Summary
SIVQ-LCM er en innovativ tilgang, der udnytter en computer algoritme, Rumligt Invariant Vector Quantization (SIVQ), til at køre laser capture mikrodissektion (LCM) proces. Den SIVQ-LCM workflow i høj grad forbedrer hastigheden og nøjagtigheden af mikrodissektion med anvendelser i både forskning og kliniske indstillinger.
Abstract
SIVQ-LCM er en ny metode, der automatiserer og strømliner de mere traditionelle, bruger-afhængig laser dissektion proces. Det sigter mod at skabe en avanceret, hurtigt kan tilpasses laser dissektion platform-teknologi. I denne rapport beskriver vi integrationen af billedet analyse software Rumligt Invariant Vector Quantization (SIVQ) på ArcturusXT instrumentet. Det ArcturusXT-systemet indeholder både en infrarød (IR) og ultraviolet (UV)-laser, der giver mulighed for specifik celle eller store areal dissektioner. Det primære mål er at forbedre den hastighed, præcision og reproducerbarhed af laseren dissektion for at øge prøve gennemløb. Denne nye fremgangsmåde letter mikrodissektion af både dyr og mennesker væv i forskning og kliniske arbejdsgange.
Introduction
Oprindeligt udviklet i midten af 1990'erne, laser capture mikrodissektion (LCM) gør det muligt for brugeren at netop fange specifikke celler eller cellulære regioner fra en histologisk vævssnit via mikroskopisk visualisering 1, 2. Mange studier, der sammenligner molekylær analyse af LCM versus væv skrammer illustrere værdien af metoden 3-12. Desuden er der tre video protokol publikationer om den teknologi, der er til rådighed for visning 13, 14. Men på trods af dens dokumenterede værdi, kan LCM være trættende og besværlig, når målet af interesse er en spredt celle population i en heterogen vævssnit, eller når et stort antal celler er nødvendige for bestemte downstream-applikationer såsom proteomics. Byrden på den menneskelige operatør førte os til at udvikle en halvautomatisk dissektion tilgang til LCM ved at kombinere et kraftfuldt billede analyse algoritme til at styre LCM processen 15.
<p class = "jove_content"> I samarbejde med University of Michigan, vores laboratorium på NIH forlængede tidligere udviklet og rapporteret Rumligt invariant vektorkvantisering (SIVQ) algoritme på en måde at gøre det muligt for semi-automatisere udvælgelsen væv proces iboende guidede mikrodissektion, hvorved fås et værktøj med patologen eller liv videnskabsmand i tankerne. Rumligt invariant vektorkvantisering (SIVQ) er en algoritme, der giver brugeren mulighed for at blot "klikke" på en histologisk træk af interesse at skabe en ring vektor (prædikat billede-funktion), der kan bruges til at søge i hele histologiske billede, justere den statistiske tærskel efter behov 16-21. Den resulterende zonekort viser kvaliteten af kampe til den oprindelige prædikat billedet funktionen og efterfølgende omdannet til en enkelt farve (rød) anmærkning kort, der kan importeres til LCM instrumentet. Den automatiserede udvælgelse software, AutoScanXT, derefter bruges til at tegne et kort baseretpå SIVQ anmærkningssredskaber vejlede indfangning af target celler fra vævsprøve. Den detaljerede protokol nedenfor beskriver implementeringen af SIVQ i mikrodissektion arbejdsgang.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den beskrevne protokol blev ansat i overensstemmelse med NIH regler om anvendelse af menneskelige vævsprøver.
1. Vævspræparat
- Forud for starten, få menneskelige vævsprøver ifølge Institutional Review Board (IRB) protokoller.
- Vælg den type væv / celler blok og tilsvarende forarbejdningsmetode [formalin paraffinindlejret (FFPE), frosne, eller ethanol-paraffinindlejret (EFPE)]. Formalinfiksering giver optimal histologi, efterfulgt af ethanol fiksering og lynfrosset. Dog kan fikseringen og væv forarbejdningsmetoder påvirke DNA, RNA og protein kvantitet og kvalitet for downstream molekylær analyse og bør overvejes.
- Skær væv / celler bloksektioner onto slide type (glas, membranglas eller metalramme membran) af valg. SIVQ analyse virker lige godt på alle tre slide typer. Bemærk venligst, at pseudo-dækglas metode (beskrevet nedenfor) med xylener og ethanol kan ikke udføres på metalrammen membran dias, da diaset skal vendes på scenen.
