Summary
Die Anwendung der Matrix-unterstützten Laserdesorption / Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) direkt an Blutkulturbrühe beschleunigt die Identifizierung von Bakterien. Das vorgestellte Verfahren ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe.
Abstract
Eine wichtige Rolle der klinischen Mikrobiologie-Labor ist eine schnelle Identifizierung von Bakterien, die Infektion der Blutbahn liefern. Traditionelle Identifizierung erfordert die Subkultur der signalisiert Blutkulturbrühe mit Identifikations erst verfügbar, nachdem Kolonien auf festen Agar sind gereift. MALDI-TOF-MS ist ein zuverlässiges, schnelles Verfahren zur Identifizierung der meisten klinisch relevanten Bakterien als Kolonien auf festem Medium aufgebracht. Die Anwendung der MALDI-TOF-MS direkt an Blutkulturbrühe ist ein attraktiver Ansatz, da sie das Potenzial hat, Artbestimmung von Bakterien beschleunigen und zu verbessern klinische Management. Allerdings ist ein wichtiges Problem zu überwinden, die Pre-Analyse Entfernung von störenden Harze, Proteine und Hämoglobin in Blutkulturproben, die, wenn nicht entfernt werden, stören die MS-Spektren und kann zu einer unzureichenden oder niedrigen Diskriminierung Identifizierung Partituren Ergebnis enthalten. Zusätzlich ist es notwendig, bacter konzentrierenia zu entwickeln Spektren von ausreichender Qualität. Die vorgestellte Methode beschreibt die Konzentration, Reinigung und Gewinnung von Gram-negativen Bakterien so dass für die frühzeitige Identifizierung von Bakterien aus einer Blutkultur signalisiert Brühe.
Introduction
Patienten mit Infektion der Blutbahn (BSI) durch Bakterien weiterhin hohe Mortalität im Krankenhaus haben, angefangen von 6 bis 48% ein. Die Lieferung der entsprechenden Antibiotika fördert das Überleben und in der Untergruppe der Patienten mit schwerer Sepsis, jede Stunde Verzögerung, um eine geeignete Therapie korreliert mit verringerten Überlebens 2,3. Dementsprechend ist ein zentrales Ziel der klinischen Labor, um schnell zu erkennen, zu identifizieren und kommunizieren die Anwesenheit von Bakterien in Blutkulturen, klinische Entscheidungen. Es hat sich gezeigt, dass die mikrobiologischen Labor hat den größten Einfluss auf eine antimikrobielle Therapie bei der Berichterstattung über die Gram-Färbung 4 und vor kurzem eine Beobachtungsstudie gezeigt, dass Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) direkt auf die Blutkulturbrühen durchgeführt beeinflussen Verschreibung in über einem Drittel der BSI, die durch Gram-negative Bakterien verursacht werden 5.
6,7 führte. Die Technologie ist mittlerweile etabliert und hat sich in vielen Labors für die schnelle und genaue Identifizierung von Mikroorganismen isoliert auf festen Medien 6,8 integriert. Die direkte Anwendung der MALDI-TOF-MS zu Blutkultur (BC) Brühe, die für Mikroorganismen appelliert an beide Kliniker und Laborleiter, weil das Potenzial, eine frühere Identifizierung von Mikroorganismen bei niedrigen Kosten zu erhalten "positiv" signalisiert haben.
Der klinische Nutzen der direkten Anwendung der MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe wurde von der breiten Palette der beobachteten Empfindlichkeiten beschränkt worden, als mit Standard-phänotypischen Kultur Methoden der Identifizierung, mit Berichten über erfolgreiche Identifizierung von Gram-negativen Bakterien bis hin verglichen 47-98,9 9-11%. Die Variation in der Empfindlichkeit wahrscheinlichbezieht sich auf die Zusammensetzung BC Brühe, Anfangsbakterienkonzentration, Variation in der Probenvorbereitung Methoden sowie die Anordnung von Gram-negativen Organismen in Studienpopulationen 9 gestoßen. Verglichen mit diesen anderen veröffentlichten Protokollen der hier vorgestellten Verfahren vermeidet die Verwendung von Ethanol, Ammoniumchlorid oder zusätzliche (nicht-Matrix) Acetonitril. Als Ergebnis wird das Bakterienpellet lebensfähig bleiben (bis zum Punkt des Proteinextraktion) unter Berücksichtigung der potentiellen phänotypischen Suszeptibilität Testverfahren unmittelbar auf diese Organismen in der Brühe verwendet werden. Darüber hinaus hat das vorgestellte Verfahren wurde gezeigt, kostengünstige, zuverlässige und rasche Identifizierung von Bakterien mit innerhalb von 25 min der Blutkultur Gramfärbung Ergebnisse mit minimalen "hands on" Zeit 12 ist.
