Summary
SILAC immunoprecipitation eksperimenter representerer et kraftig middel for å oppdage romanen protein: protein interaksjoner. Ved å la den nøyaktige relative kvantifisering av protein overflod i både kontroll-og testprøver, sanne interaksjoner kan lett skilles fra eksperimentelle forurensninger, og en lav affinitet interaksjoner konservert ved bruk av mindre strenge bufferbetingelser.
Abstract
Kvantitative proteomikk kombinert med immuno-affinitetsrensing, SILAC immunoprecipitation, representerer et kraftig middel for oppdagelsen av romanen protein: protein interaksjoner. Ved å la den nøyaktige relative kvantifisering av protein overflod i både kontroll-og testprøver, kan virke interaksjoner lett kan skilles fra eksperimentelle forurensninger. Lav-affinitets interaksjoner kan bli bevart ved bruk av mindre strenge bufferbetingelser og være lett identifiserbare. Denne protokollen beskriver merking av vevskultur-celler med stabil isotop merkede aminosyrer, transfeksjon og immunoutfelling av en affinitet kodede protein av interesse, etterfulgt av fremstilling for tilførsel til en massespektrometri anlegg. Denne protokollen deretter drøfter hvordan å analysere og tolke dataene som returneres fra massespektrometer for å identifisere cellulære partnere i samspill med et protein av interesse. Som et eksempel på denne teknikken er brukt på idensere proteiner binding til de eukaryote oversettelse initiering faktorer: eIF4AI og eIF4AII.
Introduction
Et viktig skritt i å forstå protein funksjonen er identifikasjon av relevante samspill proteiner. Når slike proteiner er ukjent det finnes en rekke teknikker som er tilgjengelige, hver med sine egne fordeler og ulemper. Disse inkluderer gjær to-hybrid system, mater assays ved å bruke rekombinant protein, så vel som tandem affinitetsrensing eller TAP-merking 1, 2.
En nyere tillegg til disse teknikker er en kombinasjon av affinitets-rensing av et protein av interesse fra en relevant pattedyrcellelinje, etterfulgt av kvantitativ massespektrometri ved hjelp av stabile isotop merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) 3. Dette har fordeler i forhold til gjær to-hybrid tilnærming ved at celle lokalisering og post-translasjonelle modifikasjoner er ikke perturbert, så vel som fordeler fremfor tradisjonelle TAP-merking ved at den er en kvantitativ snarere enn kvalitativ metode som tillater brukeren å readily skille ikke-spesifikt samspill proteiner og forurensninger, fra vertsfaktorer som binder spesifikt. Videre, som et eksempel er vanligvis analysert helhet, heller enn som individuelle proteinbånd, proteiner av interesse ikke er maskert av tilsvar migrere proteiner på en gel, og heller ikke har de vanligvis være til stede i tilstrekkelige nivåer for å være synlig etter fargingen, noe som fører til økt antall selvsikkert identifiserte proteiner fire.
For å demonstrere denne teknikken, GFP fusjon av det nært beslektede eukaryote oversettelse initiering faktor eIF4AI og eIF4AII at andelen over 90% aminosyre identitet ble undersøkt av SILAC-immunoprecipitation kvantitative proteomikk. Humant eIF4AI og II ble klonet inn i pEGFP-C1 til å danne et fusjonsprotein hvor GFP er fusjonert til N-terminus av eIF4A. For å unngå behovet for å generere stabile cellelinjer transient transfeksjon ble brukt til å levere disse konstruerer til stabile isotopen merket 293T celler.
(fig. 1).
SILAC immunoprecipitation muliggjør identifisering av ikke bare direkte interaksjon, men også lav affinitet eller indirekte interaksjoner med protein komplekser fire. Ved hjelp av dette system, eIF4AI og II immunoutfellinger tillates reproduserbar og trygg identifisering av den primære bindingspartner eIF4G (isoformer I / II og III) 5, så vel som indirekte interaksjon med eIF4E, og en rekke komponenter av eIF3 kompleks.
Protocol
En. Generation og passering av SILAC-merket Cell Lines
Merk: bruk av Trypsin-EDTA må unngås i alle stadier av aging og utarbeidelse av eksperimentelle prøver for analyse som trypsin kan inneholde umerkede aminosyrer, noe som ville føre til ufullstendig merking av prøver.
- For å fremstille en flaske SILAC media til en 0,5 ml alikvot av en hensiktsmessig SILAC-merket arginin (84 mg / ml i PBS) og lysin (146 mg / ml i PBS) til en 500 ml flaske Arg / Lys fri DMEM (innehold L-glutamin).
- Deretter tilsett 50 ml av dialysert FBS og 5 ml penicillin / streptomycin til 500 ml flaske.
