Summary
SIVQ-LCM est une approche novatrice qui exploite un algorithme informatique, spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ), à conduire la microdissection par capture laser (LCM) de processus. Le flux de travail SIVQ-LCM améliore grandement la vitesse et la précision de microdissection, avec des applications à la fois dans la recherche et les milieux cliniques.
Abstract
SIVQ-LCM est une nouvelle méthodologie qui automatise et rationalise le processus de dissection laser dépend utilisateur plus traditionnel. Il vise à créer une plate-forme technologique de dissection laser de pointe, rapidement personnalisable. Dans ce rapport, nous décrivons l'intégration du logiciel d'analyse d'image spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ) sur l'instrument ArcturusXT. Le système contient à la fois un ArcturusXT infrarouge (IR) et ultraviolet (UV), laser, permettant une cellule particulière ou de grandes dissections de la région. Le but principal est d'améliorer la vitesse, la précision et la reproductibilité de la dissection laser pour augmenter le débit d'échantillons. Cette nouvelle approche facilite microdissection des deux tissus animaux et humains dans la recherche et la gestion des patients.
Introduction
Initialement développé dans le milieu des années 1990, microdissection laser (LCM) permet à l'utilisateur de capturer précisément des cellules spécifiques ou des régions cellulaires à partir d'une section de tissu histologique par visualisation microscopique 1, 2. De nombreuses études comparant l'analyse moléculaire de LCM contre les éraflures de tissus illustrent l'intérêt de la méthode 3-12. En outre, il ya trois publications de protocole vidéo sur la technologie qui sont disponibles pour l'affichage 13, 14. Cependant, en dépit de sa valeur éprouvée, LCM peut être fastidieuse et laborieuse lorsque la cible d'intérêt est une population de cellules dispersées dans une coupe de tissu hétérogène, ou quand un grand nombre de cellules sont nécessaires pour des applications spécifiques en aval telles que la protéomique. La charge qui pèse sur l'opérateur humain nous a conduit à développer une approche semi-automatique dissection pour LCM en combinant un algorithme d'analyse d'image puissant pour guider le processus de LCM 15.
<p class = "jove_content"> En collaboration avec l'Université du Michigan, notre laboratoire du NIH étendu précédemment développé et rapporté spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ) algorithme de manière à lui permettre de semi-automatiser le processus de sélection des tissus intrinsèque à guidée microdissection, rendant ainsi disponible un outil avec le pathologiste ou la vie scientifique à l'esprit. Spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ) est un algorithme qui permet à l'utilisateur de simplement "cliquer" sur une caractéristique histologique d'intérêt pour créer un vecteur d'anneau (de caractéristique d'image prédicat) qui peut être utilisé pour rechercher l'ensemble de l'image histologique, en ajustant le seuil statistique 16 à 21 selon les besoins. La carte de chaleur résultante affiche la qualité des matchs à la fonction initiale de l'image sous-jacente et est ensuite converti en une seule couleur (rouge) de la carte d'annotation qui peut être importé dans l'instrument de LCM. Le logiciel de sélection automatique, AutoScanXT, est ensuite utilisé pour dessiner une carte à base desur l'annotation de guidage SIVQ la capture de cellules cibles à partir de l'échantillon de tissu. Le protocole détaillé ci-dessous décrit la mise en œuvre de SIVQ dans le workflow de microdissection.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole décrit a été utilisé conformément aux règles du NIH sur l'utilisation des échantillons de tissus humains.
1. Préparation des tissus
- Avant de commencer, obtenir des échantillons de tissus humains selon (CISR) Les protocoles d'examen institutionnel.
- Choisissez le type de bloc de tissus / cellules et la méthode de traitement correspondant [fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), congelés, ou de l'éthanol-fixe paraffine (EFPE)]. Fixation au formol fournit histologie optimale, suivie par la fixation de l'éthanol et surgelés. Cependant, de fixation et de tissus méthodes de traitement peuvent affecter l'ADN, l'ARN, et la quantité et de la qualité pour l'analyse moléculaire des protéines en aval et doivent être pris en considération.
- Couper les sections de bloc de tissu / cellules sur le type coulissant (verre, verre à membrane, membrane ou structure métallique) de choix. Analyse SIVQ fonctionne aussi bien sur les trois types de diapositives. S'il vous plaît noter que la méthode pseudo-lamelle (décrit ci-dessous) avec les xylènes et ethanol ne peut être effectuée sur les lames de la membrane de structure métallique depuis la diapositive doit être inversée sur la scène.
