Summary
Periton mezotel zarının içine yumurtalık kanseri hücre işgali zamanla dinamik bir süreçtir. Gerçek zamanlı analiz kullanarak, bir küremsi-mezotel hücresi eş-kültür modelinde, yumurtalık kanseri hücrelerinin invaziv kapasitesi metastatik işlemini düzenleyen faktörleri bakış açıları sağlayan, uzun süreler boyunca ölçülebilir.
Abstract
Yumurtalık kanserleri periton sıvısı içine dökülme ve periton içinde uzak sitelere dağıtılmasıyla metastaz. Kanser hücreleri, doğal olarak takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar istila metastatik sürecine katkıda çok hücreli yapılar halinde toplamak gibi tek tabakalı kültürler doğru, yapışkan olmayan bir ortam içinde, kanser hücrelerinin davranışları modeli yoktur. Yumurtalık kanseri metastazı, çok hücreli agrega, ya da küresel cisimler bu önemli aşama modellemek için, yapışkan olmayan koşullar altında tutulur kurulmuş yumurtalık kanseri hücre hatları oluşturulabilir. In vivo olarak tümör hücreleri tarafından karşılaşılan periton mikro taklit etmek için, küremsi-mezotel ko-kültür modeli küreler, hücre dışı bir matris bariyer üzerinde oluşturulan bir insan mezotel hücre mono tabakasının üzerine plakalanır önceden edildiği kurulmuştur. Yöntem daha sonra kantitatif gerçek yapmak için gerçek zamanlı bir hücre analiz cihazı kullanılarak geliştirilmiştirküremsi olarak yetiştirilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin zaman ölçümleri. Bu yaklaşım, geleneksel uç nokta tahlilleri ve daha zahmetli gerçek zamanlı mikroskobu resim analizleri üzerinde birçok avantajı vardır zaman, uzun süreler boyunca işgalinin sürekli ölçülmesi için izin verir. Kısaca, bu yöntem, zaman içinde mezotel ve matris bariyerleri istila yumurtalık kanseri küremsi hücreler arasındaki etkileşimleri düzenleyen faktörlerin bir hızlı ve tespitine olanak sağlar.
Introduction
Yumurtalık kanseri tüm jinekolojik kanserlerin 1 en yüksek ölüm oranına sahiptir. Dünya çapında, ~ 230.000 olgu nedeniyle her yıl 1 hastalığa 100.000 ölüm vardır. Hastaların çoğu (>% 75) kanser zaten metastaz sonra tedavi daha kemoterapi artan direnci ile komplike olduğunda, tanı ve prognoz 2 kötüdür. Evre III-IV metastatik hastalığı olan hastalar sadece% 30-40 3 5 yıllık sağkalım oranları var. Bu nedenle, etkin bir şekilde ileri hastalığı tedavi etmek amacıyla, yumurtalık kanseri metastazı altında yatan hücresel davranışların daha iyi anlaşılması için acil bir ihtiyaç vardır.
Yumurtalık kanseri metastazı mevcut model, tümör davranışı üzerindeki etkileri farklı bir mikro oluşur, her biri metastaz, çeşitli adımlar önermektedir. Metastaz yumurtalık kanseri hücreleri, başlangıçta primer tümör sitesinden döken ve nonadher hayatta edilirtek hücre ya da üç boyutlu bir çok-hücreli yapılar da peritoneal sıvı içinde ent durum, agregatları ya da çok-hücreli küremsilerin 2,4,5 adlandırılır. Süspansiyon içinde küremsilerin oluşturmazlar hücreler anoikis 2,4,5 karşı daha hassastır. Ayrıca, küremsi kalıntı hastalığı ve kanser 2,4,5 daha sonra yeniden oluşumuna katkıda kemoterapi direnci artış görülmez. Yumurtalık kanseri metastazı ikinci bir kritik adım periton duvarı ve omentum 5,6 bünyesinde kurulan ikincil tümörlerde serbest-yüzen kümelerden agrega geçiştir. Hücre-hücre ve hücre-substrat etkileşimleri agrega oluşumu, hayatta kalma ve periton 4-11 mezotel astar tarafından üretilen hücre dışı matrisin (ECM) uyulması implike edilmiştir. Henüz olarak, bu süreçlerin tam olarak anlaşılamamıştır.
