Summary
SIVQ-LCM is een innovatieve aanpak die een computer algoritme, Ruimtelijk Invariante Vector Quantization (SIVQ) benut, om de lasermicrodissectie (LCM) proces te sturen. De SIVQ-LCM workflow verbetert de snelheid en nauwkeurigheid van microdissection, met toepassingen in zowel de onderzoeks-en klinische settings.
Abstract
SIVQ-LCM is een nieuwe methode die automatiseert en stroomlijnt de meer traditionele, gebruikersafhankelijke laser dissectie proces. Het doel is om een geavanceerde, snel aanpasbare laser dissectie platform technologie te creëren. In dit rapport beschrijven we de integratie van de software voor beeldanalyse Ruimtelijk Invariante Vector Quantization (SIVQ) op de ArcturusXT instrument. Het ArcturusXT systeem bevat zowel een infrarood (IR) en ultraviolette (UV) laser, waardoor specifieke cel of groot gebied dissecties. Het voornaamste doel is om de snelheid, nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de laser dissectie steekproefproductie verhogen verbeteren. Deze nieuwe benadering vergemakkelijkt microdissection van zowel dierlijke en menselijke weefsels in onderzoek en klinische workflows.
Introduction
Oorspronkelijk ontwikkeld in het midden van de jaren 1990, lasermicrodissectie (LCM) kan de gebruiker specifieke cellen of cellulaire gebieden van een histologische sectie weefsel via microscopische visualisatie 1, 2 nauwkeurig vast te leggen. Vele studies waarin moleculaire analyse van LCM versus weefsel krassen illustreren de waarde van de methode 3-12. Daarnaast zijn er drie video-protocol publicaties welke technologie beschikbaar voor het bekijken 13, 14 zijn. Ondanks de bewezen waarde, LCM kan vervelend en moeizaam wanneer het doelwit van belang een gedispergeerde celpopulatie in een heterogene weefselsectie of wanneer grote aantallen cellen voor specifieke stroomafwaartse toepassingen zoals proteomics. De lasten voor de menselijke operator leidde ons naar een semi-automatische ontleding aanpak voor LCM ontwikkelen door de combinatie van een krachtige beeldanalyse algoritme om de LCM-proces 15 begeleiden.
<p class = "jove_content"> In samenwerking met de Universiteit van Michigan, ons laboratorium aan de NIH uitgebreid de eerder ontwikkelde en gerapporteerd Ruimtelijk invariant vector quantisatie (SIVQ) algoritme op een manier om het te laten semi-automatiseren van het weefsel selectieproces inherent aan begeleide microdissection leveren zodoende een tool met de patholoog of leven wetenschapper in het achterhoofd. Ruimtelijk invariante vector quantisatie (SIVQ) is een algoritme waarmee de gebruiker eenvoudig "klik" op een histologische kenmerk van belang om een ring vector (predikaat image functie) die kan worden gebruikt om de gehele afbeelding histologische zoeken creëren, aanpassen van de statistische drempel als nodig 16-21. De resulterende hitte kaart geeft de kwaliteit van de wedstrijden om de eerste afbeelding predikaat functie en wordt vervolgens omgezet in een enkele kleur (rood) annotatie kaart die in de LCM instrument kan worden geïmporteerd. De geautomatiseerde selectie software, AutoScanXT, wordt dan gebruikt om een kaart op basis van tekenenop SIVQ's annotatie begeleiden van de vangst van de doelcellen van het weefselmonster. De gedetailleerde protocol hieronder beschrijft de uitvoering van SIVQ in de microdissection workflow.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De beschreven protocol werd toegepast volgens NIH regels voor het gebruik van menselijke weefselmonsters.
1. Tissue Voorbereiding
- Voorafgaand aan het begin, het verkrijgen van menselijke weefselmonsters volgens Institutional Review Board (IRB)-protocollen.
- Kies het type weefsel / cel blok en bijbehorende verwerkingsmethode [formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE), bevroren of-ethanol vaste paraffine ingebedde (EFPE)]. Formalinefixatie biedt optimale histologie, gevolgd door ethanol fixatie en flash bevroren. Echter, fixatie en weefsel verwerkingsmethoden invloed DNA, RNA en eiwitten kwantiteit en kwaliteit voor stroomafwaartse moleculaire analyse en moet worden beschouwd.
- Snijd het weefsel / celblok secties op het glaasje soort (glas, membraan glas of metalen frame membraan) van keuze. SIVQ analyse werkt even goed op alle drie de typen dia. Let op: de pseudo-dekglaasje methode (hieronder beschreven) met xylenen en Ethanol kan niet worden uitgevoerd op het metalen membraan dia omdat de slede moet worden omgekeerd op het podium.