- Sélectionner une tache chimique ou à base d'un tissu IHC pour identifier les cellules d'intérêt à partir de l'arrière-plan. Notez que les méthodes de coloration peuvent également affecter l'ADN, de l'ARN, et la qualité et la quantité de protéine du tissu. Testez le tissu après coloration pour évaluer la qualité de base de biomolécules avant de poursuivre avec le protocole. SIVQ-LCM a été réalisée sur des lames de tissu / cytologie colorées avec: immunohistochimie (IHC) avec DAB 15, immunofluorescence, rouge rapide, de novo rouge, bleu de toluidine, et hématoxyline et l'éosine (H & E) (données non publiées).
2. Échantillons Imaging
- Charge glisse sur la platine motorisée de l'instrument de microdissection et lancer le logiciel connexe. Sélectionnez les cases à cocher pour désigner les positions des lames chargées et s'assurer que les fichiers image capturés doivent être enregistrés au format jpeg.
- Optimiser l'imla qualité de l'âge en ajustant la luminosité et netteté de l'image sur l'écran, en utilisant la molette de mise au point manuelle ou par le logiciel de l'instrument de dissection.
- Utilisation de la Boîte à outils de l'image dans le logiciel de l'instrument de dissection, régler le gain de luminosité de la lampe et l'appareil photo de manière appropriée. Des exemples de valeurs sont la luminosité = 60 et le gain = 220, avec le diffuseur.
- Concentrez soit manuellement ou avec la fonction de mise au point automatique dans le logiciel.
- Capturer une image d'ensemble des vignettes de la glissière pour fournir une feuille de route pour le processus de dissection.
- Pour optimiser la qualité d'une lame uncoverslipped d'image, utiliser le diffuseur au-dessous du condenseur sur l'instrument, ou, ajouter une petite quantité (~ 30 pi) de l'éthanol ou de xylène pour améliorer l'indice de réfraction (pseudo-lamelle). Lors de l'utilisation des xylènes, être conscients qu'ils sont les mesures de sécurité appropriées toxiques et doivent être utilisées, y compris l'utilisation d'une hotte et une blouse de protection, des lunettes de protection et des gants.
- Ne pas placer le couvercle de LCM sur la lame jusqu'à ce que la solution de l'éthanol ou les xylènes a complètement disparu ou le polymère sur le plafond sera déformée.
- Naviguer sur le toboggan et de capturer des images des zones à disséqués à 10X, 20X, ou 40X. Si nécessaire, améliorer l'image avec un logiciel comme la correction automatique (dans Microsoft Office Picture Manager) comme décrit précédemment 22. Les images doivent être capturées en format jpeg pour leur permettre d'être réimportés dans le logiciel de sélection automatique.
3. L'algorithme d'analyse de l'image
- Transfert des images capturées à partir de l'instrument de microdissection au dossier SIVQ. Installer et ouvrir les logiciels ArcturusXT, balayage automatique et SIVQ sur l'ordinateur relié à l'instrument de dissection. Pour accéder au logiciel de SIVQ, s'il vous plaît communiquer avec M. Ulysse Balis (ulysses@med.umich.edu).
- Ouvrir SIVQ et charger l'image capturée (jpeg) d'intérêt. </ Li>
- Naviguer à la zone d'intérêt et / ou d'ajuster la taille des fenêtres d'affichage (Viewport 5 & 6). Dans le logiciel de SIVQ, Fenêtre 5 montre l'image de pré-traitement et Fenêtre 6 montre l'image post-traitement 16.
- Choisir la taille du vecteur d'anneau et le nombre de cycles à utiliser.
- Sélectionnez le prédicat d'image caractéristique d'être capturé par un clic droit sur elle dans fenêtre 6.
- Cliquez sur "scan" pour analyser l'image.
- Ajuster la probabilité statistique d'appariement d'images en utilisant les deux barres coulissantes. La barre supérieure permet de régler la spécificité globale de vecteur, et est utilisé pour exclure la zone de l'analyse initiale (avec une sensibilité telle que définie par la variable sélectionnée "Stat") qui peuvent représenter zone comprise excessive. Inversement, le curseur du bas est utilisé pour augmenter la sensibilité, après une analyse est effectuée, avec l'intention de la zone de plus en plus qui est classé comme étant un match. Ces deux contrôles de curseur UTIliser la variable "Stat" que le seuil initial de sensibilité de base.
- Pour enregistrer l'image, cliquez sur "enregistrer sous jpeg" (l'image est maintenant enregistré dans c :/ vq_test dossier / photos).