Yumurtalık kanserlerinin yayılmasında rol mekanizmaları tanımlamak için, küremsiler homo olabilirated kültür ortamı 12,13 için metilselüloz ekleyerek ya da düşük tespit kalıpları 2,14 üzerinde hücrelerin kültürlenmesi ile, ya süspansiyon içinde hücrelerin bakımı, yapışmayan kültürü yöntemleri kullanılarak kurulmuştur kanseri hücre hatları. Bu şekilde kültürlendi olduğunda, yumurtalık kanser hücrelerinin in vivo 2,14 bulunan tümör agrega benzer hücresel, moleküler ve biyokimyasal özellikleri gösteren çok-agregatlar ya da küresel cisimler içine monte edin. Oluşmasından sonra, sferoidler, daha sonra yapışmayan ortamından hasat edilebilir ve daha fazla fonksiyonel çalışmalar için katı çeşitli yüzeyler üzerine kaplandı. Bu doğru örneğin intraperitoneal sıvısı olarak bir yapışkan olmayan bir ortam içinde metastaz yumurtalık kanseri hücrelerinin davranışları modeli olmayan tek tabakalı kültürü deneyleri üzerinde bir ilerlemeyi temsil etmektedir.
Kanser küremsi girici kapasitesi Boyden odalarına 2, geleneksel nokta deneylerinde değerlendirilebilir 15,16 işgal ederek mezotel hücre açıklık time-lapse video mikroskopi kullanılarak icat edilmiştir; Ancak, zaman atlamalı verilerin analizi zaman alıcı ve öznel olabilir. Burada, gerçek zamanlı olarak yumurtalık kanseri küremsiler istilacı davranışlarını değerlendirmek için hızlı bir nicel bir yöntem tarif edilmektedir. İlk olarak, bir küremsi-mezotel hücre modeli çok-hücreli küreler, takmak ve sekonder tümörler oluşturmak için peritoneal astar işgal zaman yumurtalık kanseri metastazı aşamasını temsil eden kurulmuştur. Daha sonra gerçek zamanlı hücre Analyzer (RTCA, şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız) için yöntem sferoitlerin olarak büyüdü ve bu modelde test edilen farklı yumurtalık kanseri hücre çizgilerinin invaziv kapasitesinin nicel gerçek zaman ölçümlerini yapmak için uyarlanmıştır.
RTCA Instrument, hücresel tepkileri elektrik empedans değişiklikleri ölçerek eksojen etiketler için gerek kalmadan, bir tahlilin boyunca sürekli olarak izlenir. Özel olarak tasarlanmış kültür levhaları, 2 de odalı ('CIM' plakalar) üst ve alt odalar arasındaki arayüzde bir mikro-gözenekli zarın altında bulunan altın kaplama Mikroelektronlar sahiptir. Hücreler, bir ECM ya da ECM / hücresel bariyeri ile işgal olarak alt bölme içinde elektrotların yer elektrik empedans değişimlerin ölçümü sağlar. Her bir CIM levha kuyunun 2 odaları arasında Zar arayüz ilk çıkar ECM bileşeni ile kaplanır. Küremsi-mezotel hücre modeli sisteminde, arayüz insan mezoteliyalı bir konfluent tek tabaka ardından periton mezotel astar yatan karmaşık ECM taklit etmek Matrigel tabakası (şirket ayrıntılar için malzemeler tabloya bakınız), 'ile kaplanır Hedef 'hücreler. Son olarak, önceden şekillendirilmiş, yumurtalık kanseri olan bir reklam sferoidlerded. Yumurtalık kanseri küremsi hücrelerinin aktif alt bölmeyi ulaşmak ve elektrik empedansı okumaları değiştirmek için hedef hücreler katmanı ve matris işgal gerekir. Kendi Hedef hücreler aynı zamanda matris tabaka boyunca işgal ve bu tahlilde kullanım için uygun olan emin olmak için değerlendirilir.
Protocol
1.. Hazırlanması Hücreler, Medya ve Reaktifler
- Metilselüloz-içeren ortam hazırlanması
- 250 ml'lik bir şişe içerisinde steril Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (hiçbir katkı maddesi), 100 ml metilselüloz 1.5 g çözülür.
