Summary
Eierstockkrebszellinvasion in die Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells ist ein dynamischer Prozess über die Zeit. Mit Hilfe eines Echtzeit-Analysator, kann die invasive Kapazität von Eierstockkrebszellen in einem Sphäroid-Mesothelzelle Co-Kultur-Modell über längere Zeiträume quantifiziert werden, Einblicke in Faktoren Regelung der metastatischen Prozesses.
Abstract
Eierstockkrebs Metastasen durch den Abbau in die Bauchfellflüssigkeit und Dispergieren distalen Stellen innerhalb des Bauchfells. Monolayer-Kulturen nicht genau das Verhalten von Krebszellen zu modellieren innerhalb einer nichthaftende Umwelt, wie Krebszellen in sich zusammenfassen in multizellulären Strukturen, die auf den metastatischen Prozess, indem es an und Eindringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden beitragen. Um diese wichtige Phase von Eierstockkrebs Metastasen, vielzelligen Aggregaten, Sphäroiden oder modellieren, können von etablierten Eierstockkrebszelllinien unter Bedingungen gehalten, nicht anhaftende erzeugt werden. In die Bauchmikroumgebung von Tumorzellen in vivo angetroffen nachzuahmen, wurde ein Sphäroid-Mesothelzellen Co-Kulturmodell etabliert, in dem vorgeformten Kügelchen werden auf einem menschlichen Mesothelzellen Zellmonoschicht überzogen, auf einer extrazellulären Matrix Barriere gebildet. Methoden wurden dann mit Hilfe eines Echtzeit-Zellanalysegerät, um quantitative real durchzuführen entwickeltZeitmessungen der invasiven Kapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen. Dieser Ansatz ermöglicht die kontinuierliche Messung der Invasion über lange Zeiträume, die mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Endpunkt-Assays und mühsamer Bild Echtzeit-Mikroskopie analysiert hat. Kurz gesagt, ermöglicht diese Methode eine schnelle Bestimmung von Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Eierstockkrebs-Zellen eindringende Sphäroid durch Mesothelzellen und Matrix-Barrieren im Laufe der Zeit zu regulieren.
Introduction
Eierstockkrebs hat die höchste Sterblichkeitsrate aller gynäkologischen Krebserkrankungen ein. Weltweit gibt es ~ 230.000 Fälle und mehr als 100.000 Todesfälle durch die Krankheit jedes Jahr ein. Die meisten Patienten (> 75%) werden diagnostiziert, nachdem der Krebs bereits Metastasen gebildet hat, wenn die Behandlung durch erhöhte Resistenz gegen Chemotherapie kompliziert und die Prognose ist schlecht 2. Patienten mit Stadium III-IV Metastasen haben 5 Jahres-Überlebensraten von nur 30-40% 3. Somit besteht ein dringender Bedarf für ein besseres Verständnis der zellulären Verhaltensweisen, um effektiv zu behandeln fortgeschrittener Erkrankung zugrunde liegenden Eierstockkrebsmetastasen.
Das aktuelle Modell von Eierstock-Krebs Metastasen schlägt mehrere Schritte in der metastatischen Prozess, von denen jeder tritt in einer ausgeprägten Mikro welche Auswirkungen auf Tumorverhalten. Metastasierenden Eierstockkrebszellen zunächst aus dem Primärtumors zu vergießen und zu überleben in einer nonadherent Zustand innerhalb der Peritonealflüssigkeit als einzelne Zellen oder dreidimensionale Strukturen vielzelligen, genannt vielzelligen Aggregaten oder Sphäroiden 2,4,5. Zellen, die in Suspension nicht Sphäroide bilden, sind anfälliger für anoikis 2,4,5. Sphäroide auch eine erhöhte Resistenz gegen Chemotherapeutika, Beitrag zur Resterkrankung und nachfolgende Wiederauftreten des Krebses 2,4,5. Ein zweiter kritischer Schritt bei Eierstockkrebsmetastasen ist der Übergang von Zuschlagstoffen aus frei schwebenden Cluster etabliert Sekundärtumoren in der Bauchwand und Netz 5,6. Zell-Zell-und Zell-Substrat-Wechselwirkungen in Aggregatbildung, das Überleben und die Einhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) von der Mesothelzellen Auskleidung des Bauchfells 4-11 hergestellten Verbindung gebracht. Bisher werden diese Prozesse kaum verstanden.
