Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

原代大鼠乳鼠心肌细胞的活细胞成像继腺病毒和慢病毒转导利用共聚焦旋转盘显微镜

Published: June 24, 2014 doi: 10.3791/51666
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2, 2
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

Abstract

原代大鼠新生心肌细胞是有用的基本体外心血管研究，因为它们可以很容易地分离出大量的单一步骤。由于在显微镜技术的进步是相对容易捕捉到活细胞的图像进行调查的实时有关的光毒性的细胞的细胞事件以最小的关注的目的。本协议描述了如何利用共聚焦旋转盘显微镜下慢病毒和腺病毒转导调节细胞的特性采取原代大鼠乳鼠心肌细胞的活细胞慢速拍摄的图像。两种不同类型的病毒的应用可以更容易地实现合适的转导率和表达水平的两个不同的基因。以及聚焦活细胞图像可以使用显微镜的自动对焦系统，可以保持稳定的聚焦长的时间段来获得。应用这种方法，外源性工程师的功能表达在培养的原代细胞编蛋白进行分析。此外，该系统可用于通过化学式调制器的使用的siRNA以及检查基因的功能。

Introduction

原代大鼠新生心肌早已被用于体外 1调查心肌功能。他们很容易从幼鼠由几个公认的方法2-4隔离开来。最常见的方法使用胶原酶或胰蛋白酶消化之前，细胞分离心脏的结缔组织。研究人员还开发了从成年啮齿动物5-8以及新生小鼠9,10分离心肌细胞的方法。

这个协议描述了从新生大鼠幼仔分离心肌细胞，采用两步酶消化过程的方法。胰蛋白酶是第一次使用O / N在4℃，然后纯化胶原酶在37°C心脏组织用胰蛋白酶O / N的潜伏期在4℃可减少相比，使用顺序孵化在一个温暖的酶液2种方法需要收获细胞的步骤。此外，通过使用纯化的共llagenase而不是粗酶液，批与批之间的变化可以被消除，从而提供增强的可重复性。

特定蛋白质的功能性研究经常采用利用腺病毒11-13和/或14-16的慢病毒的蛋白质表达系统。 [忠告]病毒的生产和操作应根据美国国立卫生研究院的指引进行。

腺病毒不整合到宿主基因组中。它具有转导在大多数细胞类型，包括分裂细胞和非分裂细胞，以及原代细胞和建立的细胞系中非常高的效率。这使得腺病毒的可靠载体用于基因表达。高水平的腺病毒载体编码的蛋白的48小时内下列传导开发，并且它们可以持续数周17。然而，一个缺点是使用的腺病毒蛋白质的表达是一种重组腺的发展novirus是既复杂又费时。这个缺点在部分解释了为什么许多研究人员已经转向慢病毒重组基因的表达。与腺病毒的构建，产生慢病毒结构非常简单快捷。虽然慢病毒通常具有转导的低效率比腺病毒，在两个分裂和非分裂细胞，它们整合到宿主基因组中。因此，转基因的表达对于慢病毒比为腺病毒更稳定。

由于在显微镜领域的技术进步，这是很容易捕捉到细胞中表达重组蛋白的活细胞的图像。这甚至在收购视频速率的速度也是如此。这使得研究者确定如何具体改变在感兴趣的蛋白质在功能上影响实时细胞。共聚焦旋转盘显微镜有，使它成为LIV最佳技术的几个关键特性Ë细胞成像18,19。横河电机旋转的光盘允许更快速图像获取，而在同一时间利用少得多的激光功率比点扫描共聚焦显微镜。这两个特殊的特性是由于旋转的盘，其中包含通过该激光同时传递到许多样品的共焦孔。在采集过程中，磁盘本身旋转快速，持续18-20。通过使用显微镜的自动对焦系统，稳定的焦点被维持在很长一段时间。这使研究人员能够采取有重点的活细胞图像。采集的图像回放的电影文件。图像是使用图像分析软件，如ImageJ的21,22，斐济23，或其它市售软件进行分析。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1，隔离乳鼠心肌细胞

  1. 用Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）和补充有胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素（P / S）作为培养基的最低必需培养基（MEM）。添加溴脱氧尿苷（BrdU）标记为介质，以防止成纤维细胞生长为隔离后的第2天。
基础培养基 FBS 的BrdU（MM） P / S（U / ml的）
选择 DMEM 10％ 0 20
第一天 DMEM 10％ 0.1 10
第二天 DMEM / MEM 5％ 0.1 10
进一步培养 DMEM / MEM 5％ 0 10