- 5 dakika boyunca bir mikrodalga düşük üzerinde çözüm ısıtın; Üzerine kaynar önlemek için dikkat çekmek.
- Metilselüloz toz yarı çözünmüş sonra, 125 ml hacim almak için temiz bir manyetik karıştırıcı ve medya ekleyebilirsiniz.
- , Ters karıştırılır ve bir gece boyunca 4 ° C'de karıştırıldı ve ardından 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
- Dört adet 50 ml tüpler ve 2300 x g 'de 1.5 saat boyunca santrifüje eşit solüsyonu bölün.
- 3 aya kadar 4 ° C'de berrak, yüksek ölçüde zor akışlı, steril bir 50 ml tüpler içine süpernatant (stokunun yaklaşık% 90-95), kısım ve mağaza toplayın.
- Kültür ve Hücrelerinin Etiketleme
- Bir ti içinde tekkat yumurtalık kanseri hücre hatları korumak% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L ile desteklenmiş: 37 ° C, (OVCA429 ve OVCA433 hücre çizgileri için 18 M199 KGN hücreleri 17 ve MCBD110 için DMEM) uygun bir büyüme ortamı içinde,% 5 CO2 de ssue kültürü kuluçka -glutamin ve% 1 penisilin-streptomisin.
- M199 olarak LP9 insan mezotel hücreleri korumak: Hams F12 ortamı 37 ° C'de,% 5 CO2 ile bir kuluçka makinesi içinde% 15 FBS, 10 ng / ml Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve 400 ng / ml hidrokortizon, ihtiva etmektedir.
- Tohum istenen şişe büyüklüğü hücreleri yaklaşık% 75 konfluansa kadar büyür. % 0.05 tripsin / EDTA, 5 dakika boyunca 186 x g sıkma ve iki kez PBS ile yıkayın hücre pelletini kullanılarak hücreler tripsinizasyon ile harmanlayın.
- Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- İsteğe bağlı Floresan Hücre Etiketleme Yöntemi
- Önceden ısıtılmış PBS/0.1% BSA, 1 ml 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda yeniden süspanse kanser hücreleri.
- 5 mM stok Cep Tr 2 ul ekleyinace CSFE çözeltisi (veya uzun süreli muhafaza edilir, diğer tercih edilen hücre etiket) 10 uM bir nihai konsantrasyonda hücrelere ve bir su banyosu içinde 10-15 dakika 37 ° C'de inkübe edin.
- Santrifüj ile,% 10 FBS ve yeniden topak içeren buz gibi soğuk 1 ml ortam maddesi ile reaksiyonu söndürün. Uygun büyüme ortamı, önceden ısıtılmış 10 ml içinde süspanse (adım 1.2.1 bakınız).
- 37 ° C'de, 75 cm 2 filtre-kapaklı bir şişeye ve Tohum kültürü hücreleri,% 5 CO2.
- Floresan etiketleme seviyesinin tespiti için yeterli olduğunu doğrulamak için bir floresan mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hücreler yaklaşık% 75 konfluensisinin, hasat ulaşmak ve adımlar 1.2.3 ve üzeri 1.2.4 olarak saymak bir kez.
Metilselülozda küremsi 2.. Üretimi
- (300000 hücre toplam her biri tam 96 oyuklu bir plaka deney için gereklidir) küremsi oluşturulması için gerekli Bölüm 1 yumurtalık kanseri hücre hacmini hesaplar. Hayırte: Burada sunulan farklı hücre hatları kullanılarak eğer, üniforma sfero üretimi için hücre yoğunlukları her hat için optimize edilmesi gerekebilir.
- Metilselüloz ortam içinde hücrelerin seyreltme hesaplanması için, ilk olarak 15 ml (adım 2.1) gerekli olan hücre hacmini çıkarın.
- , Her bir hücre hattı için kültür ortamı, uygun bir hacme kadar 15 ml eksi hücre hacmine eşit (son% 20 metilselüloz olmak için) ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırın metilselüloz stok çözeltisinden 3 ml ilave edilir.
- Metilselüloz içeren ortama 300,000 hücreleri ekleyin ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırılmıştır.