- Analyser l'image avec l'algorithme. La sortie de l'analyse de l'algorithme doit aboutir à une image annotée pour qu'il puisse être utilisé dans SIVQ-LCM. À l'heure actuelle, la version actuelle du moteur de base SIVQ est en version beta test avec l'espoir que la version de production complet (disponible Q1 2014) intégrera un kit de développement logiciel complet (SDK) et l'interface de programmation d'application (API) pour une intégration simplifiée de filtres spatiaux générés par les utilisateurs en aval et les étapes de traitement des données de flux de travail avec le moteur bague assortie de base. Ce SDK sera distribué avec un ensemble complet de documentation.
- Assurez-vous que la carte thermique SIVQ est remplacée par une couleur rouge uniforme.
- Exporter l'image. Il est essentiel d'incorporer de nouveau les coordonnées de position dans la post-analyse d'images jpeg en utilisant un éditeur hexadécimal à coller dans l'en-tête de fichier de l'image originale de l'instrument de dissection. Les données appropriées peuvent être trouvées entre "Début de l'image" marqueur (0xFF, 0xD8) et le premier "Définir quantification tableau" marqueur (0xFF, 0xDB).
4. Microdissection
- Placer le capuchon de LCM au centre de la région d'intérêt, où les images ont été capturées pour l'analyse de SIVQ.
- Étalonner et de contrôle de qualité (QC), les lasers UV / IR et optimiser les paramètres, y compris l'énergie, la durée, les lieux de laser, et la vitesse de coupe UV (tel que recommandé par le fabricant). Réaliser ces étalonnages avant de réimporter l'image analysée.
- Ouvrir AutoScanXT (logiciel de sélection automatique) et importer l'image analysée à partir de c :/ vq_test dossier / photos.
- Former le logiciel de sélection automatique de reconnaître l'annotation de SIVQ et créer la carte de dissection.
- Pour créer un training fichier, sélectionner quatre régions d'intérêt (marquées par "cercles bleus») sur la "peinture rouge" de l'image analysée de SIVQ.
- Sélectionnez les zones de fond (marquées par "carrés rouges") qui ne sont pas à être disséqué.
- Cliquez sur le bouton "Analyser" pour générer le fichier de formation, qui peut être sauvegardé pour les utilisations ultérieures.
- Effectuer la microdissection à l'aide du infrarouge approprié (IR) et / ou ultraviolet (UV) des lasers.
- Copiez les zones sélectionnées sur l'image «live».
- Dans le "microdissect« boîte à outils, sélectionnez la capture d'IR approprié ou boutons de coupe UV.
- Après la dissection est terminée, déplacer le bouchon de LCM à la station de QC et capturer une image des tissus / cellules disséquées. Une autre approche consiste à placer le bouchon sur une zone vide de la diapositive avant de passer à la station de Québec, ce qui permet à l'utilisateur de prendre des photos à différents grossissements.
- Capturer une image de la zone de tissu d'intérêt après microdissection pour mieux évaluer l'efficacité de levage.
- Si les cellules souhaitées ont été disséqués avec succès, cliquez sur le bouton "présente étape" dans le logiciel ArcturusXT et enlever le bouchon de LCM pour lancer la procédure d'extraction moléculaire pour l'analyse en aval.
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Representative Results
Une section de tissu mammaire humain FFPE a été immunocoloré pour cytokératine AE1/AE3 utilisant un protocole IHC norme 23. Après coloration, la lame de tissu a été posé sur la platine et le protocole ArcturusXT SIVQ-LCM a été ouverte comme décrit ci-dessus. Depuis le tissu ne peut pas être une lamelle de microdissection, les cellules colorées + IHC peuvent être difficiles à discerner visuellement (figure 1A). Ainsi, pour assurer une meilleure adaptation d'indice et une image améliorée, les xylènes sont ajoutés à la coupe de tissu pour créer un pseudo-lamelle 15 (figure 1B). Une image jpeg a ensuite été capturé de la zone de pseudo-une lamelle et importé dans SIVQ pour l'analyse de l'algorithme. Une image principale fonction (DAB tache brun foncé) sélectionné par l'utilisateur a lancé l'algorithme de SIVQ pour analyser l'image (figure 1C). La carte thermique de SIVQ a ensuite été convertie en une "peinture rouge" qui est reconnu par le logiciel de sélection automatique (Figure 1D). Les xylènes ont été autorisés à s'évaporer et la carte thermique de SIVQ ont été importés dans le logiciel de sélection automatique (figure 1E) et les cellules ont été disséqués en surbrillance avec le laser IR. Le bouchon de LCM a ensuite été transféré à la gare QC de l'instrument ArcturusXT et inspecté visuellement pour évaluer l'efficacité dissection (figure 1F). Le tissu restant a également été inspecté (figure 1G) et la carte thermique de SIVQ été réimportés afin d'évaluer davantage l'efficacité de microdissection (figure 1H).