Merk: HEK 293T-celler (ATCC) opprettholdes i DMEM medier som mangler arginin og lysin og supplert med lys (R0K0), middels (R6K4) eller tunge (R10K8) aminosyrer, dialysert føtalt bovint serum (10 kDa cutoff) og penicillin / streptomycin. Cellene må opprettholdes i mediet i minst 5 celledelinger for å sikre fullstendigmerking. I de fleste tilfeller celler kan lett merkes på ≥ 2 uker. - Å dele celler for aging, bør cellene løsner fra monolaget ved å treffe kolben. Alternativt omfatter bruk av celleskraper eller ved hjelp av enzym-fri, PBS-basert celle dissosiasjon buffer.
Merk: For å spare media, bør cellene bli passaged i T25 kolber og større celle tall genereres bare umiddelbart før et eksperiment. - 24 timer før transfeksjon av celler, frø 3,5 x 10 6 SILAC-merkede celler i en enkelt 10 cm2 skål for hver eksperimentell tilstand under undersøkelse.
2. Transfeksjon av merkede celler med pEGFP-fusion konstruerer
- Fjern materialet fra cellene og erstatte den med 9 ml antibiotikafrie SILAC DMEM (Lett, middels eller tung) media.
Merk: Antibiotika bør ikke legges til media siden de kan forstyrre effektiviteten av liposomprøvene basert transfeksjon reagenser. - Forberedelsere en blanding av 10 mikrogram av den aktuelle plasmid (epEGFP-C1, pEGFP-eIF4A-I, pEGFP-eIF4A-II) i 500 mL av antibiotika-fri SILAC DMEM og bland det med 500 mL av antibiotika-fri SILAC DMEM inneholder 10 mL av transfeksjon reagens (f.eks Lipofectamine 2000). Bland reaksjonen grundig ved å pipettere opp og ned flere ganger.
- Inkuber reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 20 min og deretter legge dråpevis til cellemonolaget. Rock platen forsiktig fra side til side.
- Inkuber de transfekterte celler ved 37 ° C og 10% CO2 i 24 timer.
Merk: Ved ekspresjon av et protein av interesse resulterer i noen åpenbar toksisitet, så kan det være nødvendig å redusere mengden av plasmid transfekteres og / eller varigheten av den etterfølgende uttrykk for.
Tre. Høst cellelysater
- Slakte celler fra fatet i iskald PBS ved hjelp av en celle skrape. Samle-celler ved sentrifugering ved 220 x g, 476; ° C i 5 min. Vask cellene en ytterligere 3x i 10 ml iskald PBS.
- Resuspender cellepelleten i 200 ul celle-lyseringsbuffer (10 mM TrisCl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP40) inneholdende fersk tilsatt protease inhibitor cocktail III på 1x konsentrasjon og RNase cocktail (valgfritt) i 5 mL per ml.
Merk: For proteiner med kjent nukleinsyre bindende aktivitet, kan det være nødvendig å tilsette nukleaser til lysatet før utfelling. I de tilfeller hvor nuklease tilsettes, må prøvene inkubert på is i 30 min på is, med pipettering hvert 10 min. Trekke total nukleinsyre fra en liten brøkdel av prøven og analyse ved agarose-gel-elektroforese kan teste effektiviteten av nuklease. - Sentrifuger prøvene ved 13 000 x g, 4 ° C i 10 min beholder supernatanten som det oppløselige celle-lysat.
- Konsentrasjonen av cellelysat bør vurderes ved BCA-analyse i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk lyseringsbuffer inneholdende protease-inhibitor cocktail III for å normalisere proteinkonsentrasjon i et sluttvolum på 500 pl.
- Juster volumet til 1 ml med tilsetning av 500 ul fortynningsbuffer (10 mM TrisCl / pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) inneholdende protease inhibitor cocktail III på slutt 1x konsentrasjon. En 50 ul aliquot av prøven bør beholdes som prøveinngang og lysatet holdt på is mens fremstilling av anti-GFP-perler (som GFP-felle).
Merk: Vanligvis utbytter varierer fra 1 til 3,5 mg av protein i det endelige 1 ml prøve. Mens de ovennevnte buffere er egnet for mange proteiner av interesse, for andre, kan det være nødvendig å modifisere bufferkomponenter for å sikre at agnet proteinet oppløseliggjøres og å opprettholde protein-protein interaksjoner. Mulige endringer omfatter bufringsmidlet (Phosphate, HEPES), saltkonsentrasjon (150-500 mM), valget av vaskemiddel, eller andre additiver.
4. Binding til Anti-GFP Perler
- Kort vortex vulsten oppslemmingen for å resuspendere kulene. Ved hjelp av en 200 mL pipette med slutten avskåret, overføre 25 mL av perler per prøve til et nytt rør.