- 37 ° C'de 96 oyuklu bir içbükey alt kültür plakasının ve kültür her oyuğuna (3,000 hücre / kuyu olmak üzere toplam), hücre / metilselüloz / media karışımı pipetle 150 ul,% 5 CO2 1-4 gün boyunca veya üniforma spheroids (1 sfero / iyi tipik olarak izlenmektedir) oluşturmak kadar.
3.. Rtca Hücre Invasion Tahliller
HAYIRTE: Empedans okuma hücre içeriği (CI), hücre durumunu temsil eden ölçülmüş hücre empedans göreceli değişimdir boyutsuz bir parametre olarak ifade edilmiştir. Microsoft Excel gibi bir elektronik tablo içine bir analiz için, ithalat verileri,.
- Tabaka preparasyonu
- Her seferinde 4 kuyu gruplar halinde, toplam yüzey alanı kapalı olduğundan emin olmak için bir 16-çukurlu RTCA CIM plakanın üst bölmesinin her oyuğuna (serum içermeyen kültür ortamı içinde 1:10 seyreltilmiş) 50 ul matris ekleme . Herhangi bir aşırı sıvı kurtulmak için, yavaş yavaş hemen matris 30 ul çıkarın ama.
- Bir doku kültürü inkübatörü içinde, kullanılmadan önce, 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Her bir kanser hücresi, üst bölmeye hattı ve alt bölmeye (deneme tasarım göre) veya serumsuz ortam için uygun 160 ul serum içermeyen ortam (SFM) 30 ul ekle.
- Üst bölme ve equilibr içine alt bölmeyi tıklayarak CIM plaka montebir doku kültürü inkübatörü içinde, 1 saat için bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde yedi.
- Rtca Enstrüman Programlama
- Rtca programını açın ve 'Düzen' sekmesini seçin. Tüm deneysel kuyu vurgulayın.
- Sağ kuyular tıklayın ve 'kuyu üzerinde açın' seçeneğini; istediğiniz gibi sonra deneysel koşullar ve hücre adlarında doldurun.
- , Programa adımları veya alt basamakları eklemek 'bir adım Ekle' 'Zamanlama' sekmesini ve sağ tıklayın seçin. İlk adım seçilir 'bir adım eklemek' bir kez otomatik olarak programa dahil olan önceden programlanmış bir arka plan süpürme vardır.
- LP9 tek tabaka kurulması sırasında okumaları kaydeder Rtca programı, Adım 2 için istenen program ayrıntılarını girin. '' Interval'ın 'sekmesini seçip '15 dk girerek empedans okumaları arasındaki zaman aralıklarını ekleyin. 'Süre' sekmesine gelin seçerek deneysel süre ekled 12-24 saat arasında bir zaman giriyor.
- Sonraki adımları eklemek için, 'bir adım Ekle' 'Zamanlama' sekmesini ve sağ tıklayın seçin ve yukarıdaki gibi, ilave adımların ayrıntılarını girin. Rtca programın Adım 3 sfero işgali sırasında okuma almak için aracı yönlendirecektir; 'Süre' sekmesi altında Interval'ın 'sekmesi ve '48 saat' altında ''5 dakika girin.
- Menü çubuğundaki 'Plaka' seçeneğini seçin ve kaydedin.
- Sferoid Invasion LP9 Monolayer ve Ölçüm Üretimi
- Yukarıdaki Adım 3.2 'den Rtca enstrüman ve açık olan programda CIM plaka koyun. Önce hücreler ekleyerek seçin menü çubuğunda 'Yürütme' ve ardından 'Start'. Bir arka plan süpürme otomatik (Rtca yazılım talimatları Adım 1) yapılacaktır.
- Bir doku kültürü kaputu arka süpürme ve yerine aşağıdaki cihazdan CIM plakasını sökün.
- Plaka 50,000 LP9 hücreler her CIM plakanın üst bölmesine 160 ul SFM içinde süspansiyon haline getirildi.
- Rtca enstrüman plaka koyun ve LP9 tek tabaka (Rtca programın Adım 2) bir gecede kurulması ise bilgi okunması her 15 dakika sürer.
