. Markeer alle experimentele putten.
- Klik met de rechtermuisknop op de waterputten en selecteer 'Zet putten'; dan in experimentele condities en celnamen vullen zoals gewenst.
- Te stappen of deelstappen toe te voegen aan het programma, selecteer de 'Schedule' tab en klik met de rechtermuisknop op 'Voeg een stap'. De eerste stap is een voorgeprogrammeerde achtergrond sweep, die automatisch wordt opgenomen in het programma, als 'add een stap' wordt gekozen.
- Voer het gewenste programma informatie voor Stap 2 van het RTCA programma, dat lezingen zal opnemen tijdens de oprichting van de LP9 monolaag. Voeg de tijdsintervallen tussen impedantie metingen door het tabblad 'Interval' selecteren en invoeren van '15 minuten '. Voeg experimentele duur door het selecteren van de 'Duur' tab eend het invoeren van een tijd tussen 12-24 uur.
- Om volgende stappen toe te voegen, selecteert u de 'Schedule' tab en klik met de rechtermuisknop op 'Voeg een stap' en vul de details van de extra stappen, zoals hierboven. Stap 3 van het RTCA programma zal het instrument om te meten tijdens spheroïde invasie richten; voer '5 min 'onder de' Interval 'tab en '48 uur' onder het tabblad 'Duur'.
- Selecteer 'Plate' in de menubalk en op te slaan.
- Generatie LP9 monolaag en waardering van Sferoïde Invasion
- Plaats CIM plaat in RTCA instrument en open programma vanaf stap 3.2. Voorafgaand aan het toevoegen van cellen, selecteer 'Uitvoeren' in de menubalk en vervolgens op 'Start'. Een achtergrond sweep wordt automatisch uitgevoerd (Stap 1 in het RTCA software-instructies).
- Verwijder de CIM plaat uit het instrument na de achtergrond sweep en plaats in een weefselkweek kap.
- Plaat 50,000 LP9 cellen gesuspendeerd in 160 ul SFM in de bovenste kamer van elk CIM plaat ook.
- Plaats de plaat in de RTCA instrument en neem metingen om de 15 min, terwijl de LP9 monolaag is het vaststellen van een nacht (Stap 2 van het RTCA programma).
- Harvest kanker sferoïden die onder Stap 2 'Generatie van sferoiden in methylcellulose', hierboven.
- Aseptisch gesneden 1 mm van de bovenkant van een 1 ml pipet en om voorzichtig ophalen van de inhoud van elk putje. Transfer naar een steriele buis.
- Centrifuge Sferoïden bij 120 xg gedurende 8 minuten, en verwijder methylcellulose bevattend medium door behoedzame aspiratie.
- Was sferoïden tweemaal met PBS, centrifugeren bij 120 g gedurende 8 minuten tot sferoïden pellet na elke wasbeurt.
- Voor elke experimentele goed, resuspendeer in totaal 10 sferoïden in 160 pl medium zonder FBS.
- Pauzeer de RTCA experiment van 'Uitvoeren' in de menubalk te selecteren en controleren &# 8216; Pauze '. Verwijder de CIM plaat uit het instrument, en plaats in een weefselkweek kap. Zuig uit de media uit elk putje en te vervangen door bolvormige-bevattende media (10 bollen in 160 pi) of vers media voor alleen-LP9 controles.
- Keer de plaat om de RTCA instrument. Selecteer 'Uitvoeren' in de menubalk en check 'stap afbreken'. Het programma zal automatisch naar de volgende stap. Om het experiment te hervatten, selecteer 'Uitvoeren' in de menubalk en check 'Start / Continue'. Stap 3 in het RTCA programma starten.
- Data Analysis
- Om het niveau van bolvormige cel invasiveness bepalen, trekt de voor de LP9 monolaag alleen vanuit de afzonderlijke resultaten verkregen voor de eierstokkanker cellijnen bij elk meetpunt waarden.
- Om "sferoïde invasie 'plotten normaliseren alle waarden voor het tijdstip waarop de sferoïden werden aan de plaat toegevoegd, door seeld dat tijdstip op '0 '.