Um die Mechanismen bei der Verbreitung von Eierstockkrebs beteiligt zu definieren, können Sphäroiden Gener seinte an etablierten Tumorzelllinien unter Verwendung von nicht-adhärenten Kulturmethoden, die Aufrechterhaltung Zellen in Suspension entweder durch Zugabe von Methylcellulose zu den Kulturmedien 12,13 oder durch Kultivieren von Zellen auf Low-Befestigungsplatten 2,14. Wenn auf diese Weise kultiviert, montieren Eierstockkrebszellen in multizellulären Aggregaten oder Kügelchen, die ähnlich zellulären, molekularen und biochemischen Eigenschaften denen von Tumor Aggregate in vivo 2,14 gefunden aufweisen. Nach der Bildung kann Sphäroide anschließend von dem nicht anhaftenden Medium geerntet und auf eine Vielzahl von festen Oberflächen für die weitere funktionelle Studien wieder ausplattiert werden. Dies stellt einen Fortschritt gegenüber Assays in Monolayer-Kultur, die nicht genau zu modellieren sie das Verhalten der metastasierenden Eierstockkrebszellen in einem nicht-adhärenten Umgebung wie die intraperitoneale Flüssigkeit.
Die invasive Kapazität von Krebs Sphäroiden in traditionellen Endpunkt-Assays in Boyden-Kammern 2 bewertet 15,16; jedoch ist die Analyse von Zeitreihen-Daten zeitaufwendig und kann subjektiv sein. Hierbei wird eine schnelle, quantitative Methode zur Bestimmung der invasiven Verhalten von Eierstockkrebs Sphäroide in Echtzeit beschrieben. Zunächst wurde ein Sphäroid-Mesothelzelle Modell eingesetzt, der die Bühne von Eierstockkrebsmetastasen stellt, wenn mehrzelligen Sphäroiden befestigen und dringen in die Bauchfellfutter zur sekundären Tumoren bilden. Dann Methodik für eine Echtzeit Zell Analyzer (RTCA, siehe Tabelle Materialien für Firmendaten) wurde angepasst, um quantitative Echtzeit-Messungen der Invasionskapazität von verschiedenen Eierstockkrebszelllinien als Sphäroiden gewachsen und in diesem Modell getestet befragen.
In der RTCA inInstrument, zelluläre Reaktionen werden kontinuierlich über den Verlauf eines Assays durch Messung von Veränderungen der elektrischen Impedanz überwacht wird, ohne die Notwendigkeit einer exogenen Etiketten. Speziell entwickelten Kulturplatten mit Gold beschichteten Mikroelektroden unter einer mikroporösen Membran an der Grenzfläche zwischen den oberen und unteren Kammern eines Kammer 2 gut ("CIM"-Platten) liegt. Die Lage der Elektroden in der unteren Kammer ermöglicht die Messung von Veränderungen in der elektrischen Impedanz als Zellen eindringen oder durch eine ECM ECM / Zellbarriere. Die Membran-Grenzfläche zwischen den 2 Kammern jedes CIM Platte auch zunächst mit der ECM-Komponente von Interesse beschichtet. In der Sphäroid-Mesothelzelle Modellsystem wird die Schnittstelle mit einer Schicht aus Matrigel (siehe Tabelle Materialien für Firmendaten), um die komplexe ECM die Mesothelzellen Auskleidung der Bauchfell zugrunde liegenden imitieren, gefolgt von einem Monolayer der menschlichen Mesothelzellen 'beschichtet Ziel "-Zellen. Schließlich sind die vorgeformten Eierstockkrebs Sphäroiden Anzeigeded. Eierstockkrebs Sphäroid Zellen müssen aktiv durch die Zielzellen Schicht und Matrix eindringen, um die Bodenkammer zu erreichen und elektrische Impedanzmesswerte verändern. Zielzellen allein sind ebenfalls bewertet, um sicherzustellen, dass sie nicht durch die Matrixschicht eindringen und sich in diesem Assay geeignet.