- Selecteer een chemisch of IHC-gebaseerde weefsels vlek cellen van belang te identificeren van de achtergrond. Let kleuringen kan ook van invloed DNA, RNA en eiwitten kwaliteit en kwantiteit van het weefsel. Test het weefsel na kleuring met de uitgangswaarde kwaliteit van biomoleculen te beoordelen alvorens het protocol. SIVQ-LCM is uitgevoerd op weefsel / cytologie dia gekleurd met: immunohistochemie (IHC) met DAB 15, immunofluorescentie, snel rood, de novo rood, toluïdineblauw en hematoxyline en eosine (H & E) (ongepubliceerde gegevens).
2. Specimen Imaging
- Belasting glijdt op de gemotoriseerde fase van de microdissection instrument en start de bijbehorende software. Selecteer de selectievakjes om de posities van de geladen dia aanwijzen en zorgen voor de opname bestanden zijn in jpeg-formaat worden opgeslagen.
- Optimaliseer de imleeftijd kwaliteit door het aanpassen van de helderheid en scherpte van het beeld op het scherm, met behulp van de handmatige scherpstelling wiel of via de software van de dissectie instrument.
- Werken met Image Toolbox software binnen de dissectie instrument, de helderheid en de camera lamp gain gepast. Voorbeeld waarden zijn helderheid = 60 en gain = 220, met de diffuser.
- Focus handmatig of met de functie autofocus in de software.
- Leg een thumbnail overzicht beeld van de dia om een routekaart voor de dissectie proces.
- Voor een optimaal beeld van een uncoverslipped dia, gebruik de diffuser onder de condensor op het instrument, of een kleine hoeveelheid (~ 30 pi) van ofwel ethanol of xylenen de vuurvaste index (pseudo-dekglaasje) verbeteren. Bij het gebruik van xyleen, zich bewust zijn ze giftig en de juiste veiligheidsmaatregelen moeten worden gebruikt, waaronder het gebruik van een afzuigkap en beschermende laboratoriumjas, stofbril en handschoenen.
- Vinden niet plaats totdat de ethanol of xylenen oplossing is volledig gewist of het polymeer op de dop zal worden vervormd de LCM dop op de dia.
- Navigeren door de glijbaan en foto's maken van de gebieden die moeten worden ontleed op 10X, 20X of 40X vergroting. Indien nodig, het imago met software zoals AutoCorrectie (in Microsoft Office Picture Manager) zoals eerder beschreven 22. Afbeeldingen moeten worden vastgelegd in jpeg-formaat, zodat ze opnieuw worden ingevoerd in de geautomatiseerde selectie software.
3. Algoritme analyse van het beeld
- Transfer gevangen beelden van de microdissection instrument om de map SIVQ. Installeer en open de ArcturusXT, AutoScan en SIVQ software pakketten op de computer aangesloten op de dissectie instrument. Voor toegang tot de SIVQ software kunt u contact opnemen met Dr Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu).
- Open SIVQ en laad het vastgelegde beeld (jpeg) van belang. </ Li>
- Ga naar het gebied van rente en / of de grootte van de etalages (Viewport 5 & 6). In de SIVQ software, Viewport 5 imago van de pre-processing toont en de post-processing image 16 Viewport 6 toont.
- Kies de grootte van de ring vector, aantal ringen te gebruiken.
- Selecteer het predikaat afbeelding functie worden vastgelegd door rechts te klikken op het in Viewport 6.
- Klik op "scan" om het beeld te analyseren.
- Pas de statistische kans op afbeelding matching met behulp van de twee schuifbalken. De bovenste balk stelt het geheel vector specificiteit, en wordt gebruikt om ruimte te sluiten van de eerste scan (met gevoeligheid gedefinieerd door het geselecteerde "Stat" variabel) dat overmatig opgenomen gebied kan vertegenwoordigen. Omgekeerd wordt de onderste schuif gebruikt om de gevoeligheid te verhogen na een scan wordt uitgevoerd met de bedoeling van toenemende gebied dat is geclassificeerd als een spel. Beide schuifregelaars utilize de "Stat" variabele als de nulmeting gevoeligheid drempel.
- Om de afbeelding op te slaan, klikt u op "opslaan als jpeg" (afbeelding wordt nu in c :/ vq_test map / pics opgeslagen).
- Analyseer de afbeelding met het algoritme. De output van het algoritme analyse moet resulteren in een geannoteerde beeld om te worden gebruikt in SIVQ-LCM. Op dit moment is de huidige versie van de SIVQ kern motor is in beta versie testen met de verwachting dat de volledige productie versie (beschikbaar Q1 2014) een volledige software development kit (SDK) en application programming interface (API) zullen worden opgenomen voor een vereenvoudigde integratie van user-generated ruimtelijke filters en downstream workflow gegevensverwerking stappen met de kern ring matching engine. Deze SDK zal worden verdeeld met een complete set documentatie.