表1：培养基的大鼠乳鼠心肌细胞使用此媒体为培养新生大鼠心肌细胞。 DMEM / MEM为1:1混合DMEM和MEM培养基中。

  1. 心肌细胞分离，第1天（预计所需时间约1小时）
    注：对于新生儿啮齿动物的工作，是指由动物保健方案设置本地大学的指引和规则，并坚持从制度上批准的动物的协议。在本协议中所述的所有方法已获得耶鲁动物资源中心的机构动物护理和使用委员会。
    1. 制备的试剂和工具：钙和镁的Hank平衡盐溶液（CMF HBSS），30毫升×2，10毫升×2，在冰上; 1毫克胰蛋白酶，重组2毫升CMF方案的HBSS，冰;蒸压工具; 70％乙醇（EtOH中）在250毫升的烧杯中; 4灭菌10厘米塑料餐具，3为心中的隔离，一个用于胰蛋白酶消化。
    2. 订购1利特ER的1到2天的幼鼠（约10只）与实验动物分配器他们的水坝。
    3. 第1天，幼崽转移到小笼子和安乐死大坝与氯胺酮/甲苯噻嗪鸡尾酒（氯胺酮，200ml/10g和甲苯噻嗪20ml/10g）过量。
    4. 拿一个小狗和消毒其整个机身采用70％乙醇。杀头小狗与消毒10厘米塑料盘在其他幼崽分开的一个位置维护良好的锋利手术剪。
      注：为了尽快收集样本，最好是使用最快速有效的方法终止啮齿动物的生命。如果使用得当由熟练的专业人员与维护良好的设备斩首可能导致更少的恐惧和焦虑的动物，并比其他形式的安乐死更快速和实用。它与美国兽医协会的指导方针为动物的安乐死的建议一致。
    5. 删除殴打他艺用无菌工具，并把心脏在30毫升冰冷的CMF的HBSS在50毫升锥形管中。注：卸下心中尽快并立即把它们放在冰上。自体取出后心中，所有程序都必须在冰上进行。
    6. 收集5个心在30毫升的冰冷冻CMF的HBSS，其余5心在另外30毫升冰冷冻CMF的HBSS。旋流管冲洗的心。注：完成此步骤后，执行层流罩的所有程序。
    7. 弃上清，心中转移到冰上了新的消毒10厘米塑料盘。注意：小心不要吸的心与抽吸。
    8. 去除大血管和/或不需要的组织。加入10毫升冰水冷却CMF的HBSS的菜冲洗的心。
    9. 转移所有的心在冰上一个新的消毒10厘米塑料盘。直言不讳的心用剪刀小于1毫米的3冰上。
    10. 添加9毫升冷CMF的HBSS。加入1毫升冷胰蛋白酶reconstituted与CMF的HBSS（最后50微克/毫升）。
    11. 密封菜用封口膜，并用铝箔覆盖它，然后将其放在冷室（4˚C）过夜。
  2. 心肌细胞分离，第2天（预计所需的时间，约4小时）
    1. 制备的试剂和工具：50ml锥形管×2; 2毫克胰蛋白酶抑制剂，重组1毫升CMF方案的HBSS，冰; 1500单位的胶原酶，再生用5毫升的Leibovitz L-15，在室温（RT）;的Leibovitz L-15，再生与1升的无菌水中，并通过0.22微米过滤器，8毫升在RT过滤; 10毫克/毫升（32.6毫摩尔）的BrdU在水中; P / S;的DMEM +10％FBS; MEM; 210厘米塑料细胞培养皿; 3.5厘米玻璃底菜。
    2. 第2天，准备明胶包被的培养皿。加入1毫升0.1％的明胶溶液涂到3.5公分玻璃底培养皿成像实验。菜孵育在37˚C的几个小时，然后吸出和使用之前，将明胶溶液。
      NOTE：3.5公分的玻璃底菜是适合用荧光显微镜成像实验。用于提取蛋白从初级心肌通过蛋白质印迹（WB）来检测蛋白表达，0.1％明胶包被的塑料细胞培养皿都可以使用。
    3. 转让全部心脏组织通过与缓冲胰蛋白酶过夜至50ml锥形管上的冰在无菌罩消化。加入1 ml的胰蛋白酶抑制剂在CMF的HBSS（最终182微克/毫升）。 50毫升锥形管关闭盖子盖紧，以防止污染。
    4. 孵育管中在37˚C培养箱中约30分钟至温热组织和缓冲液至30-37˚C。加入5 ml的胶原酶中的Leibovitz L-15（最终94单位/ ml）。在37˚C的45分钟，轻轻摇动（170-200转振动筛在37˚C培养箱）。
      注意：此步骤可以在层流罩的外面来完成。所有后续步骤应在室温下进行。
    5. 消毒50ml锥形管的外侧，用70％的乙醇，并把它在无菌罩。
    6. 使用自动移液管移液与在速度为3毫升/秒进行20次磨碎的组织。让组织残留沉降3分钟，并过滤上清液以70微米的细胞过滤器。
      注：常规规格10毫升吸管可以用于研磨。
    7. 加入5毫升的Leibovitz L-15的其余组织团块并磨碎，然后再次过滤上清液。用2ml的Leibovitz的L-15的洗细胞滤网。
    8. 放置过滤后的细胞溶液在通风橱中进行20 - 60分钟，以允许胶原酶消化的部分降解胶原蛋白。
    9. 沉淀细胞，在100×g离心 5分钟。重悬细胞于20ml DMEM中含有10％FBS和高浓度的P / S（20单位/毫升）。
    10. 预制板单元上的两个10厘米塑料细胞培养皿1小时的CO 2培养箱中37˚C的心肌选择。注：成纤维细胞更容易附着在培养皿的底部比心肌细胞。
    11. 瓦法兰西岛大区等候，准备含10％FBS，P / S（10单位/毫升）和0.1毫米的BrdU的DMEM。加入1毫升10毫克/毫升的BrdU来325毫升DMEM中含有10％FBS和P / S。
    12. 漩涡的菜肴，并轻轻从两个10厘米菜收集含有心肌细胞上清液。
      注：大多数心肌细胞仍会1小时温育后，浮在上清液中。为了避免被轻易附着在培养皿成纤维细胞污染，不吹打收集上清液。
    13. 可选>计数细胞上清液中有和没有0.2％台盼蓝检查细胞活力。
    14. 沉淀细胞，在100×g离心 5分钟。重悬在含有10％FBS，P / S（10单位/毫升）和0.1mM的BrdU的细胞在DMEM中。板的细胞以2×10 5细胞/皿中观察用显微镜明胶包衣3.5厘米玻璃底培养皿。注意：不要在37˚C。在CO 2培养箱电镀至少24小时后，扰乱细胞
    15. 第3天，查电镀到含有5％FBS，P / S和0.1mM的BrdU的DMEM / MEM后NGE介质24小时。
    16. 第4天，电镀到含有5％FBS和P / S的DMEM / MEM之后改变介质48小时
      注意：变更培养基每2-3天用含有5％FBS和P / S的DMEM / MEM