Protocol
1. Vorbereitung der Zellen, Medien und Reagenzien
- Herstellung von Methylcellulose-Medium, enthaltend
- Man löst 1,5 g Methylcellulose in 100 ml steriler Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) (ohne Zusätze) in einem 250 ml-Kolben.
- Die Lösung wird auf Low in einer Mikrowelle für 5 min; kümmern sich um Überkochen zu vermeiden.
- Sobald der Methylcellulose-Pulver ist halb gelöst, fügen Sie ein sauberes Magnetrührer und Medien, um das Volumen auf 125 ml zu nehmen.
- Mischen, Invertzucker, und bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden, gefolgt von Rühren bei 4 ° C über Nacht.
- Teilen Sie die Lösung gleichmäßig in vier 50 ml Zentrifugenröhrchen und für 1,5 Stunden bei 2300 x g.
- Sammeln Sie die klare, hochviskose Überstand (ca. 90-95% der Aktien), aliquoten in sterile 50-ml-Röhrchen, und bei 4 ° C bis zu 3 Monate.
- Kultur und Markierung von Zellen
- Pflegen Eierstock-Krebszelllinien in Monolayer in einem tiUSGABE Kulturbrutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 in geeigneten Wachstumsmedium (DMEM KGN für die Zellen 17 und MCBD110: M199 für die OVCA429 und OVCA433 Zellinien 18) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L ergänzt -Glutamin und 1% Penicillin-Streptomycin.
- Aufrechterhaltung LP9 menschlichen Mesothelzellen in M199: Hams F12-Medium, enthaltend 15% FBS, 10 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und 400 ng / ml Hydrocortison, in einem Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Seed-Zellen in der gewünschten Größe und Kolben wachsen, um etwa 75% Konfluenz. Ernten der Zellen durch Trypsinierung mit 0,05% Trypsin / EDTA, Schleudern bei 186 × g für 5 min, und waschen Zellpellet zweimal mit PBS.
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
- Optional Fluorescent Zellmarkierungsmethode
- Resuspendieren Krebszellen in einer Endkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml in 1 ml vorgewärmtem PBS/0.1% BSA.
- In 2 ul 5 mM Stammzell Trace CSFE Lösung (oder einer anderen Markierung, die bevorzugte Zelle langfristig beibehalten wird), um Zellen in einer Endkonzentration von 10 uM und bei 37 ° C für 10-15 min in einem Wasserbad.
- Die Reaktion wird mit 1 ml eiskaltem Medium mit 10% FBS und Wieder Pellet durch Zentrifugation. Resuspendieren in 10 ml des entsprechenden vorgewärmten Wachstumsmedium (siehe Schritt 1.2.1).
- Samenzellen in einem 75 cm 2 Filter verschlossenen Kolben und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Check-Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass das Niveau der Fluoreszenz-Markierung zum Nachweis ausreichender ist. Sobald Zellen erreichen ca. 75% Konfluenz, Ernte und zählen wie in den Schritten 1.2.3 und 1.2.4 oben.
2. Generation Spheroids in Methylcellulose
- Berechnen Sie das Volumen von Eierstockkrebszellen aus Abschnitt 1 für Sphäroid Generation benötigt (insgesamt 300.000 Zellen werden für jedes volle 96-Well-Platte Experiment erforderlich). Nichtte: Wenn mit verschiedenen Zelllinien als hier dargestellt, können die Zelldichten für einheitliche Sphäroid Generation brauchen, um für jede Zeile optimiert werden.
- Zur Verdünnung der Zellen in Methylcellulose Medien zu berechnen, zunächst subtrahieren Sie den Zellvolumen erforderlich ist (Schritt 2.1) von 15 ml.
- 3 ml Methylcellulose-Stammlösung (um 20% Methylcellulose endgültig) auf ein Volumen von geeigneten Kulturmedium für jede Zelllinie in Höhe von 15 ml minus des Zellvolumens und gründlich durch vorsichtiges Umdrehen mischen.