- Zorg ervoor dat de SIVQ heatmap wordt gewijzigd in een uniforme kleur.
- Exporteer de afbeelding. Het is essentieel om opnieuw verankeren de positie coördinaten in de post-analyse jpeg afbeelding met behulp van een hex-editor te plakken in de header van het imago van de oorspronkelijke dissectie instrument. De juiste gegevens kunnen worden gevonden tussen "Begin van Beeld" marker (0xFF, 0xD8) en de eerste "Definieer kwantisatietabel" marker (0xFF, 0xDB).
4. Microdissection
- Plaats de LCM dop in het midden van het gebied van belang, waar de beelden werden vastgelegd voor de SIVQ analyse.
- Kalibreren en Quality Control (QC) de UV / IR lasers en optimaliseren van de parameters, waaronder kracht, duur, laser locaties en UV snijsnelheid (zoals aanbevolen door de fabrikant). Voer deze kalibraties voor het opnieuw importeren van de geanalyseerde afbeelding.
- Open AutoScanXT (geautomatiseerde selectie software) en importeer de geanalyseerde afbeelding van c :/ vq_test map / pics.
- Train de geautomatiseerde selectie software om de SIVQ annotatie herkennen en creëren de dissectie kaart.
- Om een trai makenNing bestand, selecteer vier regio's van belang (gekenmerkt door "blauwe cirkels") op de "rode verf" van de SIVQ geanalyseerde afbeelding.
- Selecteer de achtergrond gebieden (gemarkeerd met "rode vierkanten") die niet worden ontleed.
- Klik op de knop "Analyseren" om de opleiding bestand, dat kan worden opgeslagen voor latere toepassingen te genereren.
- Voer microdissectie met de juiste infrarood (IR) en / of ultraviolet (UV)-lasers.
- Kopieer de geselecteerde gebieden op de 'live' beeld.
- In de "microdissect" toolbox, selecteer de juiste IR vangen of UV snijden knoppen.
- Na de dissectie is voltooid, zet u de LCM dop om de QC-station en vastleggen van een beeld van de ontleed weefsel / cellen. Een andere benadering is om de kap te plaatsen op een leeg gebied van de dia voorafgaand aan het aan de QC-station verplaatsen, dit stelt de gebruiker in staat om foto's te maken bij diverse vergrotingen.
- Maak een foto van het weefsel gebied van belang na microdissection om verder te beoordelen tillen efficiëntie.
- Als de gewenste cellen met succes zijn ontleed, klik op de "huidige fase" knop in de ArcturusXT software en verwijder de LCM dop tot inleiding van de moleculaire extractie procedure voor downstream analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een FFPE menselijk borstweefsel sectie werd immunostained voor Cytokeratine AE1/AE3 gebruik van een standaard IHC protocol 23. Na het kleuren werd het weefsel dia op de ArcturusXT podium geplaatst en SIVQ-LCM protocol werd ingeleid zoals hierboven beschreven. Aangezien het weefsel niet worden afgedekt voor microdissectie, kan de IHC + gekleurde cellen moeilijk visueel te onderscheiden (figuur 1A). Aldus beter bijpassende brekingsindex en een verbeterd beeld verschaffen, xylenen toegevoegd aan de weefselsectie een pseudo-dekglaasje 15 (Figuur 1B) maken. Een jpeg werd vervolgens gevangen genomen van de pseudo-afgedekt gebied en in SIVQ voor het algoritme analyse geïmporteerd. Een predikaat beeld functie (donkerbruin DAB vlek) geselecteerd door de gebruiker geïnitieerde de SIVQ algoritme om het beeld (figuur 1C) te analyseren. De SIVQ heatmap werd toen omgezet in een "rode verf" dat wordt herkend door de geautomatiseerde selectie software (Figuur 1D). De xylenen mochten verdampen en de SIVQ heatmap werd in de geautomatiseerde selectie software (figuur 1E) ingevoerd en de gemarkeerde cellen werden ontleed met de IR laser. Het LCM cap werd vervolgens verplaatst naar de QC-station van de ArcturusXT instrument en visueel geïnspecteerd om dissectie efficiëntie (Figuur 1F) te beoordelen. De resterende weefsel werd ook gecontroleerd (figuur 1G) en de SIVQ heatmap werd opnieuw geïmporteerd in de microdissectie efficiency (Figuur 1H) verder te beoordelen.