Diese Methode ist eine einfache Inhouse-Spin-Lyse-Protokoll unter Verwendung von Ameisensäure Extraktion Gram-negative b identifizieren direkt an positiven Blutkulturbrühen angewendetacteria mit MALDI-TOF-MS-Technologie.
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Protocol
1. Blutkultur Brühen Flagge als "Positiv"
- Entfernen Sie die signalisiert Blutkulturflasche von der kontinuierlichen Überwachung Brutschrank und legen Sie sie in einem biologischen Sicherheitsschrank. Hinweis: Die Flaschen können gefährliche Mikroorganismen enthalten und allgemeine Vorsichtsmaßnahmen befolgt werden müssen. Wegen der Gefahr von Infektions Aerosole bei der Probenahme, müssen alle Stichprobenverfahren in einem Biosafety Klasse II Sterilbank durchgeführt werden.
2. Gram Stain ist bereit
- Bereiten Sie eine Gram-Färbung aus dem Blut signalisiert Kulturbrühe nach lokalen institutionellen Protokolle. Hinweis: Bei gramnegativen Organismen Mikroskopie identifiziert die Blutkulturbrühe wird nach der folgenden Methode verarbeitet. Wenn Gram-positive Organismen identifiziert werden, wird eine alternative Methode Molekular Targeting genetischen Identifizierung und Resistenzmarker auf dem Medium (in diesem Artikel nicht angesprochen) 13 angelegt.
- Vorsichtig mischen die Blutkulturflasche durch Umdrehen 2-3x.
- Im Rahmen der biologischen Sicherheitsschrank legen Sie eine 10-ml-Spritze mit einer Sicherheitsblutübertragungseinrichtung.
- Befestigen Sie den Bluttransfer-Gerät an den Blutkulturflasche und ziehen 5 ml der Brühe in die Spritze. Übertragen Sie die angesaugte BC Brühe in einer Serumtrennrohr.
4. Konzentration der Blutkulturbrühe
- Zentrifugieren des Serumtrennrohr bei 1250 × g für 15 min, die ein großes Volumen an roten Blutzellen entfernt.
- Absaugen und Verwerfen des Überstandes mit einer sterilen Transferpipette vorsichtig auf ca. 1 ml der Buffy-Coat unmittelbar über dem Gel / Fluid-Grenzfläche zu verlassen. Hinweis: Die Aerobic-Flaschen zeigen eine klare Trennung von roten Blutkörperchen an den Boden des Röhrchens mit dem Gel / Fluid-Grenzfläche erscheinen, eine undurchsichtige weiße Farbe. Wenn im Gegensatzangewendet, um den lytischen anaerobe Blutkulturbrühe das Gel / Fluid-Grenzfläche wird als tiefrote Farbe durch die lysierten roten Blutzellbestandteile im Überstand bleibt suspendiert.
5. Wiederholen Zentrifugation Waschschritte
- Vorsichtig mischen die letzten 1 ml Buffy-Coat-Flüssigkeit über der Gel-Schnittstelle mit einer sterilen Pipette und übertragen das gesamte Volumen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen dann. Zentrifugieren Sie die neue Röhre bei 288 g für 30 Sekunden.
- Den Überstand mit einem Kunststoff-Einweg-1 ml Transferpipette in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Röhrchen mit dem Pellet. Hinweis: Es ist wichtig, in diesem Schritt, wird darauf geachtet, die Übertragung des Pellets zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig für eine Probe aus der anaeroben BC Flasche verarbeitet, wie der Überstand bleibt und die pigmentierte Pellets ist nicht immer klar ersichtlich.
6. Lyse der Rest Cells
7. Extraktion bakterieller Proteine
- Absaugen und den Überstand verwerfen, wieder mit Aspiration mit einer feinen Spitze Pipette sicherzustellen, dass so viel Flüssigkeit wie möglich entfernt wird.