- In 300.000 Zellen auf die Methylcellulose enthaltenden Medium und gründlich durch vorsichtiges Schwenken gemischt.
- Pipette 150 ul der Zell / Methylcellulose / Media-Mix (für insgesamt 3000 Zellen / Vertiefung) in jede Vertiefung einer 96-Well-Kulturplatte mit konkaven und die Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2 für 1-4 Tage oder bis eine einheitliche Sphäroiden bilden (1 Sphäroid / Vertiefung ist in der Regel beobachtet).
3. RTCA Zellinvasion Assays
NOTE: Impedanzmessungen werden als Zellindex (CI), eine dimensionslose Kennzahl, die eine relative Änderung der gemessenen Zellenimpedanz, die die Zellstatus ausgedrückt. Für die Analyse, Import von Daten in einer Tabellenkalkulation wie Microsoft Excel.
- Plattenvorbereitung
- Arbeiten in Gruppen von 4 Vertiefungen in einer Zeit, 50 &mgr; l Matrix (1:10 verdünnt in Serum-freien Kulturmedien) in jede Vertiefung der oberen Kammer einer 16-Well-Platte RTCA CIM, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist . Entfernen Sie 30 ul Matrix sofort, aber langsam, zu jeder überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Inkubieren Platte bei 37 ° C für 4 Stunden vor der Verwendung in einem Gewebekultur-Inkubator verwendet.
- Hinzufügen von 30 &mgr; l serumfreiem Medium (SFM) für jeden Krebszelllinie mit der oberen Kammer und 160 ul Medium mit oder ohne Serum (nach Ihrer experimentelles Design) in die untere Kammer geeignet.
- Montieren Sie den CIM-Platte, indem Sie auf die untere Kammer in die obere Kammer und equilibraß in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde in einem Gewebekultur-Inkubator.
- Programmierung der RTCA Instrument
- Öffnen Sie das RTCA-Programm und wählen Sie die Registerkarte "Layout". Markieren Sie alle Versuchsbrunnen.
- Klicken Sie rechts auf Brunnen und wählen Sie "Schalten Sie Brunnen '; dann in Versuchsbedingungen und Zellennamen füllen, wie gewünscht.
- Um Schritte oder Teilschritte in das Programm, wählen Sie die "Schedule" Registerkarte, und klicken Sie rechts auf "Add a step '. Der erste Schritt ist eine vorprogrammierte Hintergrund Sweep, die automatisch in das Programm aufgenommen wird einmal "fügen Sie einen Schritt" gewählt wird.
- Geben Sie die gewünschten Programmdetails für Schritt 2 des RTCA-Programm, das bei der Gründung der LP9 Monowerte aufzeichnet. In die Zeitintervalle zwischen Impedanzmessungen indem Sie die Registerkarte "Interval" und Eingabe von '15 min '. In Versuchsdauer durch Auswahl der 'Dauer' Register eind Eingabe einer Zeit zwischen 24.12 h.
- Um weitere Schritte hinzufügen, wählen Sie die "Schedule" Registerkarte und klicken Sie rechts auf "Hinzufügen einen Schritt 'und geben Details der weiteren Schritte, wie oben. Schritt 3 des RTCA-Programm wird das Instrument zu Lesungen während der Sphäroid-Invasion nehmen zu leiten; Geben '5 Minuten 'unter dem' Intervall 'Registerkarte und '48 Stunden' auf der Registerkarte 'Dauer'.
- Wählen Sie 'Teller' in der Menüleiste und sparen.
- Generierung von LP9 Monolayer und Messung der Sphäroid-Invasion
- Zeigen CIM Platte in RTCA Instrument und offenes Programm aus Schritt 3.2. Vor der Zugabe Zellen, wählen Sie "Ausführen" in der Menüleiste und dann "Start". Ein Hintergrund-Sweep wird automatisch durchgeführt werden (Schritt 1 in den RTCA Software-Anweisungen).
- Entfernen Sie die CIM-Platte aus dem Gerät nach dem Sweep Hintergrund und in einer Gewebekultur Kapuze.