2，慢病毒转导

  1. 包装慢病毒质粒
    注：请参考其他来源作进一步的深入信息关于这个问题24-26。这将需要大约3天的时间准备慢病毒解决方案。它最好是用新鲜的慢病毒溶液以达到更高的转染效率。启动慢病毒质粒和并行新生大鼠心肌细胞的分离的包装。代替使用聚乙烯亚胺（PEI）27，用于慢病毒质粒的包装，市售的转染试剂都可以使用。按照制造商的说明。
    1. 制备试剂和工具; HEK293T细胞的10cm的塑料细胞培养皿，慢病毒质粒溶液（pMDLg / pRRE，PRSV修订版，pMD2.G，慢病毒转移载体，1.0毫克/毫升每件），1克/升的PEI，无血清培养基，20毫氯在水，10％的漂白剂，在70％乙醇1％SDS中
    2. 第0天 ，板每10cm 2-2.5×10 6 HEK 293T细胞转染菜前一天。
      注：30〜60％汇合在转染是最优的。
    3. 第1天 ，准备PEI转染的解决方案。加30微升1g / l的PEI与在1.5ml管960微升无血清培养基。添加4到质粒在1.5 ml管的PEI转染溶液，并用自攻混合。
    质粒名称注尺寸（KBP） 加入体积（ml） 最终金额10 cm培养皿（毫克） 终浓度为10 cm培养皿（PM）
    慢病毒转移载体编码基因被包装 9-13 3.6-5.2 3.6-5.2 60
    pMDLg / pRRE 表达HIV-1 GAG / POL 8.8 1.76 1.76 30
    PRSV-牧师表达HIV-1 REV 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G 表达的VSVĞ 5.8 1.16 1.16 30