Merk: Brukeren må forberede perlene for en enkelt SILAC eksperiment som en Mastermix å minimere sample-to-sample variasjon. - For hver 25 pl av vulsten oppslemmingen, tilsett 20 volumer (1500 ul pr 75 ul slurry) med fortynningsbuffer, og sentrifuger kulene ved 2700 xg i 5 min. Deretter vaske perlene ytterligere 2x i 20 volumer av fortynningsbuffer.
- Tilsett 100 mL fortynningsbuffer per 25 mL perle slurry. Ved hjelp av en 200 mL spiss med enden avskåret, overføre 85 ul av denne resuspendert oppslemning til hver av de SILAC-merkede prøver fra trinn 3.6.
- Inkuber prøvene med perler på en rotator ved 4 ° C i 2 timer.
5. Vasking, Elueringen, og preparering av prøver for MS Analysis
- Sentrifuger prøvene ved 2700 xg, 46, C i 5 min. 50 pl av supernatanten bør beholdes som den ubundne prøven, mens resten av supernatanten kastes.
- 1 ml fortynningsbuffer bør tilsettes til hvert rør for å resuspendere kulene og prøven sentrifugert ved 2700 x g, 4 ° C i 5 min. Supernatanten må kasseres. Dette bør utføres to ganger.
- Eluere proteinet fra kulene ved tilsetning av 50 ul av 2 x SDS loading buffer, og oppvarming ved 95 ° C i 10 min. Pellet perlene ved sentrifugering ved 2700 x g i 2 min ved 4 ° C
- Ta vare på supernatanten i prelubricated rør, hvor den kan deretter lagres ved -80 ° C inntil behov. For innsending til en massespektrometri anlegget, bland merkede prøver 01:01:01 (f.eks, 10 mL av hver) og sende den blandede prøven.
Note: På dette tidspunkt prøver kan testes ved western blot, sølv-farging eller andre midler for å teste for interaksjon med kjente / ukjente bindingspartnere. Et eksempel er gitt i figurure 2 viser den spesifikke bindingen av en kjent interaksjon partner - eIF4G ved western blot, og utseendet av sølvfargebånd som er tilstede i materprøver fra et protein av interesse, men ikke med kontrollprøven. - Send inn prøven for LC-MS/MS analyse.
Merk: en gang fornøyd med at et kodet protein av interesse er vellykket bindende interaksjonspartnere, like volum av hver merket prøve (lys, medium og tung) er kombinert og sendt inn for LC-MS/MS analyse. Det er vanlig å sende 30 pl totalt av en IP-prøven for analyse. Dette ville innebære å blande 10 ul av Lys-merkede prøve med 10 ul medium-merket og 10 mL tunge-merkede prøver for å gi en 30 pl totalt.
6 Dataanalyse I:. Forstå Resultater, og fjerning av lav-tillit Identifikasjoner
Merk: En liste over kolonneoverskriftene returneres av Proteome Discoverer programvare er gitt i tabell 1 Dif.lige programvare (f.eks MSQuant, MaxQuant) vil returnere ulike overskrifter, men bare en undergruppe av disse er nødvendig for analyse og disse er felles for de ulike programvarepakker. Data bør alltid inneholde en tiltredelse nummer for hvert protein identifisert, forholdet er å sammenligne hver prøve ratio (lys vs medium, lys vs tung, medium vs tung etc), antall unike peptider identifisert, og noen form for falsk positiv rate eller tillit indikasjon.
- Før du går gjennom dataene, først kopiere rådata til et nytt regneark. Fra dette regnearket fjerne alle kolonner unntatt de gir sjonsnummer, antall unike peptider, forholdstall sammenligne prøvene, ratio variasjon, og proteinet beskrivelse. Hvis replica eksperimenter ble utført, bør disse slås sammen til én enkelt Excel-fil, med hvert forsøk vises på en egen fane.
Merk: Lav tillit data inneholder proteiner identifisert av bare en enkelt unik peptid, og de wher kvantifisering var ikke mulig. - Bruk utmerker '' liksom 'funksjon for å bestille data med antall peptider og fjerne oppføringer for proteiner mangler mer enn ett peptid. Deretter sortere etter forholdet og fjerne proteiner som mangler SILAC forhold (unquantified proteiner).
- Konverter SILAC forholdstall til en logg to verdier ved hjelp av formelen: '= log (SILAC Ratio, 2)', hvor 'SILAC Ratio "er byttet ut med celle identifikator.