- Teller 50,000 LP9 Zellen in 160 ul SFM in die obere Kammer jedes CIM Platte gut suspendiert.
- Die Platte wird in der RTCA Instrument und nehmen Messwerte alle 15 Minuten während der LP9 Monolage wird über Nacht Gründung (Schritt 2 des RTCA-Programm).
- Ernte Krebs Sphäroiden unter Schritt 2 "Generation von Sphäroiden in Methylcellulose 'erzeugt, vor.
- Aseptisch, schneiden 1 mm aus der Spitze von einer 1 ml-Pipettenspitze und verwenden, um sanft und rufen Sie die Inhalte von jedem. Transfer zu einem sterilen Röhrchen.
- Centrifuge Sphäroide bei 120 g für 8 min, und entfernen Methylcellulose enthaltenden Medium durch leichtes Ansaugen.
- Zweimal mit PBS waschen Sphäroiden, Zentrifugieren bei 120 g für 8 min zu pelletieren Sphäroiden nach jeder Wäsche.
- Für jede Versuchs gut resuspendieren insgesamt 10 Kügelchen in 160 ul Medium ohne FBS.
- Pause das RTCA Experiment durch Auswahl und Kontrolle und "Ausführen" aus der Menüleiste# 8216; Pause. Entfernen Sie die CIM-Platte aus dem Gerät, und legen in einer Gewebekultur Kapuze. Absaugen der Medien aus jeder Vertiefung und ersetzen Sphäroid haltigen Medien (10 Kugeln in 160 ul) oder frische Medien für LP9 nur Kontrollvertiefungen.
- Bringen Sie die Platte an der RTCA Instrument. Wählen Sie "Ausführen" aus der Menüleiste und prüfen "Schritt abbrechen". Das Programm wird mit dem nächsten Schritt automatisch zu bewegen. Um das Experiment fortzusetzen, wählen Sie "Ausführen" aus der Menüleiste und prüfen Sie 'Start / Weiter ". Schritt 3 in der RTCA Programm zu initiieren.
- Datenanalyse
- Um das Niveau der Sphäroid Zelle Invasivität bestimmen, subtrahieren, die für die LP9 Monoschicht nur aus den für die Eierstockkrebszelllinien zu jedem Zeitpunkt erhalten, einzelne Messwerte erhalten wurden.
- Um 'Sphäroid-Invasion "des Grundstückes, zu normalisieren alle Werte auf den Zeitpunkt, zu dem die Sphäroide wurden zu der Platte gegeben, mit setting diesem Zeitpunkt auf '0 '.
Representative Results
Ovarialkarzinom Sphäroide können aus vielen Arten von Zelllinien durch Kultivieren derselben in Suspension oder durch Ernten primäre Tumorzellen von malignem Aszites 2,14 erzeugt werden. Hier zwei epithelialen Ovarialkarzinom-Zelllinien, OVCA433 und OVCA429 und ein Eierstock-Granulosazelltumor Tumorlinie, KGN, wurden verwendet, um Sphäroiden (Abbildung 1A) zu generieren. Bei diesem Verfahren werden Zellen in U-förmigen Vertiefungen gezüchtet, während in Medien, die durch Zugabe von Methylcellulose viskos gemacht wurde, suspendiert. Unter diesen Bedingungen sind viele Eierstockkrebszellen weisen eine inhärente Fähigkeit zu aggregieren, um Sphäroide 13 zu bilden. Nach Übernacht-Kultur in Methylcellulose / Medium suspendiert, gebildet alle drei Zelllinien kompakten kugelförmigen Strukturen von ungefähr 400-500 &mgr; m im Durchmesser (Fig. 1A). Währenddessen wird die RTCA CIM-Platte hergestellt, zunächst durch Beschichten des porösen Membranoberfläche mit Matrix und eine konfluente Monoschicht der menschlichen Melothelial Zellen (1B). Einmal gebildet, Sphäroide werden dann auf die vorbereitete CIM-Platte übertragen. Geerntet Krebs Sphäroide auf dem LP9 Monoschicht plattiert und bewertet, wie unten beschrieben. Bilder unter Standard-Phasenmikroskopie (oder unter Fluoreszenzmikroskopie, wenn die optionale Zellmarkierung Schritt folgte) von Parallelkulturen werden in regelmäßigen Abständen in der Interpretation der Daten RTCA (Abbildung 1C) Hilfe genommen.