- Das Pellet in 10 &mgr; l Ameisensäure (70% v / v). Hinweis: Ameisensäure kann den Körper beeinflussen, wenn es eingeatmet wird oder wenn es in Kontakt mit der Haut kommt. Bei der Erstellung oder Manipulation von Lösungen ist es rMPFOHLENE, dass die Mitarbeiter mit einem Abzugsschrank neben persönlicher Schutzausrüstung.
- Gut mischen mit der Pipette, um eine homogene Lösung resuspendiert gewährleisten. Verwendung der Pipettenspitze physisch stören das Pellet kann notwendig sein, um eine homogene Lösung zu gewährleisten.
8. Herstellung der MALDI-TOF-Zielplatte
- Impfen eine saubere MALDI-TOF-Zielplatte mit 2 ul der hergestellten Suspension pro Zielpunkt. Bereiten Sie 3 Zielstellen für jede Probe, um die gelegentliche Problem der gescheiterten liest überwinden.
- Damit der MALDI-TOF-Zielplatte zu trocknen. Die Trocknungsgeschwindigkeit kann, indem man die Platte am Rand der Abzugshaube um den Luftstrom über die Platte zu maximieren erhöht werden.
- Überlagern getrocknet Spot mit 1 ul der Matrixlösung (10 mg / ml α-Cyano-4-Hydroxy-Säure (HCCA), 50% Acetonitril, 2,5% Trifluoressigsäure). Hinweis: Matrix-Lösung kann den Körper beeinflussen, wenn es eingeatmet wird oder wenn es in conta kommtct mit der Haut. Bei der Erstellung oder Manipulation Lösungen empfiehlt es sich, dass die Mitarbeiter mit einem Abzugsschrank neben persönlicher Schutzausrüstung.
- Damit der MALDI-TOF-Zielplatte auf dem Rand des Abzugs wie oben beschrieben zu trocknen. Gewährleisten eine homogene Zubereitung füllt jede der Zielstellen auf der Platte.
9. Platz MALDI-TOF-Zieltafel in das Massenspektrometer
- Legen Sie die MALDI-TOF-Zielplatte in die MALDI-TOF-Massenspektrometer. Stellen Sie sicher, die Platte sitzt bündig mit den federbelasteten Platten. Hinweis: nicht die Zielplatte nicht ein, bis alle Ziel Flecken trocken sind.
- Sicherstellen, dass die Gummidichtung ist sauber von Fusseln, Staub und Haare, damit die erforderlichen Vakuumbedingungen geschaffen werden.
- Schließen Sie die MALDI-TOF-Bühne Deckel und drücken Sie die "In / Out"-Taste auf der Vorderseite des Gerätes. Der Deckel wird nun sperren und damit das erforderliche Vakuum geschaffen werden.
10. MALDI-TOF-MS-SPectra Acquisition
- Öffnen Sie die MALDI Biotypisierung und Flexcontrol-Software.
- Innerhalb der Typing Software wählen Sie "neue Klassifizierung" aus dem Dropdown-Menü "Datei" betitelt. Nennen Sie das Projekt und wählen Sie dann "neu". Wählen Sie "Weiter", um das Setup im Typing Software abzuschließen.
- Innerhalb der Software-Systemsteuerung identifizieren die Grafik der Zielscheibe auf dem Bildschirm. Markieren Sie die MALDI-TOF-Ziel-Spots, die in Gebrauch sind, indem Sie die Maus über die Punkte eingeimpft, während Sie die linke Maustaste gedrückt halten.
- Mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Stelle auf der ausgewählten Zielpositionen Maustaste und wählen Sie dann "addieren Analyte" aus dem Dropdown-Menü.
- In Blutkultur Identifikationsdaten in die Spalte "ID" für jede der Ziel Flecken und klicken Sie auf "weiter", wenn Sie fertig.
- Wählen Sie den Werbespot "Taxonomie" Spektrendatenbank, und wählen Sie "Weiter". Hinweis: Labotorien verwenden kann zusätzliche in-house oder kommerziellen Datenbanken, um die Anzahl von Referenzspektren zu erhöhen.