    表2：质粒慢病毒包装的量使用这些质粒金额转染HEK293细胞在10厘米菜肴。每盘慢病毒转移载体的最终金额可能根据其大小不同，保持每盘终浓度为60分。的一个碱基对的双链DNA均分子量为660道尔顿。

    1. 丢弃旧的媒介从HEK 293T细胞的10cm皿，然后轻轻地添加9毫升新培养基（DMEM +10％FBS中，没有P / S）。
    2. 加入PEI-DNA混合物轻轻地逐滴上板，轻轻地摇晃混匀中等。加入10μl20mM的氯喹（最后20 UM）至10毫升培养基。注：氯喹被认为是通过pH值的部分中和，以减少溶酶体室28内含有质粒转染复合物的降解。
    3. 在孵育CO 2培养箱在37˚C的6小时。然后，取下含有PEI-DNA混合物中，加入10 ml新培养基（DMEM +10％FBS +的20mM 4 - （2 - 羟乙基）-1 - 哌嗪乙磺酸（HEPES），pH7.4的+ P / S）的。注：温育后，病毒会在介质中产生的。吸气巴斯德吸液管和/或提示必须由10％的漂白粉进行消毒。总是净化生物安全柜表面用70％乙醇可能受污染的设备，无论上清溅或没有。如果发生泄漏，彻底去污用1％SDS在70％乙醇是必要的。
    4. 2-3天 ，孵育在CO 2培养箱在37˚C 48-72小时。4天 ，收集慢病毒解决方案（继续第2.2节 ）。
      注意：介质可以在转染后48小时被改变。收集病毒上清48小时和72小时两次可以达到获得更高滴度的病毒解决方案。
  2. 收集的慢病毒解决方案和转导
    1. 准备试剂和工具15 ml锥形管，1M HEPES，pH7.4的（0.22微米过滤）
    2. 第4天 ，收集上清液含有慢病毒颗粒（慢病毒溶液），用无菌Luer-Lok接头的注射器10毫升，然后通过0.45过滤上清液微米过滤入15ml锥形管中。加入1/100体积的1M HEPES pH7.4的向过滤慢病毒溶液（最终10mM的）。
      注：对于过滤，只用纤维素王牌泰特或聚醚砜（PES）（结合蛋白质低的）过滤器。不要使用硝酸纤维素滤膜。硝酸纤维素结合的慢病毒表面的包膜蛋白和破坏病毒。
    3. 从新生大鼠心肌细胞的3.5厘米菜，在第1.2节的最后一个步骤中得到除去培养基，加入1毫升过滤的慢病毒溶液，以3.5 cm培养皿中。
    4. <Optional>加入溴化己二甲铵溴化物（终浓度为4-6微克/毫升）。
      注：溴化己二甲可提高慢病毒转导效率。溴化己二甲铵溴化物的浓度应进行优化。
    5. 孵育在CO 2培养箱中盘6小时，在37˚C的慢病毒转导，然后换到中含有5％FBS和P / S的新的DMEM / MEM孵化培养皿在CO 2培养箱中，在37˚C为3天。
      注意：整合外源基因的插入由慢病毒宿主基因组被认为是由72小时完成。
    6. 第7天 ，用细胞从步骤2.2.5用于下一步骤。注：从慢病毒载体表达蛋白可通过后48-72小时转导的WB或免疫细胞化学（ICH），以确定相对表达水平进行确认（图1a和1b）。
  3. 慢病毒溶液浓度
    注意：这是最好用新鲜的慢病毒溶液，以达到最高的转导效率，在壳体的慢病毒溶液的滴度是不够高，慢病毒溶液可被浓缩，聚乙二醇（PEG）沉淀29。
    1. 的4倍的PEG溶液（32％PEG6000，400mM的氯化钠（NaCl），40毫摩尔HEPES pH7.4）的制备
      1. 对于125毫升4倍PEG溶液，称取40克PEG6000的，然后溶解在60毫升水中。
        注：注：（ 如 PEG6000的平均分子量为6000）的PEG后面的数字是平均分子量
        注：2.3.1.2）慢慢加入10 ml5 M氯化钠。慢慢加入5毫升1M HEPES pH7.4的。用2M的氢氧化钠调节pH值至7.4。
        注：2.3.1.3），加水至125ml。通过膜过滤除菌4倍PEG溶液用0.22μm的过滤器，并将其存储在4˚C。
    2. 慢病毒浓度
      1. 用0.45微米过滤器过滤器慢病毒上清转成新的50毫升管。
        注：2.3.2.2）添加4倍PEG溶液1:3的比例（PEG溶液：上清= 1:3）。储存在4˚C为16-48小时。
        注：2.3.2.3）离心2,600×g的在4˚C为30分钟。弃上清，离心2,600×g的在4˚C为5分钟。
        注：2.3.2.4）弃上清小心，以免干扰颗粒。重新悬浮沉淀在使用1/2原来的上清液体积的1/25体积的无血清培养基。
        注：2.3.2.5）直接使用，或用冷冻液态氮储存，然后在-80˚C