Es ist informativ, sowohl das Basisniveau der Invasion einer Krebszelllinie, sowie chemoattractant-induzierte Invasion zu beurteilen. Typischerweise wird die basale Invasivität durch Zugabe von SFM auf den oberen und unteren Kammern gemessen. Vollmedium (10% FBS), die vielen möglichen chemischen Lockstoffe enthält, wird in dem vorliegenden Beispiel verwendet werden, um "Chemoattractant-induzierte Invasion (Fig. 2) zu prüfen. Parallelstudien von LP9 Mesothelzellen allein bestätigt, dass diese Zellen minimalinvasive über 2 Tage entweder unter basalen oder "chemoattractant 'induzierten Bedingungen und damit waren eine gute Zelltyp in Co-Kultur-Assays mit Eierstockkrebszellen (2A und 2B). Im Gegensatz dazu zeigten Eierstock erzeugt unter Verwendung einer der drei Krebszelllinien Sphäroide in der Lage, zu einem Chemoattraktor (FBS) (Fig. 2A-2C) einzudringen. Der große Vorteil der Verwendung der RTCA Echtzeit gegenüber herkömmlichen Instrumenten Endpunkt-Assays ist, dass Veränderungen in der Zell / Sphäroid Verhalten kann über die Zeit quantifiziert werden. Mit dem 2-tägigen Versuches, die KGN, OVCA429 und OVCA433 Zellinien zeigten alle die Fähigkeit, zu einem Chemoattraktor (durch Erhöhung Zellindizes angegeben), aber niedrige basale Niveaus der Invasion (2C) einzudringen. Die Zelllinien zeigten ähnliche Raten von Invasion, wie die parallel Steigungen der Kurven (Abbildung 2C) angegeben; jedoch zeigte die Kurve OVCA429 eine höhere obere Asymptote,die eine höhere maximale Höhe der Invasion angegeben im Vergleich zu den anderen Zelllinien. Darüber hinaus zeigten die Zelllinien Unterschiede in ihrer Zeit zu Beginn der Invasion, wobei die KGN-Zellen schnell Invasion der Zell-und Matrixbarrieren und die OVCA433 und OVCA429 Zellen unter 3-5x mehr zu erobern, bzw. (2D). Wichtig ist, dass ihr Verhalten zu Beginn der Invasion war kein Anzeichen für ihre allgemeine Fähigkeit zur Invasion (2C und 2D). Dies legt nahe, verschiedene inhärente Funktionen der Krebszelllinien als auch anzeigen, dass verschiedene Faktoren frühen und späten invasive Verhalten von Sphäroiden zu regulieren.
Abbildung 1 Sphäroid-Generation und das Modell der experimentellen einen Satz:.. IMagier unter Phasenkontrastmikroskopie von Sphäroiden bilden in Methylcellulose / media (oben) und der passenden Zelllinie als Monoschicht (unten) gewachsen. B: Schematische Darstellung der RTCA 2 Kammern CIM Platte gut aufgestellt, in dem vorgeformten Eierstockkrebs Sphäroide auf einer Monoschicht aus einem LP9 Mesothelzellen Schicht / Barrierematrix in der oberen Kammer und Medien ± FBS als chemoattraktive plattiert ist, um die untere Kammer gegeben. Elektroden unterhalb der Schnittstelle der zwei Kammern Maßnahme Erhöhung der elektrischen Impedanz mehr Zellen eindringen durch die Barrieren in die untere Kammer C:. Bilder von KGN Sphäroiden auf der LP9 Mono unter Phasenkontrastmikroskopie (links) oder Fluoreszenzmikroskopie (rechts). Maßstabsbalken = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
.. Abbildung 2 Echtzeit-Eierstockkrebs Sphäroid Invasion Daten A - B: Repräsentative Ergebnisse einer RTCA Invasionstest mit und ohne FBS in der Bodenkammer eines CIM-Platte gut durchgeführt. KGN Zellinvasion auf LP9 Mesothelzellen verglichen. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD Zell Index von drei Vertiefungen an der 24-Stunden-Zeitpunkt (A) und über einen gesamten Zeitraum 2 Tage-Test (B) gezeigt C - D:. Ein Vergleich der invasiven Kapazität von KGN, OVCA429 und OVCA433 Zelle Leitungen über einen Zeitraum von 24 Std. (C) und in detaillierter Art und Weise über einen Zeitraum 2,5 h (D) dargestellt.