- Klicken Sie auf "Finish" und der MALDI-TOF-MS-Spektren erzeugen beginnen wird. Hinweis: MALDI-TOF-Einstellungen waren nach Herstellereinstellungen (linear positiven Modus, 60 Hz Laserfrequenz, 20 kV Beschleunigungsspannung, 16,7 kV IS2 Spannung, 170 ns Verzögerung Extraktion und 2,000-20,137 m / z-Bereich).
- Wenn die MALDI-Control-Software nicht auf Gipfeln zu erzeugen, kann die manuelle Erfassung von Spektren durchgeführt werden (Methode nicht beschrieben).
11. Beitrag Analyse Interpretation der MALDI-TOF-MS-Ticker
- Sobald die Spektren erfasst und Analyse abgeschlossen ist, wählen Sie die "+"-Button neben Artbestimmung auf der Typing Software, um die Identifikationsliste für jede Ziel erweitern.
- Studieren Sie die Top-5-Identifikationen und stellt fest, ob die Top-5 sind ähnlich. Discordant Top 5 Gattungen mit Noten ≥ 1.7 der gleichen ZielOrt erhöht die Möglichkeit der Mischbrühen. Hinweis: MALDI-TOF-Technologie hat schlechte Empfindlichkeit für den Nachweis von Mischbrühen. Wenn beispielsweise eine Brühe enthält gemischte Spezies eine hohe Vertrauensbewertung kann nur eine der gemischten Spezies identifiziert werden.
- Wenn ein Score ≥ 2.0 ist für das höchste Spiel auf einem Zielpunkt festgestellt, berichten die Arten.
- Wenn die höchste Punktzahl auf einem Zielpunkt ist ≥ 1,7, aber <2,0, berichten nur die Gattungen. Wenn zusätzliche Kriterien der Top-5-Identifikationen sind übereinstimmende, dann auf Artenebene zu melden.
12. Entfernung von MALDI-TOF-Zielplatte
- Wenn alle Spektren sind komplette drücken Sie die "In / Out" auf der MALDI-TOF-Maschine.
- Öffnen Sie die MALDI-TOF-Zielplatte Behälter und entfernen Sie die MALDI-TOF-Zielplatte.
- Wenn Sie eine wiederverwendbare MALDI-TOF-Zieltafel, sauber, alle Ziel Flecken mit Alkohol und speichern die MALDI-TOF-Platte bei RT, wenn es sauber und trocken ist.
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Representative Results
Die erzeugte MALDI-TOF MS-Spektren sind mit der integrierten Referenzspektren der Datenbank verglichen. Eine logarithmische Score ist für das Vertrauen der Partie zwischen dem Test-Isolat und der Referenzdatenbank isoliert, mit der Empfehlung von einem Score ≥ 1,7 für wahrscheinlich, Identifikation zu Gattungen Ebene (Abbildung 1) und ≥ 2,0 für wahrscheinliche Identifizierung von Arten (Abbildung erforderlich zugeordnet 2). Bericht zur Art, wenn die Punktzahl ≥ 1.7 und die ersten 5 Identifikationen von der Typing Software abgestimmt ist konsistent (Abbildung 1) 12. Abbildung 3 zeigt das Ergebnis, wenn ein Blutkulturbrühe von Mischarten analysiert, in diesem Fall Escherichia coli und Serratia marcescens. Beachten Sie die Top-5 abgestimmt Spektren sind unharmonisch. Es wurde bereits gezeigt, dass gemischte Gattungen erst nach diesem Verfahren in etwa 30% der Mischbrühen 12 identifiziert werden,. Es ist wichtig zu wissen, dass mit einer gemischten Brühe ist es möglich sein, für eine konsequente Bericht einer einzigen Spezies mit einem hohen Vertrauenswert. Tabelle 1 fasst die bisher veröffentlichten Ergebnisse der Überprüfung Studie dieses Verfahren, in dem 91,8% der monomicrobial Brühen erreicht ein MALDI-TOF-Score von> 1,7 bei 100% und 97,0% Konkordanz zur Gattung und Arten, bzw. 12.