3，腺病毒转导

注：请参考其他来源的腺病毒结构13的建设和传播的方法。吸气巴斯德吸液管和/或提示必须由10％的漂白粉进行消毒。总是净化生物安全柜表面和潜在污染的设备，用70％乙醇无论上清泼溅。如果发生泄漏，彻底去污用1％SDS在70％乙醇是必要的。

  1. 腺病毒滴定了50％组织培养感染剂量（TCID 50）
    注意：转导之前，有必要滴定腺病毒原液。 TCID 50为滴定的病毒溶液的最好方法之一。因为该方法通过感染能力HEK 293T细胞，计算TCID 50的计算结果滴度反映了腺病毒的股票实际infectability。该PFU（空斑形成单TS）是成正比的TCID 50约为0.56 30倍。
    1. 制备细胞和工具：HEK 293T细胞的10cm细胞培养皿中，96孔平底细胞培养板，8通道多吸
    2. 准备70-90％融合的HEK 293T细胞在一个10cm皿。
    3. 进行预稀释为1/10的病毒原液的4。加50微升DMEM +10％FBS中，以在96孔平底细胞培养板的各孔中。添加预先稀释的病毒原液的25微升到第一行中，从A到H。
    4. 搅拌均匀，从井的第一行转移25微升至第二行有一个8通道多吸管。重复的1/3稀释的病毒溶液至井的各行直到并包括第11行并丢弃最后25微升。
    5. 磨碎的HEK 293T细胞到10ml DMEM +10％FBS中。加入50微升的细胞溶液，每孔从行1到12。
    6. 细胞培养在37˚C的CO2培养箱中培养11-13天。加入50微升DMEM + 1后4-5天，7-8天电镀的0％的FBS。
    7. 测量各孔中的细胞病变效应在11-13天之后的感染。
    车道 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    A行 ð ð ð ð ð ð ð ð ð
    B行 ð ð ð ð ð ð ð ð ð
    C行 ð ð ð ð ð ð ð ð ð
    D行 ð ð ð ð ð ð ð
    E行 ð ð ð ð ð ð ð ð ð ð ð
    F行 ð ð ð ð ð ð ð
    G行 ð ð ð ð ð ð ð ð
    排H ð ð ð ð ð ð ð ð ð ð ð
    每行的阳性孔的数目 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    每行的阳性孔的比例 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    ð 显示超过50％的细胞病变效应
    低于50％或没有细胞病变效应显示

    第1泳道，稀释3 1×10 4;泳道2，稀释3 2×10 4; ...;泳道11，稀释3 2×10 11;泳道12，控制。
    S =每行的阳性孔的比例之和
    = 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0 = 8.875
    TCID 50 = 3×10 4×3×（8.875-0.5）= 2.97×10 8个
    TCID 50 /毫升= 5.94×10 9