- Vælg et kemikalie-eller IHC-baserede væv pletten til at identificere celler af interesse fra baggrunden. Bemærk, at farvningsfremgangsmåder kan også påvirke DNA, RNA og protein kvalitet og mængde af vævet. Test vævet efter farvning at vurdere baseline kvalitet af biomolekyler, før du fortsætter med protokollen. SIVQ-LCM er blevet udført på væv / cytologi objektglas farvet med: immunhistokemi (IHC) med DAB 15, immunfluorescens, hurtig rød, de novo rød, toluidinblåt og hematoxylin og eosin (H & E) (upublicerede data).
2.. Specimen Imaging
- Load glider ind på den motoriserede fase af mikrodissektion instrument og starte relateret software. Marker afkrydsningsfelterne til at udpege placeringen af de indlæste dias og sikre de erobrede billedfiler skal gemmes i jpeg-format.
- Optimer imalder ved at justere lysstyrke og fokus af billedet på skærmen, enten ved hjælp af manuel fokusering hjul eller via dissektion instrumentets software.
- Brug af Image Værktøjskasse i dissektion instrumentets software, indstille lampens lysstyrke og kamera gevinst korrekt. Eksempel værdier er lysstyrke = 60 og gevinst = 220, med diffuser.
- Fokuser enten manuelt eller med autofokus funktionen i softwaren.
- Fang en miniatureoversigt billede af dias til at give en køreplan for dissektion processen.
- For optimal billedkvalitet på en uncoverslipped dias, udnytte diffuser under kondensatoren på instrumentet, eller tilføje en lille mængde (~ 30 ul) af enten ethanol eller xylener at forbedre den ildfaste indeks (pseudo-dækglas). Når du bruger xylener, være opmærksom på at de skal anvendes giftige og ordentlige sikkerhedsforanstaltninger, herunder brug af et stinkskab og beskyttende kittel, beskyttelsesbriller og handsker.
- Anbring ikke LCM hætten på diaset, indtil ethanol eller xylener løsning har helt ryddet eller polymeren på hætten vil blive forvrænget.
- Naviger slæden og tage billeder af de områder, der skal dissekeret ved 10X, 20X eller 40X forstørrelse. Hvis det er nødvendigt, forbedre billedet med software som Autokorrektur (i Microsoft Office Picture Manager) som tidligere beskrevet 22. Billeder skal være fanget i jpeg-format til at tillade dem at blive genindført i den automatiske udvælgelse software.
3.. Algoritme Analyse af billedet
- Overfør optagne billeder fra mikrodissektion instrument til SIVQ mappe. Installer og åbne ArcturusXT, AutoScan og SIVQ softwarepakker på den computer knyttet til dissektion instrument. For at få adgang til SIVQ software, kontakt venligst Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu).
- Åbent SIVQ og indlæse optagne billede (jpeg) af interesse. </ Li>
- Naviger til det område af interesse og / eller justere størrelsen af udstillingsvinduer (Viewport 5 & 6). I SIVQ software Viewport 5 viser forbehandling billedet og Viewport 6 viser efterbehandlingen billede 16..
- Vælg størrelsen af ringen vektor og antal ringe, der skal anvendes.
- Vælg det billede prædikat funktion til at blive taget til fange ved at højreklikke på det i Viewport 6.
- Klik på "scan" til at analysere billedet.
- Juster den statistiske sandsynlighed for billedet matching ved hjælp af de to forskydelige stænger. Den øvre stang justerer den samlede vektor specificitet, og bruges til at udelukke område fra første scanning (med følsomhed som defineret af den valgte "Stat" variable), som kan medføre en overdreven inkluderet område. Omvendt er den nedre skyderen udnyttes til at øge følsomheden, efter skanning med den hensigt at øge område, der er klassificeret som værende en match. Begge disse skyderkontroller UTILize på "Stat" variable som den oprindelige baseline sensitivitetstærskel.
- Hvis du vil gemme billedet, skal du klikke på "gem som jpeg" (billedet er nu gemt i C :/ vq_test mappe / pics).