Figuur 1. SIVQ-LCM van IHC lood FFPE borstweefsel. A) Uncoverslipped beeld van cytokeratin AE1/AE3 gekleurd FFPE borstweefsel. B) Xylenen gecoate (pseudo-afgedekt) beeld van het paneel A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren een protocol voor de toepassing van SIVQ-LCM om immuun-epitheliale cellen van FFPE menselijk borstweefsel microdissect. Het gebruik van een beeldanalyse algoritme, zoals SIVQ, vermindert de hands-on tijd die het proces microdissectie. Dit is een potentieel belangrijke stap vooruit voor het gebied sinds operator tijd en moeite is meestal de snelheidsbeperkende stap voor de precieze ontleding van cellen van belang. In dit protocol is specifiek onze procedure aangepast aan de ArcturusXT instrument, hoewel het waarschijnlijk mogelijk zijn om SIVQ en andere algoritmen aan andere commercieel verkrijgbare instrumenten en microdissectie. Naast het verbeteren van de efficiëntie, kan deze nieuwe aanpak kunnen gebruikers die niet-histopathologie deskundigen microdissection voeren. Tenslotte kan het gebruik van een algoritme om het proces te sturen microdissectie grotere reproduceerbaarheid inschakelen van site-to-site voor verwijderen gebruiker subjectiviteit identificeren cellen o f rente.
Terwijl SIVQ vertoont grote aanpasbaarheid aan verschillende klassen van het onderwerp, zoals histologie, is het belangrijk te erkennen dat het niet is bedoeld als een universele beeldverwerking / segmentatietool, maar eerder als een zeer efficiënte first-pass foreground selectie tool. Gebruikt in deze hoedanigheid, het heeft een hoge nut voor het voorspellen of een bepaalde klasse van beeldspraak onderwerp is geschikt voor numerieke segmentatie benaderingen. Wanneer SIVQ succesvol is, is er grote voorspellende kracht dat ofwel: a) een meer verfijnde en gerichte beeldanalyse / segmentatie aanpak zal zeer succesvol zijn en / of b) een geoptimaliseerde,-machine geselecteerde SIVQ vector zal effectief zijn bij het verlenen van een klinisch- workflow-klaar oplossing. In beide omstandigheden, het gebruik van SIVQ fungeert als een effectief instrument om triaging beeldspraak onderwerp dat computerbeheerd oplossingen oplevert voor de voorgrond segmentability identificeren.
ntent "> Terwijl wij eerder beschreven het gebruik van de SIVQ-LCM-protocol voor mRNA expressie microarray experimenten 15, vinden wij het protocol kan in de meeste stroomafwaartse moleculaire assays en kunnen bijzonder nuttig zijn voor moleculaire assays die grote aantallen cellen vereisen, zoals proteomics. Voor deze studies moeten grote hoeveelheden cellen worden verkregen door het onvermogen om eiwitten te versterken. Bovendien is de komst van nieuwe technologieën, zoals Next-Gen Sequencing (NGS), benadrukt de noodzaak om te beginnen als zuiveren van een monster mogelijk. Het vermogen van SIVQ LCM-cellen te isoleren via zowel morfologische kenmerken en / of vlekken kwaliteitssoorten de mogelijkheid om gemakkelijker isoleren zuivere celpopulaties mogelijk.Het is cruciaal om goed voorbereid weefsel voor reproduceerbare resultaten voor zowel de SIVQ analyse microdissectie hebben. Voor optimale omstandigheden voor LCM is het het beste om ontleedt presteren in een lage luchtvochtigheid in de kamer en onderhouden goed gedehydrateerde vormdrateerde weefsel. Bovendien zorgen dat de kleuring van het weefsel reproduceerbaar. Tot slot, vertrouwdheid met de dissectie instrument is essentieel voor een succesvolle SIVQ-LCM.
De SIVQ-LCM protocol hier gepresenteerde is de eerste stappen naar semi-automatische microdissection, welke toepassingen in de toekomst klinische testen kunnen hebben aangezien de huidige dissectie methoden zijn niet gemakkelijk in staat het verwerken van grote workloads. Samengevat zijn wij van mening dat SIVQ-LCM is een nieuwe inval in het gebied van geautomatiseerde microdissection en biedt een startpunt van waaruit onderzoekers en algoritme ontwikkelaars verder kan verbeteren van de technologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Michael R. Emmert-Buck is een uitvinder op NIH-held patenten die lasermicrodissectie en ontvangt op basis van royalty betalingen door de NIH Technology Transfer Program.
Acknowledgments
Het onderzoek werd mede ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
- Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
- Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
- Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
- Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
- Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
- Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
- Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
- Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
- Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
- Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
- Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).