Merk: Når en SILAC forhold resulterer i noen data for proteiner som viser en reduksjon i mengde å være begrenset til verdier mellom 0 og 1, er det vanlig å konvertere en SILAC forholdet til en logg 2 SILAC forhold, da dette betyr at begge proteiner øket eller redusert et eksempel er representert på en logg skala der to eller -2 representerer en 4-fold økning eller reduksjon i overflod, og 3 eller -3 en 9-fold økning eller reduksjon i overflod hhv. Etter denne transformasjonen, må dataene som passer inn i et Gaussian fordeling sentrert rundt en stokk 2 SILAC forhold på 0. Et eksempel på dette er gitt i figur 3.. - Skape nye kolonner i excel-filen og beregne log 2 SILAC forholdstall for alle eksempel / mock kolonner. For konvertering av en mock / prøve forholdet til en prøve / mock ratio, bruke formelen: "= 1/ratio"
7 Dataanalyse II:. Velge høyt sikkerhetsnivå Interaksjoner for videre studier
- Åpen Graphpad Prism, velg Ny> Datatabell og graf ... Velg 'kolonne' fra listen på venstre side av vinduet, og velg Enter / Import data> Enter replica verdier, stablet inn i kolonner alternativer. Trykk "Opprett".
- Velg og kopier en gitt log 2 Sample / Mock SILAC ratio kolonnen fra Excel-regneark i den nye Prism-filen.
- Klikk på dropdown menyen Sett inn og velg 'Ny analyse'. Under kolonne analyse velger 'Frekvensfordeling '. Holde standardvalgene klikk 'OK'.
Merk: Dette trinnet genererer et histogram som viser antallet av proteiner som er identifisert ved et gitt forhold. Dette bør danne en Gaussisk fordeling. - I 'Resultater' mappe et nytt 'Histogram' seksjonen vil ha blitt generert. Velg frekvensfordeling delen.
- Klikk på dropdown menyen Sett inn og velg Ny analyse> XY> Ikke-lineær regresjon (kurvetilpasning). Klikk på 'Gaussian distribusjon "og klikk OK.
Merk: Dette trinnet passer en kurve til de frekvensdistribusjons data generert i trinn 7.3, gir verdier som senere kan brukes til å beregne terskler for betydning. - I resultatvinduet som vises, er gjennomsnitt og standardavvik gitt. Generere en terskel ved å legge til 1,96 standardavvik til gjennomsnittet.
Merk: Disse verdiene representerer gjennomsnittet og standardavvik av Gauss distribution, ikke den totale datasettet. 1,96 standardavvik ville plassere en terskel på 95% tillit grensen (p ≤ 0,05). 2.58 SD vil gi 99%, og 3,3 SD 99,9%. Terskelen må bestemmes individuelt for hver kopi eksperiment som det kan variere.
8 Dataanalyse III:. Flette Replica datasett
Merk: For å være trygg på å identifisere interaksjonspartnere en typisk SILAC nedtrekk eksperiment bør helst utføres tre ganger, med middels og tunge merkede prøver byttet for en av de gjentakelser å kontrollere for eventuell effekt av media på resultatene. Et protein som viser seg som i samspill i det minste to av de tre forsøkene med "switched'-Reklame prøven ideelt sett representerer en av disse, er en høy grad av sikkerhet interaksjon.
- Gå tilbake til Excel-fil, oppretter du en ny fane som heter "Sammen". Etiketten kolonne A 'Tiltredelse "og kopiere alle tiltredelses tall fra hver ot de enkelte eksperimentene i dette enkelt kolonne.
- Velg 'Data' kategorien, og deretter på 'fjerne duplikater alternativet.
- Lag kolonner for de SILAC forholdstall, og forholdet variasjon fra hvert forsøk samt for protein navn / beskrivelse kolonne.
- I beskrivelsen kategorien, bruke FINN.RAD formelen for å samle beskrivelsen av hver sjonsnummer. Dra formelen nedover kolonnen for å fylle på protein beskrivelse. FINN.RAD formelen er: "= FINN.RAD (AccessionNo, WheretoLook, ColumnsAccross, False)", der: AccessionNo er $ aX med X er radnummeret WheretoLook er "Name kategorien Experiment" The $ en $ 2:.! $ Y $ Z der Y og Z er nederst i høyre del av data i regnearket blir referert. ColumnsAccross er antall kolonner på tvers fra tiltredelse number i kolonne A en ønsket verdi ligger.
Merk: For eksempel, dersom Accession nummer er i kolonne A, og dataene for interesse ligger i kolonne E. Verdien her vil være 5 (kolonne A som teller 1). Som tiltredelses tallene ble samlet i trinn b, er det mest sannsynlig at FINN.RAD ikke vil innhente alle nødvendige navn fra ett eksperiment. Hvor den returnerer N / A, endre formelen for å få beskrivelsen fra hvert forsøk igjen før alle beskrivelsene er ervervet. - For å markere samspill proteiner i det kombinerte datasettet, velger du hver ratio kolonne individuelt og klikk på fanen Hjem, etterfulgt av Betinget formatering> Merk celle regler> Flere regler.