Representative Results
Eierstokkanker sferoïden kunnen uit vele soorten van cellijnen door ze te kweken in suspensie of door het oogsten van primaire tumorcellen van maligne ascites 2,14. Hier twee epitheliale eierstokkanker cellijnen OVCA433 en OVCA429 en een ovarium granulosa cel tumor lijn, KGN, zijn gebruikt om sferoïden (figuur 1A) genereren. In deze werkwijze worden cellen gekweekt in U-vormige putjes terwijl gesuspendeerd in media die viskeus is door de toevoeging van methylcellulose. Onder deze omstandigheden veel eierstokkanker cellen een inherente vermogen te aggregeren tot sferoïden 13 vormen. Na overnacht cultuur gesuspendeerd in methylcellulose / media, alle drie cellijnen gevormd compacte bolvormige structuren van ongeveer 400-500 micrometer in doorsnede (figuur 1A). Ondertussen is de RTCA CIM plaat bereid, ten eerste door het coaten van de poreuze membraan interface met matrix en een confluente monolaag van menselijke mesothelial cellen (Figuur 1B). Eenmaal gevormd sferoïden worden vervolgens overgebracht naar de voorbereide CIM plaat. Geoogst kanker sferoïden uitgeplaat bovenop de LP9 monolaag en beoordeeld zoals hieronder beschreven. Beelden onder standaard fase microscopie (of onder fluorescentie microscopie, als de optionele cel etikettering stap werd gevolgd) van parallelle culturen worden periodiek genomen om te helpen bij de interpretatie van de RTCA gegevens (figuur 1C).
Het is informatief zowel het basale niveau van invasie van kanker cellijn, evenals chemoattractant geïnduceerde invasie beoordelen. Typisch wordt basale invasiviteit gemeten door de toevoeging van SFM zowel de bovenste en onderste kamers. Compleet medium (10% FBS), die vele potentiële chemoattractants bevat, wordt in het huidige voorbeeld "chemoattractant-geïnduceerde" invasie (figuur 2) te onderzoeken. Parallelle studies LP9 mesotheelcellen alleen bevestigt dat deze cellen in minimaalvasive dan 2 dagen onder zowel basale of "chemoattractant 'geïnduceerde omstandigheden en werden dus een goede celtype voor gebruik in co-kweek assays met eierstokkanker cellen (Figuren 2A en 2B). Daarentegen eierstokkanker sferoïden gegenereerd met een van de drie cellijnen vertoonden het vermogen om binnen te dringen naar een chemoattractant (FBS) (figuren 2A-2C). Het belangrijkste voordeel van het RTCA realtime instrumenten via traditionele eindpunt testen is dat veranderingen in cel / bolvormige gedrag kan worden gekwantificeerd tijd. Over de 2 daagse test, de KGN, OVCA429 en OVCA433 cellijnen vertoonden alle de capaciteit om binnen te dringen in de richting van een chemoattractant (aangegeven door het verhogen van cel indices) maar lage basale niveaus van invasie (figuur 2C). De cellijnen vertoonden gelijkaardige tarieven van invasie, zoals aangegeven door de evenwijdige hellingen van de curven (figuur 2C); De OVCA429 curve vertoonde een hogere bovenste asymptoot,die een hoger maximaal niveau van invasie aangegeven vergeleken met de andere cellijnen. Bovendien is de cellijnen tentoongesteld verschillen in hun tijd tot aan het begin van de invasie, met de KGN cellen snel invasie van de cel en matrix barrières en de OVCA433 en OVCA429 cellen die 3-5x langer binnen te vallen, respectievelijk (figuur 2D). Belangrijk hun gedrag bij het begin van invasie niet voorspellend voor de totale capaciteit voor invasie (Figuren 2C en 2D). Dit suggereert verschillende inherente capaciteiten van kankercellijnen maar ook kunnen aangeven dat verschillende factoren vroege en late invasieve gedrag van sferoïden regelen.