Discussion
Invasion der Eierstockkrebszellen interagieren mit einer Vielzahl von Zelltypen an der Oberfläche des Bauchfells, einschließlich Fibroblasten, Adipozyten und Mesothelzellen und bidirektionale Kommunikation zwischen den Krebszellen und Peritonealzellen wird gedacht, um eine Schlüsselrolle bei der Vertreibung der metastatischen Prozess 2 zu spielen. Sobald sie beherrscht, ist die hier beschriebene Protokoll leicht an der Untersuchung dieser Wechselwirkungen innerhalb der Bauchmikroumgebung, z. B. durch die Zugabe von exogenen Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder spezifischen Inhibitoren auf die oberen oder unteren Kammern des CIM-Platte gut oder Genmanipulation der Krebs oder peritonealen Zelllinien. Darüber hinaus kann diese Methode mit primären Eierstocktumorzellen frisch aus malignem Aszites und / oder primäre Bauch Zellen geerntet, direkte Einblicke in die Regulationssignale und zelluläre Wechselwirkungen, die die Einrichtung einer metastatischen Läsion in der Bauchhöhle regieren zu gewinnen verwendet werden Die Nutzung der RTCA Instrument, um die invasive Kapazität der einzelnen Zellen oder Kügelchen messen bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Einzel Endpunkt-Assays und Bild Zeitraffer-Analysen. Der RTCA Gerät misst Zellinvasion in definierten Abständen kontinuierlich innerhalb eines Assays, die Stunden oder Tage sein kann. Dies ermöglicht die Bestimmung von Änderungen in der Geschwindigkeit der Invasion im Laufe der Zeit, die die Grenzen der einzelnen Endpunkt-Assays überwindet. Beispielsweise die Prüfung der Invasion von Daten aus den verschiedenen Krebszelllinien in einem einzigen Endpunkt (Fig. 2), z. B. 3 Stunden, möglicherweise fehlerhaften Ergebnis, dass KGN und OVCA433 Zellen waren viel invasiv als OVCA429 Zellen geführt. Ein weiterer Vorteil dieser Technologie ist, dass die RTCA Gerät misst Änderungen in der elektrischen Impedanz. Dies bedeutet, dass Tests können ohne Markierung von Zellen mit einer exogenen Mittel, die unbeabsichtigten Auswirkungen auf die Zell phen haben könnte ausgeführt werdenOTYPE oder Funktion. Dies wird besonders wichtig, wenn das Studium primären Eierstockkrebszellen von malignem Aszites, mit dem es zwingend notwendig, um Manipulationen auf ein Minimum zu halten, um zu vermeiden, um die Einführung der molekularen und phänotypischen Veränderungen, die nicht repräsentativ für ihre in vivo Natur 2 abgeleitet. Außerdem Nutzung des RTCA Instrument ermöglicht die Erfassung von quantitativen Daten in Echtzeit, die nicht nur vermeidet die zeitaufwendige Analysen mit Zeitraffer-Mikroskopie verbunden, sondern ermöglicht auch die schnelle Bestimmung von Schlüssel experimentelle Fenster für die Assay-Optimierung. Dies ist besonders nützlich, wenn man die Wirkungen einer Reihe von Faktoren auf Sphäroid Invasion, als unterschiedliche Faktoren ihre maximale Wirkung zu verschiedenen Zeitpunkten oder mit sehr unterschiedlichen Profilen über die Zeit zu nehmen. Obwohl dieses Protokoll zugänglich Veränderungen (z. B. Verwendung von verschiedenen ECM-Matrix, verschiedenen Krebszelllinien oder andere Ziel celLS), wenn dies so ist, ist es wichtig zu beachten, dass verschiedene Versuchsbedingungen zunächst optimiert werden. Beispielsweise vor Beginn der Studien der Sphäroid-Invasion, die optimale Anzahl von Krebszellen / CIM Platte sollte auch zunächst durch Assay der Zellzahl Titrationen in Monolayer-Kultur bestimmt werden. Die optimale Anzahl