- Hasat kanser sferoidler, yukarıda, Aşama 2 'Generation metilselülozda küremsi' altında elde.
- Aseptik, 1 ml pipet üst kapalı 1 mm kesilmiş ve hafifçe de her içeriğini almak için kullanın. Steril bir tüpe aktarın.
- Santrifüj 8 dakika boyunca 120 x g küremsi ve hafif aspirasyonla metilselüloz içeren ortam çıkarın.
- Her yıkamadan sonra sferoidler peletleştirmek için 8 dakika boyunca 120 x g'de santrifüje tabi tutarak, PBS ile iki kez daha küremsilerin yıkayın.
- Her deney için, kuyu, FBS'siz ortamda 160 ul içinde 10 sferoitlerin bir toplam tekrar süspansiyon.
- Menü çubuğundan 'Yürütme' seçme ve kontrol tarafından Rtca deneyi Pause# 8216; 'Pause. Aletten CIM plakasını çıkarın ve bir doku kültürü kaputu yerleştirin. Her bir kaynağı havalandır gelen ortam dışı ve LP9-sadece kontrol yuvaları için küremsi içeren bir ortama (160 ul içinde 10 küreler gibi) ya da taze ortam ile değiştirin.
- Rtca cihaza plaka dönüş. Menü çubuğundan 'Yürütme' ve 'adım durdurun' işaretleyin. Program otomatik olarak bir sonraki adıma hareket edecek. Denemeyi sürdürmek için, menü çubuğundan 'Yürütme' ve 'Start / Devam' işaretleyin. Rtca programda Adım 3. başlatacaktır.
- Veri Analizi
- Küremsi hücre invaziv seviyesini belirlemek için, her bir zaman noktasında sadece yumurtalık kanseri hücre çizgileri için tek tek elde edilen okumalardan LP9 tek tabaka için elde edilen değerleri çıkarılır.
- 'Işgaline küremsi' çizmek için, S, sferoidler plakaya ilave edildi hangi bir zaman noktasında tüm değerleri normalize'0 'o zaman noktasını etting.
Representative Results
Yumurtalık kanseri sferoidler süspansiyon içinde kültürlenmesi ile veya habis ascites 2,14 birincil tümör hücrelerinin hasat hücre hatlarının çok türde üretilebilir. Burada iki epitelyal yumurtalık kanseri hücre kuşakları, OVCA433 ve OVCA429 ve bir yumurtalık tümörü granüloza hücre hattı, KGN, sferoidler (Şekil 1A) oluşturmak için kullanılmıştır. Metilselüloz ilavesiyle viskoz yapılmıştır ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş ise, bu yöntemde, hücre U-tabanlı bir kuyu kültürlenmiştir. Bu koşullar altında, bir çok yumurtalık kanser hücreleri sferoidler 13 oluşturmak üzere bir araya getirmek için bir doğal yeteneğini sergilerler. Metilselülöz / ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş, gece boyunca kültürün ardından, üç hücre çizgileri çap olarak yaklaşık 400-500 mikron (Şekil 1A) küçültülerek küremsi yapılar oluşturulur. Bu arada, RTCA CIM plakası ilk olarak matris ve insan mes sonra konfluent tek tabaka ile geçirgen membran arabirimi kaplanmasıyla hazırlanır,othelial hücreleri (Şekil 1B). Bir kez oluştuktan sonra, sferoidler sonra hazırlanan CIM plakasına aktarılır. Hasat kanser sferoidler LP9 tek tabaka üstüne kaplama ve aşağıda açıklandığı gibi değerlendirilir. Paralel kültürlerin (isteğe bağlı hücre etiketleme adım takip edildi ise veya floresan mikroskobu altında) standart faz mikroskobunda Görüntüler Rtca verilerin yorumlanması (Şekil 1C) yardım etmek için periyodik olarak alınır.