Figuur 1 Sferoïde generatie en het model van de experimentele opstelling A:.. Images onder fasecontrastmicroscopie van bolletjes vormen in methylcellulose / media (boven) en van de bijbehorende cellijn gekweekt als een monolaag (onder) B:. Schematische toont de RTCA 2 chambered CIM plaat goed opgezet, waarbij voorgevormde eierstokkanker sferoïden worden uitgeplaat op een monolaag van een LP9 mesotheelcellen laag / matrix barrière in de bovenste kamer en media ± FBS als een chemoattractant wordt toegevoegd aan de onderste kamer. Elektroden onder het grensvlak van de kamers 2 maatregel toenemende elektrische impedantie meer cellen binnen te dringen door de barrières naar de onderste kamer C:. Images of KGN sferoïden bovenop de LP9 monolaag onder fasecontrast microscopie (links) of fluorescentiemicroscopie (rechts). Schaal bars = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
.. Figuur 2 real-time eierstokkanker spheroïde invasie gegevens A - B: Representatieve resultaten van een RTCA invasieanalyse uitgevoerd met en zonder FBS in de onderste kamer van een CIM plaat ook. KGN invasie vergeleken met LP9 mesotheelcellen. Resultaten worden getoond als gemiddelde ± SD Cell Index van drievoudige putjes bij 24 uur tijdpunt (A) en over een heel tweedaagse test periode (B) C - D:. Een vergelijking van de invasiecapaciteit van KGN, OVCA429 en OVCA433 cel lijnen weergegeven over een periode van 24 uur (C) en in meer gedetailleerde wijze over een 2,5 uur tijd (D).
Discussion
Binnenvallende eierstokkanker cellen interageren met verschillende celtypen aan het oppervlak van het peritoneum, waaronder fibroblasten, adipocyten, en mesotheelcellen en bidirectionele communicatie tussen de kankercellen en peritoneale cellen wordt gedacht een sleutelrol te vervullen bij de verdere metastasering 2. Wanneer de knie, de hierin beschreven protocol gemakkelijk aangepast aan de studie van deze interacties binnen de peritoneale micromilieu, bijvoorbeeld door de toevoeging van exogene cytokinen, groeifactoren of specifieke remmers voor de bovenste of onderste kamers van de CIM putje of genetische manipulatie van de kanker of peritoneale cellijnen. Bovendien kan deze werkwijze worden toegepast met primaire ovariale tumorcellen vers geoogst uit maligne ascites en / of primaire peritoneale cellen direct inzicht in de regulatorische signalen en cellulaire interacties die de instelling van een metastatische lesie regelen binnen de peritoneale holte krijgen Gebruik van de RTCA instrument om de invasieve capaciteit van enkele cellen of bolvormige deeltjes te meten biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele single eindpunt assays en beeld time-lapse-analyses. Het RTCA instrument meet cellulaire invasie op welbepaalde tijdstippen continu in de loop van een test, die kan uren of dagen. Dit maakt de bepaling van veranderingen van de invasie van de tijd, die de beperkingen van enkele eindpunt assays overwint. Bijvoorbeeld, het onderzoeken van de invasie gegevens uit verschillende kankercellijnen bij een eindpunt (figuur 2), bijv. 3 uur, kunnen leiden tot de verkeerde conclusie dat KGN en OVCA433 cellen waren veel invasief dan OVCA429 cellen. Een ander voordeel van deze technologie is dat het RTCA instrument meet veranderingen in elektrische impedantie. Dit betekent dat de testen kunnen worden uitgevoerd zonder het labelen van cellen met een exogeen agens, die onbedoelde effecten op cel-phen kan hebbenotype of functie. Dit wordt vooral belangrijk bij het bestuderen primaire eierstokkanker cellen afkomstig van maligne ascites, waarmee het noodzakelijk om manipulaties tot een minimum om te voorkomen dat er moleculaire en fenotypische veranderingen die niet reflecterend hun in vivo aard 2. Bovendien wordt het gebruik van de RTCA instrument maakt het verzamelen van kwantitatieve gegevens in real time, die niet alleen voorkomt het tijdrovende analyses geassocieerd met time-lapse microscopie maar maakt ook de snelle bepaling van de belangrijkste experimentele vensters voor assay optimaliseren. Dit is vooral handig bij het vergelijken van de effecten van een