Figure 1. SIVQ-LCM de IHC taché tissu mammaire FFPE. A) l'image Uncoverslipped de cytokératine AE1/AE3 taché tissu mammaire FFPE. B) l'image xylènes couché (pseudo-une lamelle) de panneau A.
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Discussion
Nous présentons un protocole pour l'application de SIVQ-LCM à microdissect cellules épithéliales immunocolorées de FFPE tissu mammaire humain. L'utilisation d'un algorithme d'analyse d'image, tel que SIVQ, réduit la quantité de mains sur le temps requis pour le processus de microdissection. Il s'agit d'un progrès potentiellement important pour le domaine de temps et d'efforts depuis l'opérateur est typiquement l'étape limitante pour la dissection précise des cellules d'intérêt. Dans le présent protocole, nous avons adapté spécifiquement notre procédure à l'instrument ArcturusXT, mais il sera probablement possible d'adapter SIVQ et autres algorithmes à d'autres instruments de microdissection disponibles dans le commerce ainsi. En plus d'améliorer l'efficacité, cette nouvelle approche peut permettre aux utilisateurs qui sont des experts non-histopathologie pour effectuer microdissection. Enfin, l'utilisation d'un algorithme permettant de conduire le processus de microdissection peut permettre une plus grande reproductibilité de site à site utilisateur en supprimant la subjectivité dans les cellules identifiant o intérêt de f.
Alors que SIVQ présente une large capacité d'adaptation à de multiples catégories d'images objet, y compris l'histologie, il est important de reconnaître qu'il n'est pas destiné à servir d'outil de transformation / segmentation d'image universelle, mais plutôt comme un choix de premier passage de premier plan à haut rendement outil. Utilisé de cette capacité, il a une grande utilité pour prédire si oui ou non une classe particulière de l'imagerie sujet est approprié pour les approches de segmentation numériques. Lorsque SIVQ est réussie, il est puissance prédictive qui soit: a) une approche d'analyse d'image / segmentation plus fine et ciblée sera couronnée de succès et / ou b) un, SIVQ vecteur sélectionné machine optimisé sera efficace pour rendre une clinique solution de flux de travail prêts. Dans les deux cas, l'utilisation de SIVQ est un outil de triage efficace pour identifier imagerie sujet qui pose des solutions de calcul traitables en termes de segmentabilité premier plan.
ntent "> Alors que nous avons décrit précédemment l'utilisation du protocole SIVQ-LCM seulement pour des expériences d'expression de l'ARNm de microréseaux 15, nous pensons que le protocole est applicable à la plupart des dosages moléculaires en aval, et peut être particulièrement utile pour des analyses moléculaires qui nécessitent un grand nombre de cellules, tels que la protéomique. Pour ces études, de grandes quantités de cellules doivent être acquis en raison de l'incapacité à amplifier protéines. De plus, l'avènement de nouvelles technologies, telles que Next-Gen Sequencing (NGS), met l'accent sur la nécessité de commencer avec comme d'un échantillon pur que possible. L'aptitude à SIVQ-LCM pour isoler les cellules par l'intermédiaire de deux caractéristiques morphologiques et / ou des qualités de coloration pourrait permettre à la capacité d'isoler plus facilement les populations cellulaires pures.Il est essentiel d'avoir un tissu bien préparés pour des résultats reproductibles à la fois pour l'analyse de SIVQ et microdissection. Pour des conditions optimales pour LCM, il est préférable d'effectuer dissèque dans une pièce à faible humidité et bien entretenir déshydratationdrated tissu. En outre, veiller à ce que la coloration du tissu est reproductible. Enfin, la familiarité avec l'instrument de dissection est essentiel à la réussite de SIVQ-LCM.
Le protocole SIVQ-LCM présenté ici est le premier pas vers la microdissection semi-automatique, qui peut avoir des applications dans les essais cliniques futurs, car les méthodes de dissection actuelles ne sont pas facilement capables de gérer des charges de travail. En résumé, nous pensons que SIVQ-LCM est une nouvelle incursion dans le domaine de la microdissection automatisé et fournit un point de départ à partir duquel les enquêteurs et les développeurs d'algorithmes peuvent améliorer la technologie.
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Disclosures
Michael R. Emmert-Buck est un inventeur sur les brevets NIH-détenus couvrant microdissection laser et reçoit des paiements sur la base de droits à travers le Programme de transfert de technologie NIH.
Acknowledgments
L'étude a été financée en partie par le Programme de recherche intra-muros des Instituts nationaux de la santé, Institut national du cancer, Centre de recherche sur le cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
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