Abbildung 1. Die MALDI-TOF MS erzeugten Spektren für Escherichia coli mit einer logarithmischen Punktzahl von 1.861. Rechts ist die ersten 5 Spiele vom Typing Software identifiziert. Beachten Sie, dass die Spezies wird durchweg als Escherichia coli berichtet. Mit dem Score von 1.861 und mit den Top-5-Spiele als E. coli wird als die Identifikations zuverlässig bis zur Art 12. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die MALDI-TOF MS erzeugten Spektren für Pseudomonas aeruginosa mit einer logarithmischen Punktzahl von 2.216. Rechts ist die ersten 5 Spiele vom Typing Software identifiziert. Beachten Sie, dass die Art ist konsequent als Pseudomonas aeruginosa berichtet. Mit der hohen Punktzahl von 2.216 die Identifikation als zuverlässig bis zur Art der Identifikation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die MALDI-TOF MS erzeugten Spektren für eine gemischte Blutkulturbrühe, Escherichia coli und Serratia marcescens. Rechts sind die ersten 5 Spiele vom Typing Software, die sowohl Escherichia coli und Serratia marcescens in den ersten 5 abgestimmt Spektren berichtet identifiziert . Diese gemischte Gattungen nur in etwa ein Drittel der Mischbrühe Kulturen 12 identifiziert. Verbesserte Versionen der Software in der Zukunft kann die Erkennung von Mischkulturen zu verbessern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Tabelle 1. Verification Daten vergleichen MALDI-TOF-MS auf die Blutkulturbrühe direkt durchgeführt mit anschließender phänotypische Identifizierung auf subkultiviert Kolonien. Concordant Identifizierung benötigt eine Massenspektrometrie Punktzahl auf Blutkulturbrühe ≥ 1.7. Diese Tabelle wird von einer früheren Publikation 12 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Es ist wichtig, bei der Anwendung von MALDI-TOF-MS, um den Blutkulturbrühe, die die Post Zentrifugationsschritte werden mit ausreichender Sorgfalt durchgeführt, nicht die getrennten Komponenten remixen. Es ist besonders wichtig, die Blutkulturbestandteilen und humanen zellulären Proteine, einschließlich Hämoglobin, das Spikes Störung der MALDI-TOF-Spektren erzeugen können, zu entfernen.
Obwohl MS Hersteller empfehlen der Partitur von ≥ 2,0 für Arten geschnitten und ≥ 1,7 für Gattung Identifikation, haben andere Berichte unteren logarithmischen Scores (Bereich ≥ 1,4 bis ≥ 1.6) implementiert, wenn BC Brühe 10,12,14-18 angewendet werden vorgeschlagen. Die Umsetzung der unteren MS-Identifizierung Partituren in der klinischen Mikrobiologie Laboratorien sollten nur nach entsprechenden lokalen regulatorischen und Validierungsverfahren berücksichtigt werden.
Gelegentlich schlechte Spektren werden durch dieses Verfahren die entweder keine Übereinstimmung erzeugt werden, oder mit l berichtetow Vertrauenswerte. Darstellende doppelt oder dreifach-Spots für jedes Isolat kann die Unannehmlichkeiten der Wiederholung des Experiments, wenn ein einzelner Ort nicht zu verringern. Selten werden alle doppelten Punkte nicht ausreichend punkten für die Identifizierung. Die Ursache der schlechten Identifizierung kann durch unvollständige Datenbanksätze sein, oder allgemeiner, als ein Ergebnis eines niedrigen Ausgangskonzentration von Bakterien im Blutkulturbrühe. In einer veröffentlichten Validierungssatz für die vorgestellte Methode eine Punktzahl von <1,7 wurde in 8% der klinischen Isolate gestoßen und hatte ein leichtes Übergewicht, wenn sie auf anaerobe Blutkulturflaschen 12 durchgeführt.
MALDI-TOF-MS-Technologie ist nicht in der Lage, alle üblichen klinischen Gram-negative Bakterien, auch wenn isoliert auf festen Medien zu trennen. Zum Beispiel E. coli nicht von Shigella-Spezies zu unterscheiden, und die Gattungen Salmonella nicht speziatisierten werden. Wie in den Ergebnissen beschrieben ist es wichtig zu erkennen, than, wenn Sie MALDI-TOF direkt auf die Blutkulturbrühe die Empfindlichkeit für den Nachweis von Mischarten ist gering 11,12,18,19.
Insgesamt bietet dieser Ansatz eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode zur Identifizierung von über 90% der Gram-negativen Blutkultur-Isolate innerhalb von 25 min einer Blutkulturbrühe Signalisierung.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer - Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 ml | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 ml) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
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