- Velg stil "Classic". Formater bare celler som inneholder 'Cell verdi', 'Større enn eller lik ". I boksen skriver i 1,96 standardavvik verdi, og klikk på 'OK'.
- Vurdere forholdet variasjon for hver positiv samhandling. Hvis trekke% Div.iability ville slippe en "hit" under grenseverdien, bør dette behandles med forsiktighet.
Merk: Dette representerer hvor konsekvent de enkelte forholdstall for hvert peptid som til sammen utgjør en proteiner 'SILAC forholdet er, og blir gitt som en prosentandel. Når forholdet variasjonen er tatt hensyn til, og et protein gir en SILAC ratio over terskelen, representerer dette proteinet en hit. Hvis forholdet variasjonen gir et område som faller under sperregrensen, den "hit" kan representere en forurensning. - Gjenta dette for hver av de resultater kolonnene og sammenligne tvers eksperimenter. Uthevede proteiner identifisert i to eller flere eksperimenter representerer en høy tillit samhandling.
Merk: Avhengig av databasen brukes til å tilordne protein tiltredelses tall, i forskjellige eksperimenter et protein kan ha blitt identifisert under en annen, eller til og med flere tiltredelses tall. Det er viktig å kontrollere denne for å sikre at proteinene ikke blir utilsiktet utelatt.
Representative Results
I et typisk eksperiment SILAC nedtrekk, er det store flertall av identifiserte proteiner (> 90%) representerer forurensninger, så vel som proteiner som binde ikke-spesifikt til affinitetsoverflaten matrise, og dette er illustrert i figur 2B, selv når vaske protokoller fjerne et flertall av cytoplasmatiske forurensninger slik som GAPDH (Figur 2A). Imidlertid gruppering av ikke-spesifikt bindende proteiner i en normalfordeling tillater proteiner som spesifikt binder til et protein av interesse som skal skilles, da disse har høyere samplings / mock forhold enn bakgrunnen. Mens forurensninger bør teoretisk klynge rundt en logg to SILAC andel på 0, er dette ikke nødvendigvis tilfelle, er et eksempel på dette er gitt i Figur 3.. Mulige årsaker til dette er ufullkommen SILAC merking av celler, lasting skjeve volumer eller konsentrasjoner av lysate på de anti-GFP perler, utilsiktet tap av perler under rensing eller ulik blandinging av prøver ved slutten av renseprosedyren 3.. Det er imidlertid forutsatt at data analyseres basert på en terskelstandardavvik fra gjennomsnittet av de normalfordelte forurensninger, bør mindre forskyvninger i sentreringen av dataene ikke påvirke kvaliteten av resultatene.
Når man sammenligner forskjeller i proteininteraksjoner mellom to beslektede proteiner, kan en lignende situasjon forekommer der en protein av interesse produseres av høyere nivåer i celler enn en andre (enten på grunn av variasjon i transfeksjon effektivitet, eller en iboende egenskap ved protein eller mRNA) . Noe variasjon i uttrykket (for eksempel figur 2A) kan korrigeres for ved å analysere SILAC grad for disse to utvalgene. I dette eksempelet disse vil være de GFP-eIF4AI og GFP-eIF4AII prøvene. Ved å analysere 4AI/4AII SILAC forholdet som omtalt i kapittel 7, er det mulig å identifisere proteiner som bindende varierer betydelig mellom isoformer.
| Kolonneoverskrift | Beskrivelse |
| Tiltredelse | Viser sjonsnummer for sekvensen |
| Dekning | Delen av proteinsekvensen som dekkes av de identifiserte peptider |
| ♯ PSM | Peptid spektral kamp |
| ♯ peptider | Totalt antall unike peptider som er identifisert for et protein |
| ♯ Aas | Lengden av et protein i aminosyrene |
| MW (Da) | Molekylvekten for et protein i Daltons. Utelukker modifikasjoner |
| calc. PI | Den teoretiske isoelektriske punkt for et protein |
| Resultat | Den totale poengsum for et protein (som representerer summen av de individual peptid score). Den nøyaktige stillingen kreves for signifikans vil variere mellom eksperimentene. En MS-anlegget vil vanligvis gjelder en 5% falske funnraten cutoff. |
| Sequence | Sekvensen av aminosyrer som utgjør proteinet |
| Ratio | Den relative intensitet av peptider i en het merket prøve, i forhold til et andre merket prøve |
| Ratio Count | Antallet peptid forhold som ble brukt til å beregne en gitt proteinandel |
| Ratio variasjon (%) | Variabiliteten av de individuelle peptid forholdstall som brukes til å beregne en gitt proteinandel |
| Beskrivelse | Navnet på protein |
Tabell 1. Standard kolonneoverskrifter fra en Proteome Discoverer rapport.Mens nyttig informasjon kan oppnås av alle disse kolonnene, er de kritisk for denne analysen er vist i fet skrift.