Bu, bir kanser hücre hattının işgal bazal seviyesi, hem de kimyasal çekici kaynaklı işgali hem de değerlendirmek için bilgilendirici. Tipik olarak, invaziv bazal hem üst hem de alt bölmelere SFM eklenmesi ile ölçülür. Birçok potansiyel kemo-çekiciler içeren komple ortam (% 10 FBS), 'kemoatraktan kaynaklı' işgaline (Şekil 2) incelemek için, mevcut örnekte kullanılmıştır. Tek başına LP9 mezotel hücreleri paralel çalışmalar, bu hücrelerin minimal olduğunu doğruladıvasive böylece bazal ya da 'kemoatraktan' neden olduğu koşullar altında ve ya da 2 gün boyunca yumurtalık kanseri hücreleri ile ortak kültür analizleri içinde kullanmak için iyi bir hücre tipi olan (Şekil 2A ve 2B). Bunun aksine, üç hücre çizgilerinin herhangi biri kullanılarak elde yumurtalık kanseri sferoidler kemoatraktan (FBS) (Şekil 2A-2C) doğru işgal kapasitesi sergilemiştir. Geleneksel uç nokta deneyleri üzerinde Rtca gerçek zamanlı araçları kullanmanın büyük avantajı hücre / sfero davranış değişiklikleri zamanla ölçülebilir olmasıdır. 2 gün deneyi boyunca, KGN, OVCA429 ve OVCA433 hücre çizgileri her bir (hücre endeksleri artırarak gösterilir) kemoatraktan ancak istilasının düşük bazal seviyeleri (Şekil 2C) doğru işgal kapasitesi sergilemiştir. Eğrileri (Şekil 2C) paralel pistleri ile gösterildiği gibi hücre çizgileri, invazyon benzer oranları sergiledi; Bununla birlikte, daha yüksek bir OVCA429 eğri üst asimptotuna sergiledibu da diğer hücre kuşakları ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir istila maksimal düzeyini göstermektedir. Bundan başka, hücre çizgilerinin KGN hücreleri hızlı bir şekilde (Şekil 2B) sırasıyla daha uzun işgal 3-5x alma hücre ve matris bariyerleri ve OVCA433 ve OVCA429 hücreleri istila ile, invazyon başlangıcı için kendi zamanlarda farklılık sergiledi. Önemlisi, işgali başlangıcında onların davranışları işgali için kendi genel kapasite (Şekil 2C ve 2D) prediktif değildi. Bu, kanser hücre çizgilerinin Farklı doğal özelliklerini göstermektedir değil, aynı zamanda farklı faktörler küremsi erken ve geç invazif davranışları düzenleyebilir olduğunu gösteriyor olabilir.
Şekil 1 experimental Sferoid nesil ve model A yukarı ayarlayın:.. I. Oda metilselüloz / media (üst) oluşturan küremsi faz kontrast mikroskopisi altında bir tek tabaka (alt) olarak yetiştirilen uygun hücre çizgisinin büyücü: şematik RTCA 2 CIM plaka de, yumurtalık kanseri, önceden oluşturulmuş olan kurmak odacıklı gösteriyor sferoidler bir kimyasal çekici olarak da FBS ± üst bölmesi ve ortam içinde LP9 mezotel tabaka / matris bariyerin bir tek tabaka üzerine plakalanmıştır alt bölmeye eklenir. . Faz kontrast mikroskobu (sol) veya floresan mikroskobu (sağ) altında LP9 tek tabaka üstüne KGN küremsiler Görüntüleri: daha fazla hücre alt kamara C engelleri işgal olarak elektrik empedansı artırarak 2 odacıklı önlemin arayüzü altında Elektrotlar. Ölçek bar = 100 mikron. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
.. Şekil 2. Gerçek zamanlı yumurtalık kanseri küremsi istila veri A - B: iyi bir CIM levhanın alt odasına FBS ile ve olmadan yapılan bir RTCA istila tahlilinden Örnek oluşur. KGN hücre istilası LP9 mezotel hücreleri ile karşılaştırılır. Sonuçlar 24 saatlik zaman (A) ve bütün bir iki günlük test süresinde (B) üzerinde üçlü kuyulardan ortalama ± SD Cep Endeksi olarak gösterilen C - D:. KGN OVCA429 invaziv kapasitesinin karşılaştırılması ve OVCA433 hücre 24 saatlik bir periyodun (C) üzerinde ve 2.5 saatlik bir süre (D) üzerinde daha ayrıntılı bir şekilde tasvir hatları.