- Analyser billedet med algoritmen. Udgangen af algoritmen undersøgelse skal resultere i en kommenteret billede for at det kan anvendes i SIVQ-LCM. På nuværende tidspunkt er den aktuelle version af SIVQ kerne motoren er i beta version test med forventningen om, at den fulde version produktion (tilgængelig Q1 2014) vil omfatte en komplet software development kit (SDK) og application programming interface (API) for forenklet integration af bruger-genereret rumlige filtre og efterfølgende workflow databehandling trin med kernen ring matchende motor. Dette SDK vil blive fordelt med et komplet sæt af dokumentation.
- Sørg for, at SIVQ heatmap ændres til en ensartet rød farve.
- Eksporter billedet. Det er vigtigt at re-integrere de positionelle koordinater post-analyse jpeg-billede ved hjælp af en HEX editor til at indsætte i filen header fra den oprindelige dissektion instrument billede. De relevante data kan findes mellem "Start på Image" markør (0xFF, 0xD8), og den første "Define Kvantisering Table" markør (0xFF, 0xDB).
4.. Mikrodissektion
- Placer LCM cap i centrum af regionen af interesse, hvor billederne blev taget til fange for SIVQ analyse.
- Kalibrere og Quality Control (QC) UV / IR lasere og optimere parametre, herunder magt, varighed, laser steder, og UV skærehastighed (som anbefalet af producenten). Udfør disse kalibreringer før re-importere det analyserede billede.
- Åbent AutoScanXT (automatiseret udvælgelse software) og importere det analyserede billede fra c :/ vq_test mappe / pics.
- Træn automatiseret udvælgelse software til at genkende SIVQ anmærkning og skabe dissektion kortet.
- Sådan opretter du en Training fil ved at vælge fire regioner af interesse (markeret med "blå cirkler") på "rød maling" af SIVQ analyserede billede.
- Vælg baggrunden områder (markeret med "røde firkanter"), der ikke skal dissekeres.
- Klik på knappen "Analyze" for at generere uddannelsen fil, som kan gemmes til senere brug.
- Udfør mikrodissektion anvendelse af det passende infrarød (IR) og / eller ultraviolet (UV) lasere.
- Kopier de markerede områder på "live" billede.
- I "microdissect" værktøjskasse, vælge den relevante IR-indfangning eller UV skære knapper.
- Efter dissektion er færdig, skal du flytte LCM cap til QC station og tage et billede af de dissekerede væv / celler. En anden metode er at placere hætten på et tomt område af diaset forud for at flytte den til QC station, dette giver brugeren mulighed for at tage billeder ved forskellige forstørrelser.
- Tage et billede af vævet interesseområde efter mikrodissektion for yderligere at vurdere løfte effektiviteten.
- Hvis de ønskede celler er blevet dissekeret med succes, skal du klikke på "nuværende tidspunkt" knappen i ArcturusXT software og fjern LCM hætten til at indlede den molekylære udvinding procedure for downstream analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En FFPE humant brystvæv afsnit blev immunfarvet for cytokeratin AE1/AE3 ved hjælp af en standard IHC-protokol 23. Efter farvning blev vævet slide placeret på ArcturusXT scenen og SIVQ-LCM-protokollen blev indledt som beskrevet ovenfor. Da væv ikke kan dækglas til mikrodissektion kan IHC + farvede celler være vanskelige at skelne visuelt (figur 1A). Således, for at give bedre indeks-svarende og et forbedret billede blev xylener hvormed vævssnittet for at skabe en pseudo-dækglas 15 (figur 1B). Et JPEG-billede blev derefter taget til fange af den pseudo-dækglas område og importeret til SIVQ for algoritmen analyse. Et prædikat billede funktion (mørkebrun DAB farvning) valgt af brugeren indledte SIVQ algoritme til at analysere billedet (figur 1C). Den SIVQ heatmap blev derefter omdannet til en "rød maling", der er anerkendt af den automatiserede udvælgelse software (figur 1D). De xylener fik lov til at fordampe, og SIVQ heatmap blev importeret til automatiserede udvælgelse software (fig. 1E), og de fremhævede celler blev dissekeret med IR laser. LCM cap blev derefter flyttet til QC stationen af ArcturusXT instrumentet og inspiceres visuelt for at vurdere dissektion effektivitet (figur 1F). Den resterende væv blev også inspiceret (figur 1G) og SIVQ heatmap blev genindført for yderligere at vurdere den mikrodissektion effektivitet (Figur 1 H).