| Tiltredelse | Peptider | 4AI/Mock | 4AII/Mock | Navn | SILAC analyse |
| A8K7F6 | 21 | 100 | 1 | eIF4AI | 'Bait' protein |
| Q14240 | 22 | 0,01 | 90,855 | eIF4AII | |
| G5E9S1 | 25 | 47,575 | 30.53 | eIF4GI | Samspill proteiner |
| Q59GJ0 | 5 | 11,778 | 10,619 | eIF4GII60; | |
| P06730 | 3 | 7,22 | 7,57 | eIF4E | |
| Q5T6W5 | 4 | 0.685 | 0,646 | hnRNPK | Ikke-spesifikt bindende forurensninger |
| P62805 | 1 | 0.531 | 0,498 | Histone H4 | |
| H6VRG2 | 18 | - | - | Keratin-en | Miljøgifter |
| P35527 | 11 | 0,01 | 0,01 | Keratin-en cytoskeletal 9 |
Tabell 2. Typiske Data fra en SILAC immunoutfelling eksperiment. Å gi eksempeldata for et protein av interesse / agn (høy peptider, høyt forhold), proteiner som vekselvirker med et protein av interesse (høy / lav peptider, høyt forhold), ikke-spesifikt bindende proteiner (høy / lav Peptides, faller forholdet under cutoff - i dette eksperimentet 0,96), og miljøgifter (ofte høye peptider, negativ ratio / under terskel).
Figur 1. Experimental plan. Det første celler ble dyrket i media som mangler arginin og lysin og substituert med stabil isotop-merket arginin og lysin i 2 uker (1). (2) Cellene er seedet inn 10 cm 2 retter og forbigående tilført med plasmider som koder GFP (Mock) eller GFP fusjon proteiner (prøver). (3) Celler blir lysert, og GFP eller GFP fusjonsproteiner immunutfelt fra cellelysater. (4) Prøver er kombinert i forholdet 1:1 og sendt inn for LC-MS/MS analyse. Data blir deretter analysert for å fjerne lav tillit protein identsifikasjonene og å velge et nivå av protein berikelse tilsvarer ekte samspill proteiner.
Figur 2. Bekrefte egnede immunoprecipitation forhold. A) Western blot-analyse av cellelysatene, så vel som de ikke-bundne og bundne fraksjoner fra immunoutfelling bekrefter ekspresjon og immunoutfelling av proteinet av interesse. Et Western blot mot GAPDH bekrefter uttømming av ikke-interagerende proteiner og en ytterligere western blot en kjent samspill partner av eIF4A bekrefter vellykket immunopresipitering av proteiner som binder til proteinet av interesse. B) Der er ikke kjent samvirkende partnere av et protein av interesse, en sølv-farget gel kan bekrefte immunoprecipitation av samspill proteiner. På denne sølv-flekken ed gel band for GFP og GFP-eIF4AI/II er klare, og et band som vandret til riktig størrelse for eIF4G er bare til stede i de GFP-4AI/II-bound baner og ikke i GFP kontroll kjørefelt.
Figur 3. Representative resultater. Histogram som viser fordelingen av protein forholdstall fra en gjentakelse av (A) GFP-eIF4AI eller (B) GFP-eIF4AII pulldown. Den 1,96 standardavvik cutoff er markert med stiplet linje. Samvirkende proteiner som faller utenfor de normalt fordelte forurensninger fremgår av ~ 0,25 og 1 i (A) og ~ 0,3 til 1,5 i (B).
les/ftp_upload/51656/51656fig4.jpg "/>
Figur 4. Identifisering av eif komplekse medlemmer fra en enkelt kopi av en SILAC IP eksperiment.. Proteiner i grønt var for proteinet av interesse anvendes for nedtrekk interagerende proteiner, er skyggelagt fra rødt til hvitt som angitt i log 2 SILAC forholdet i SILAC IP med rød å være den mest tallrike protein i analysen, og hvit er den 1,96 SD cutoff. Proteiner markert med grått ble ikke identifisert i denne analysen.
Discussion
Den SILAC pulldown strategi beskrevet her representerer en svært sensitive og kraftige måten å påvise roman protein: protein interaksjoner, og dessuten gjør den rask og enkel diskriminering av endrede bindende mønstre mellom nært beslektede prøver av interesse. I dette eksempelet denne teknikken ble brukt til å undersøke protein: protein interaksjoner av eIF4AI og eIF4AII proteiner seks. Til forfatterens kunnskap, er dette den første studien i litteraturen utnytte nytten av SILAC proteomikk å undersøke mobil interactome av disse to isoformer av eIF4A.
Fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor benytter en GFP-tag-og anti-GFP perler 9, 10 og derfor kan det være nødvendig modifikasjon for å muliggjøre denne tilnærmingen kan brukes for en bestemt protein av interesse, for eksempel hvorvidt koden er plassert i N-eller C-terminus av et protein. Der det er mulig, vestlige blotter eller funksjonelle analyser børbli utført for å påvise binding av et kjent protein interaksjon partner. Skulle et protein ikke tolerere fusjon med en GFP tag, andre tagging eller pulldown strategier har blitt brukt til SILAC nedtrekk ved hjelp av både andre koder (flagg 11, Biotin 12, STREP (egne data, upublisert)), eller ved å bruke primære antistoffer mot et protein av interesse der siRNA knockdown av målproteinet gir en kontrollprøve 13.. Slike eksperimenter er beskrevet andre steder i litteraturen, men i korte trekk, trinn 1 og trinn 5,4 til 8 vil bli brukt som ovenfor, med trinn 2 til 5,3 modifiserte som riktig for uttrykket / pulldown system av valg med lik protein-innganger som beskrevet i trinn 02.04 til 02.05. Som kvantifisering faser tillate ikke-spesifikke bindingsproteiner som skal fjernes ved analyse nivå, er det anbefalt å utelate pre-inkubering med kontrollperlene eller høye saltvaskinger for å opprettholde lav-affinitets protein: proteininteraksjoner med et protein av interesse . En nuclease may skal inkluderes eller utelates fra denne protokollen i henhold til de nærmere detaljer om et bestemt eksperiment. For eksempel: som de proteinene som brukes i denne fremgangsmåten er RNA heli ble RNase cocktail inkludert i protokollen for å fjerne indirekte interaksjon medieres via RNA (trinn 3.2). I noen tilfeller er det imidlertid kunne ha nytte av å kjøre parallelle eksperimenter med og uten nuklease for å identifisere nukleinsyre uselvstendige interaksjoner.
Innenfor denne protokollen, er det bytting av "medium" og "tunge" prøver i replikere eksperimenter anbefales å kontrollere for variasjon introdusert av forskjeller i SILAC media eller cellevekst. Et alternativ kontroll innebærer sekvensiell bytting av alle tre ('lys', 'middels', og 'tunge') media i replica eksperimenter. Mens denne tilnærmingen er potensielt mer stringent, vil det øke kompleksiteten av analysen, slik som i det minste en gjengivelse, et protein av interesse will fremstilles i 'lys' merkede celler, og derfor er det nødvendig å skille mellom proteiner gående identifisert i at lett prøver (miljømessige forurensninger som keratiner), og de som bare er anriket på at lett prøver når bundet til et protein av interesse.
Mens bruken av kvantifiseringen av data tillater diskriminering av spesifikk-fra ikke-spesifikke interaksjoner ved bruk av en terskel, uunngåelig noen ekte interaksjoner kan kastes. Tilnærmingen ovenfor er en enkel og rask metode for å identifisere protein: protein interaksjoner som lett kan forsøkt av forskere med ingen tidligere erfaring med massespektrometri, eller analyse av store protein: protein interaksjons datasett. For de fleste anvendelser er dette mer enn tilstrekkelig for å identifisere nye proteiner av interesse. Ytterligere modifikasjoner av denne metode til å bidra til å redusere dette tap av data, er beskrevet andre steder i litteraturen og inkluderer bruk av en protein frekvens bibliotek hvor kjent forurensningsproteiner for et bestemt sett av eksperimentelle parametre (cellelinje, perle matrise, bufferforhold) kan utelukkes 10, 14. Imidlertid, avhengig av den spesifikke eksperimentelle parametre kan det være nødvendig å kjøre en rekke kontrollforsøk for å generere en limstreng proteom, og dette kan derfor øke både kostnadene og kompleksiteten av forsøket. Ytterligere informasjon om denne teknikken er tilgjengelig fra www.peptracker.co.uk nettstedet 14.
Det bør også bemerkes at den protokoll som er beskrevet ovenfor innebærer å blande forskjellig merkede prøver ved slutten av immunoutfelling prosessen (betegnet et Blanding etter rensing - MAP SILAC eksperimentet). Dette gjøres som protein: protein interaksjoner oppstår ved en gitt likevekt 15. Det bør bemerkes at andre grupper har kombinert dette MAP SILAC tilnærmingen er beskrevet i denne protokoll med inkubering av prøveneforut for nedtrekk (Rensing etter blanding - PAM SILAC) i forskjellige tidsperioder (20 minutter til 2 timer er blitt brukt i litteraturen) 15, 16. På grunnlag av hvor raskt en proteinandel faller mot 1:1, er det mulig å undersøke kvalitativt bindingsaffinitetene og å definere proteiner som stabile eller dynamiske vekselvirkende proteinene 15.