Discussion
Istila yumurtalık kanseri hücreleri, fibroblastlar, adipositler ve mezotel hücreleri de dahil olmak üzere, periton yüzeyindeki hücre tiplerinin çeşitli etkileşim ve kanser hücreleri ve peritoneal hücrelerinin arasında iki yönlü iletişim metastatik süreci 2 sürüş kilit rol oynadığı düşünülür. Bir kez hakim, burada tarif edilen protokol mikro-peritoneal olan bu etkileşimlerin çalışmaya kolayca adapte edilebilir, örneğin, eksojen sitokinler, büyüme faktörleri ya da CIM plaka ya da genetik manipülasyon üst veya alt hazneye özgü inhibitörlerin eklenmesi ile kanser ya da peritoneal hücre çizgilerinin. Ayrıca, bu yöntem, düzenleyici sinyaller ve periton boşluğu içinde bir metastatik lezyonun yöneten kuruluş hücresel etkileşimler direkt bilgiler edinmek için malign asit ve / veya birincil peritoneal hücrelerden taze hasat edilmiş primer yumurtalık tümör hücreleri ile birlikte kullanılabilir Tek hücre ya da küresel cisimler invaziv kapasitesini ölçmek için RTCA aletin kullanımı, geleneksel tek bir uç nokta tahlilleri ve zaman atlamalı resim analizleri fazla birkaç avantaj sunar. Rtca enstrüman saat veya gün olabilir, bir deneyinde boyunca sürekli belirli aralıklarla hücresel işgali ölçer. Bu tek nokta deneylerinin kısıtlamaların üstesinden zamanla invazyon oranı, değişikliklerin tespitine olanak sağlar. Örneğin, bir tek son nokta (Şekil 2), örneğin, 3 saat sonra farklı kanser hücre hatları işgali verileri inceleyerek, KGN ve OVCA433 hücreler çok daha invaziv OVCA429 hücrelerden daha vardı hatalı sonuca neden olabilir. Bu teknolojinin bir diğer avantajı da RTCA alet elektrik empedans değişiklikleri ölçen olmasıdır. Bu işlemler hücre phen üzerinde istenmeyen etkileri olabilir ki, dışsal bir ajan ile hücrelerin etiketlenmesi olmadan çalıştırılabilir anlamına gelirotype veya fonksiyon. Bu in vivo doğaya 2 yansıtıcı olmayan moleküler ve fenotipik değişiklikler meydana getirilmesini önlemek amacıyla en az manipülasyon tutmak için zorunludur hangi habis asit, türetilen birincil yumurtalık kanser hücrelerinin okuyan bu özellikle önemli hale gelir. Ayrıca, Rtca alet kullanımı zaman zaman atlamalı mikroskopi ile ilgili analizler tüketen önler ama aynı zamanda tahlil optimizasyonu için anahtar deneysel pencere hızla belirlenmesini sağlar sadece gerçek zamanlı, nicel verilerin toplanmasını sağlar. Küremsi istilası üzerinde bir dizi faktöre etkilerini karşılaştırarak, bu özellikle yararlıdır, gibi çeşitli faktörler, farklı zaman noktalarında ya da zaman içinde büyük ölçüde farklı profillere sahip maksimal etkiler de sarf edebilirler. Bu protokol değişiklikler (örneğin, için uygun olmasına rağmen, farklı bir ECM matris, değişik kanser hücresi çizgileri veya farklı hedef cel kullanımıBunu yaparken eğer ls), çeşitli deneysel koşullar ilk optimize edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Örneğin, önceki küremsi invazyon çalışmaları başlamadan, kanser hücre / CIM plakanın uygun sayısı de ilk olarak tek tabakalı kültürü hücre sayısı titrasyon deneyi ile tespit edilmelidir. Oyuk başına kullanımı küremsiler uygun sayısı bu analizlere dayanmaktadır. Ilk oluşturulan Örneğin, mevcut yöntemde, sferoidler, her biri yaklaşık 3000 hücreleri içermektedir. İlk hücre sayısı titrasyon tek tabaka içinde 30,000 hücre analizleri istilasında tespiti için en uygun olan olduğunu göstermektedir, daha sonra 10 sferoidler de CIM tabak başına eklenir. Ko-kültür deneylerini yaparken Dahası, ayrı ayrı bu hücrelerin sonuçları yıkmak olabilir gibi, doğal olarak invaziv olup olmadığını belirlemek için 'hedef' hücre tek tabaka davranışlarını incelemek için önemlidir. Gösterilen örnekte, kanser sferoidler bir LP9 hücre Monola üzerine plakalanırFBS ve olmayan Yer, kemo-çekici olarak da altına ilave edildi. Buna paralel olarak, LP9 hücreler her bir ıslah koşulları altında, tek başına kültürlenir. Hücre ve küremsi istilacı kapasitesini incelemek Benzer şekilde, bu iki