aantal factoren op sferoïde invasie, kan als verschillende factoren hun maximale effecten op verschillende tijdstippen of met een sterk verschillende profielen in de tijd uit te oefenen. Hoewel dit protocol is ontvankelijk voor veranderingen (bijvoorbeeld, gebruik van verschillende ECM matrix verschillende kankercellijnen, of verschillend doel cells), indien daarbij is belangrijk op te merken dat verschillende experimentele omstandigheden eerst worden geoptimaliseerd. Bijvoorbeeld, voor de aanvang van studies van sferoïde invasie, het optimale aantal kankercellen / CIM plaat goed te beginnen moet worden bepaald door analyse van het aantal cellen titraties in monolaagkweek. Het optimale aantal bolvormige deeltjes gebruikt per well wordt vervolgens op basis van deze analyse. Bijvoorbeeld, in de huidige werkwijze, Steroiden omvatten ongeveer 3000 cellen per wanneer eerst gegenereerd. Als eerste nummer cel titraties geven aan dat 30.000 cellen in monolaag zijn optimaal voor detectie in invasie analyses, vervolgens 10 bolletjes worden toegevoegd per CIM plaat ook. Bovendien, bij het uitvoeren van co-cultuur experimenten, is het van belang het gedrag van de "doel" cel monolaag bestuderen afzonderlijk om te bepalen of deze cellen zijn inherent invasief, omdat dit de resultaten kunnen verwarren. In het voorbeeld getoond, zijn kanker sferoïden geplateerd bovenop een LP9 cel monolayer, met en zonder FBS toegevoegd aan de bodem en een chemoattractant. Tegelijkertijd worden LP9 cellen alleen gekweekt, onder elke behandeling staat. Ook wanneer het bestuderen van de invasiecapaciteit van cellen en sferoïden, is het ook belangrijk om hun trekkende capaciteiten alsook om de twee gedragingen (bijvoorbeeld invasie vereist proteolytische digestie van een ECM barrière dat migratie niet) onderscheiden onderzocht. Om dit te doen, laat de ECM barrière (stap 3.1.1 - 3.1.3) en het gedrag van de test parallel met de ECM barrière op zijn plaats. De laatste 'invasie' maatregel kan worden gecorrigeerd naar de voormalige 'migratie' maatregel, indien gewenst. Tenslotte moet worden opgemerkt dat de informatie die uit maatregelen elektrische impedantie is beperkt: zodra cellen binnengedrongen in de onderste kamer, kunnen veranderingen in de bevestiging, verspreiding en proliferatie aan de onderzijde van het membraan bijdragen tot veranderingen impedantie reaDings. Daarom is deze werkwijze is het meest informatief wanneer gebruikt in combinatie met andere testen van sferoïde cellevensvatbaarheid, adhesie, migratie en morfologie om bolvormige cel gedrag uitvoerig beoordelen. Bijvoorbeeld, idealiter, om volledig te begrijpen sferoïde-mesotheliale interacties, aparte co-culturen moeten ook periodiek worden afgebeeld onder standaard fase microscopie, zodat kwalitatieve beoordelingen van bolvormige morfologie en gezondheid kan worden gemaakt parallel met kwantitatieve RTCA testen van een invasie. Als de optionele etikettering wordt uitgevoerd, dan is het gedrag van enkele kankercellen kunnen worden onder fluorescentie microscopie bepaald als ze splitsen van de bolvormige en interactie met de ongelabelde mesotheelcellen. Een bijkomend voordeel van fluorescent labelen van de kankercellen bij co-kweken met een tweede celtype is dat het dan mogelijk is om te bevestigen dat alleen de kankercellen zijn binnengedrongen door de cel en ECM barrières.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een CASS Stichting Wetenschap en Geneeskunde Grant; (MB); een National Health & Medical Research Council of Australia Project Grant (KLS, 338516); en door de Victoriaanse regering operationele infrastructuur Support Program (Australië).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4,000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
- Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
- Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6 (2006).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
- Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
- Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
- Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).