I sammendraget, SILAC nedtrekk representerer en svært kraftig metode for identifisering proteiner i samspill med et gitt protein av interesse, i en fysiologisk relevant setting. Teknikken kan meget lett tilpasses til en rekke forskjellige rensestrategier, slik at dens anvendelse i en hvilken som helst protein av interesse. Beregning av resultatene vesentlig forenkler identifisering av genuine interaksjoner, og tillater avslapning av strenge bufferbetingelser som brukes for å fjerne ikke-spesifikke bindemidler, og dermed bevarer lav affinitet interaksjoner. Som opptil tre prøver kan sammenlignes i ovennevntestrategi, har teknikken klare styrke i å sammenligne forskjeller i proteinbinding mellom forskjellige protein isoformer, mutante proteiner, eller virkningen av farmakologiske inhibitorer. Som hele gel skiver er analysert i stedet for individuelle band som flekken ved Coomassie, antall proteiner identifisert ved høy tillit er vanligvis høyere enn de som er identifisert i en standard GST / TAP-pulldown, og forskningsforventninger i valg proteiner av interesse er fjernet. Teknikken sammen derfor svært gunstig med andre vanlige teknikker som brukes i identifisering av nye protein-interaksjoner (gjær to-hybrid, GST / Hans eller TAP Pulldowns).
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Wellcome Trust og BBSRC til IG. IG er en Wellcome Senior Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
| Dialysed FBS (10 kDa cutoff) 500 ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
| Arginine (R0) 25 g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
| Arginine (R6) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
| Arginine (R10) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5 g in 6 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 84 mg/ml stock) |
| Lysine (K0) 25 g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
| Lysine (K4) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
| Lysine (K8) 0.5 g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5 g in 3.5 ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5 ml aliquots (gives a 146 mg/ml stock) |
| Penicillin/streptomycin, Liquid. 100 ml | Gibco | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| GFP-trap Agarose (500 μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
| 5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
| Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
| 1.7 ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
| BCA protein assay kit (1 L) | Pierce | 23225 | |
| Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
| NP-40 alternative | Millipore | 492016 |
References
- Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. Protein-protein interactions. Biochem Soc Trans. 38, 875-878 (2010).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Trinkle-Mulcahy, L. Resolving protein interactions and complexes by affinity purification followed by label-based quantitative mass spectrometry. Proteomics. 12, 1623-1638 (2012).
- Emmott, E., et al. The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology. J Virol. 87, 9486-9500 (2013).
- Li, W., Belsham, G. J., Proud, C. G. Eukaryotic initiation factors 4A (eIF4A) and 4G (eIF4G) mutually interact in a 1:1 ratio in vivo. J Biol Chem. 276, 29111-29115 (2001).
- Nielsen, P. J., Trachsel, H. The mouse protein synthesis initiation factor 4A gene family includes two related functional genes which are differentially expressed. EMBO J. 7, 2097-2105 (1988).
- Galicia-Vazquez, G., Cencic, R., Robert, F., Agenor, A. Q., Pelletier, J. A cellular response linking eIF4AI activity to eIF4AII transcription. RNA. 18, 1373-1384 (2012).
- Zakowicz, H., et al. Mutational analysis of the DEAD-box RNA helicase eIF4AII characterizes its interaction with transformation suppressor Pdcd4 and eIF4GI. RNA. 11, 261-274 (2005).
- Rothbauer, U., et al. A versatile nanotrap for biochemical and functional studies with fluorescent fusion proteins. Mol Cell Proteomics. 7, 282-289 (2008).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Dobreva, I., Fielding, A., Foster, L. J., Dedhar, S. Mapping the integrin-linked kinase interactome using SILAC. J Proteome Res. 7, 1740-1749 (2008).
- Mittler, G., Butter, F., Mann, M. A SILAC-based DNA protein interaction screen that identifies candidate binding proteins to functional DNA elements. Genome research. 19, 284-293 (2009).
- Selbach, M., Mann, M. Protein interaction screening by quantitative immunoprecipitation combined with knockdown QUICK. Nat Methods. 3, 981-983 (2006).
- Boulon, S., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9, 861-879 (2010).
- Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7, 46-57 (2008).
- Fang, L., et al. Characterization of the human COP9 signalosome complex using affinity purification and mass spectrometry. J Proteome Res. 7, 4914-4925 (2008).