davranışları (geçiş yok iken, yani istila bir ECM bariyerin proteolitik sindirimi gerektirir) ayırmak için de kendi kapasitelerini göç incelemek için de önemlidir. Bunu yapmak için, ECM bariyer ihmal (3.1.1 adımlar - 3.1.3) ve yerine ECM bariyer paralel olarak, deneyi yürütmek. Istenirse ikincisi 'işgali' ölçüsü, eski 'göç' tedbire düzeltilebilir. Hücrelerin alt odaya işgal kez, bunların bağlanma, yayma ve zarın alt çoğalmasında bir değişiklik değişikliklere katkıda bulunabilir: Son olarak, bu elektrik empedans ölçümleri elde edilen bilgi kapsamı sınırlıdır dikkat etmek önemlidir empedans readings. Kapsamlı küremsi hücre davranışlarını değerlendirmek amacıyla küremsi hücre canlılığı, yapışması, göç ve morfolojisinin diğer deneyleri ile birlikte kullanıldığında, bu nedenle, bu yöntem en çok bilgilendirici. Küremsi morfolojisi ve sağlık niteliksel değerlendirmeleri istila kantitatif RTCA deneyleri paralel olarak yapılabilir, böylece örneğin, ideal olarak, tam olarak küremsi-mezotel etkileşimleri anlamak amacıyla, ayrı eş-kültür, aynı zamanda standart faz mikroskobu altında periyodik görüntülü olmalıdır. İsteğe bağlı etiketleme aşaması gerçekleştirilir, bunlar sfero gelen, parçalamak ve işaretlenmemiş mezotel hücreleri ile etkileşime, daha sonra bir kanser hücrelerinin davranışları floresan mikroskobu altında belirlenebilir. Ikinci bir hücre tipi ile birlikte kültür sırasında flüoresan kanser hücrelerinin etiketlenmesi bir yararı, sadece kanser hücreleri, hücre ve ECM engelleri işgal onaylamak için zaman mümkün olmasıdır.
Acknowledgments
Bu çalışma CASS Vakfı Bilim ve Tıp Grant tarafından desteklenmiştir; (MB); Avustralya Projesi Hibe Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (KLS, 338516); ve Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı (Avustralya) tarafından.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| xCELLigence RTCA DP Analyser | ACEA biosciences | RTCA DP | |
| xCELLigence CIM plates | ACEA biosciences | 5665817001 | |
| Cell TraceTM CFSE | Molecular Probes | C34554 | |
| Methylcellulose (4,000 centipose) | Sigma | M0512 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11966-025 | |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150067 | |
| Ham's F-12 Nutrient mix | Life Technologies | 11765062 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 100-15 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Trypsin EDTA | Gibco-Invitrogen | 15400-054 | |
| 96-well concave culture plate | Grenier Bio-One | 650185 | |
| LP9 Human mesothelial cell line | Coriell Institute for Medical Research | AG07086 | |
| Growth Factor-reduced Matrigel matrix | BD Biosciences | 354230 |
References
- Ferlay, J., et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN. Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).
- Ahmed, N., Stenvers, K. Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Karst, A. M., Drapkin, R. Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution. J Oncol. 2010, (2010).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression. Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J Transl Med. 4, 6 (2006).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers. Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).
- Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).
- Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro. Ann Anat. 193, 181-184 (2011).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).
- Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, (2012).
- Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis. J Vis Exp. (60), (2012).
- Iwanicki, M. P., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
- Nishi, Y., et al. Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor. Endocrinology. 142, 437-445 (2001).
- Xu, F., et al. The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression. Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).