von Sphäroiden pro gut gebrauchen wird dann auf dieser Analyse. Beispielsweise in der aktuellen Methode, Sphäroide enthalten etwa 3.000 Zellen jeweils als erstes erzeugt. Wenn Anfangszellzahl Titrationen zeigen, dass 30.000 Zellen in Monolayer sind optimal für die Detektion in Invasion analysiert, dann 10 Sphäroide pro CIM Platte hinzugefügt. Wenn ferner die Durchführung Co-Kultur-Experimente ist es wichtig, das Verhalten der "Ziel"-Zellmonoschicht getrennt, um zu bestimmen, ob diese Zellen sind von Natur aus invasiv, da dies die Ergebnisse verwechseln studieren. In dem Beispiel gezeigt werden Krebs Sphäroide auf der Oberseite eines Zell LP9 Monola plattiertyer, mit und ohne FBS an der Unterseite hinzugefügt sowie ein chemoattractant. Parallel werden LP9 Zellen allein unter jedem Behandlungszustand kultiviert. Ebenso, wenn die Untersuchung der Invasionskapazität von Zellen und Sphäroiden, ist es auch wichtig, ihre Migrations Kapazitäten, um die beiden Verhaltensweisen (dh Invasion erfordert den proteolytischen Abbau eines ECM-Barriere während der Migration nicht) unterscheiden zu untersuchen als auch. Um dies zu tun, lassen Sie den ECM-Schranke (Schritte 3.1.1 - 3.1.3) und führen den Test parallel mit der ECM-Barriere im Ort. Letztere "Invasion" Maßnahme kann auf der ehemaligen "Migration" Maß korrigiert werden, falls gewünscht. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass die Informationen aus Maßnahmen der elektrischen Impedanz gewonnen begrenzten: einmal Zellen in der unteren Kammer eingedrungen, können Veränderungen in ihrer Befestigung, Verbreitung, und Proliferation auf der Unterseite der Membran auf Veränderungen beitragen Impedanz reaDellen. Daher ist diese Methode sehr informativ, wenn sie in Verbindung mit anderen Tests der Sphäroid Zelllebensfähigkeit, Adhäsion, Migration und Morphologie, um umfassend zu beurteilen Sphäroid Zellverhalten verwendet. Zum Beispiel ideal, um die Sphäroid-mesothelial Wechselwirkungen zu verstehen, separaten Co-Kulturen sollte auch in regelmäßigen Abständen unter Standard-Phasenmikroskopie abgebildet werden, so dass qualitative Beurteilungen der Sphäroid Morphologie und Gesundheit können parallel mit quantitativen Assays RTCA der Invasion gemacht werden. Wenn das optionale Markierungsschritt durchgeführt wird, dann werden die Verhaltensweisen der einzelnen Krebszellen unter Fluoreszenzmikroskopie bestimmt werden, da sie von der Sphäroid zerlegen und interagieren mit den unmarkierten Mesothelzellen. Ein zusätzlicher Vorteil der Fluoreszenzmarkierung, die Krebszellen bei Co-Kultivierung mit einem zweiten Zelltyp ist, dass es dann möglich, zu bestätigen, dass nur die Krebszellen durch die Zelle und ECM Barrieren fallen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch eine CASS Stiftung Wissenschaft und Medizin Zuschuss unterstützt; (MB); a National Health & Medical Research Council of Australia Projekt Grant (KLS, 338516); und von der Regierung von Victoria Operational Infrastructure Support Program (Australien).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4,000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
- Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
- Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6 (2006).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
- Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
- Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
- Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).