Figur 1.. SIVQ-LCM af IHC farvede FFPE brystvæv. A) Uncoverslipped billede af cytokeratin AE1/AE3 farvede FFPE brystvæv. B) Xylener belagt (pseudo-dækglas) billede af panel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer en protokol for anvendelse af SIVQ-LCM til microdissect immunofarvet epitelceller fra FFPE human brystvæv. Brugen af et billede analyse algoritme, som SIVQ, reducerer mængden af hands-on tid, der kræves for mikrodissektion processen. Dette er et potentielt vigtigt fremskridt for området siden operatøren tid og kræfter er typisk hastighedsbegrænsende trin for den præcise dissektion af celler af interesse. I den nuværende protokol, vi specifikt tilpasset vores procedure til ArcturusXT instrument, selv om det sandsynligvis vil være muligt at tilpasse SIVQ og andre algoritmer til andre kommercielt tilgængelige mikrodissektions instrumenter så godt. Ud over at forbedre effektiviteten, kan denne nye tilgang give brugere, der er ikke-histopatologi eksperter til at udføre mikrodissektion. Endelig kan anvendelse af en algoritme til at drive mikrodissektion proces muliggøre større reproducerbarhed fra site-to-site ved at fjerne brugerens subjektivitet i identifikation celler o f interesse.
Mens SIVQ udviser bred tilpasningsevne til flere klasser af billedet emne, herunder histologi, er det vigtigt at erkende, at det ikke er hensigten at tjene som en universel billedbehandling / segmentering værktøj, men snarere som et højeffektivt first-pass forgrunden udvælgelse værktøj. Anvendes i denne egenskab, det har høj nytteværdi til at forudsige, hvorvidt en særlig klasse af billedsprog emnet er egnet til numeriske segmentering tilgange. Når SIVQ er vellykket, er der høj forudsigende magt, enten: a) en mere raffineret og målrettet billedanalyse / segmentering tilgang vil være yderst vellykket, og / eller b) et optimeret maskine valgt SIVQ vektor vil være effektiv i at gøre en klinisk workflow-ready løsning. I begge omstændighed, brug af SIVQ fungerer som en effektiv triaging redskab til at identificere billedsprog emne, som udgør beregningsmæssigt medgørlige løsninger i form af forgrunden segmentability.
ntent "> Mens vi tidligere beskrevet anvendelsen af SIVQ-LCM-protokol for mRNA-ekspression microarray eksperimenter 15, mener vi, at protokollen er relevant for de fleste efterfølgende molekylære assays, og kan være særligt anvendelige til molekylære analyser, der kræver et stort antal celler, såsom proteomics. Til disse undersøgelser skal anskaffes på grund af den manglende evne til at forstærke proteiner store mængder af celler. Endvidere fremkomsten af nyere teknologier, såsom Next-Gen Sequencing (NGS), understreger behovet for at begynde med så ren af en prøve som muligt. Evnen til SIVQ-LCM at isolere celler via både morfologiske træk og / eller pletter egenskaber kunne sætte evnen til lettere at isolere rene cellepopulationer.Det er afgørende at have ordentligt forberedt væv til reproducerbare resultater for både SIVQ analyse og mikrodissektion. For at opnå optimale betingelser for LCM er det bedst at udføre dissekerer i en lav fugtighed plads og opretholde korrekt dehydrated væv. Endvidere sikre, at farvning af vævet er reproducerbare. Endelig kendskab til dissektion instrument er afgørende for en vellykket SIVQ-LCM.
Den SIVQ-LCM-protokol, der præsenteres her er de første skridt i retning af halvautomatisk mikrodissektion, hvilket kan få ansøgninger i fremtidige kliniske forsøg, da de nuværende dissektionsmetode ikke er let i stand til at håndtere store arbejdsbyrder. Sammenfattende mener vi, at SIVQ-LCM er en ny razzia i området for automatiserede mikrodissektion og giver et udgangspunkt, hvorfra efterforskere og algoritme udviklere kan yderligere forbedre teknologien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Michael R. Emmert-Buck er en opfinder på NIH-holdt patenter, der dækker laser capture mikrodissektion og modtager royalty-baserede betalinger via NIH Technology Transfer Program.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet delvist af Intramural Research Program af National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
- Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
- Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
- Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
- Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
- Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
- Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
- Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
- Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
- Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
- Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
- Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).