    表3：一个被感染的96孔板在10天后孵化测量每个细胞病变效应良好，总结每行阳性孔的比例实施例 。

    1. 根据Kaerber的公式计算滴度
    2. TCID 50 =（稀释第一车道）×（稀释）（S-0.5）
    3. S =每行的阳性孔的比例之和
      注：对于此协议，TCID 50 =（30000）×（3）（S-0.5）。因为50微升的病毒溶液是用在这个协议中，划分TCID 50由0.05计算TCID 50 /毫升。
  2. 腺病毒转导
    1. 计算从其滴度（PFU / ml时，病毒颗粒/ ml或TCID 50 / ml）的腺病毒溶液所需量。用公式来计算MOI（感染复数）。
    2. EM> [地点表4这里]
    3. 加的病毒溶液的计算量，以无血清培养基（见表5）。拌匀，静置20分钟，在室温。
    4. EM> [地点表5这里]
    5. 第7天，以在第2.2节中的最后一个步骤中获得的盘，并用750微升的含有5％FBS和P / S的新的DMEM / MEM更换培养基
      注：减少介质卷在转导至约50％原体积的是高转导效率的关键。
    6. 加入稀释的病毒解决方案，以菜。在孵育CO 2培养箱盘4-8小时，在37˚C。然后，更换新鲜培养基。
    7. 菜孵育24-48小时的CO 2培养箱中37˚C。在8-9天，用细胞的活细胞成像实验。注：从腺病毒质粒蛋白的表达可以由世界银行或脑出血后24-48小时转导，以确定相对表达水平（图1C和1D）证实。

4，活细胞成像

  1. 使用共聚焦旋转盘显微镜用一个温度控制腔和CO 2的环境的系统（可选）的图像采集
    1. 开启至少1小时前采集的温度控制系统，使所有设备平衡到37˚C收购开始之前。打开confoc人旋转磁盘显微镜系统（PC进行操作，显微镜，旋转盘单元，CCD相机，激光，荧光光源，普通光源，电动载物台和自动百叶窗）。
      注：超过1小时要实现所有设备的完整的温度平衡。
    2. 如有必要，在3.5厘米玻璃底菜所需的媒体改变介质的收购。将培养皿上的共聚焦旋转盘显微镜在一个温度控制腔室中的阶段。
      注：由于球面像差显微镜使用3.5公分的玻璃底菜用1.5号盖玻片（约0.16-0.19毫米厚）的最佳观测比较理想。如果正在使用的目标有一个校正领，有盖的玻璃比0.17毫米较厚获得的图像可以被纠正。此外，酚红有轻微的荧光。有时优选的是，使用不含酚红的培养基，如DMEM无酚红。如果没有装置来控制二氧化碳二氧化碳独立的中等或中等长期时间推移成像缓冲由HEPES。
    3. 选择光路的目镜。
    4. 打开亮场光源的快门。通过目镜调节焦距的显微镜下的细胞。开启快门为亮场光源熄灭。
    5. 打开快门，用于在荧光光源。发现细胞通过目镜显微镜下表达荧光蛋白。打开快门，用于在荧光光源熄灭。
    6. 可选>新闻在显微镜打开完美的对焦系统，以时间推移采集过程中，以保持重心稳面前完美的对焦系统激活按钮。
    7. 改变光路以将旋转盘共聚焦显微镜。适当地使用操作软件，检查图像DISPLA调整设定收购YED在屏幕上。 （ 如聚焦，激光功率，曝光时间，相机的CCD增益和关集）
    8. 组设置为使用操作软件的荧光图像采集。例如：选择“使用光路切换频道”和“通道1：绿色荧光蛋白”从收购的EGFP荧光信号通道之一。
    9. 在为了使用操作软件需要时间推移图像设定延时设置设置时间点之间的频率。例如：要获取一个时间点，每5分钟，然后从下拉菜单中选择“每个时间点的会议纪要”，并输入5到文本字段中。
      注：选择“最大速度”拍电影时的实际速度。如果荧光蛋白的表达低，荧光可以在时间推移采集快速漂白。在这种情况下，最好是减少采集时间点的个数。
    10. 通过点击“STA启动时间推移收购RT“按钮来获取图像序列。
      注意：最好不要使用多点采集功能。它可能会导致焦点的摄像视野的或运动的过程中延时成像损失。
  2. 所获取的图像进行分析
    注：获得的图像可以回放的电影文件，并使用分析软件进行分析。
    1. 选择要包含在电影所获取的图像。如果有必要，从图像的兴趣作物地区，并选择感兴趣的时间点，以减少使用的操作系统软件电影的文件大小。
    2. 导出图像中的AVI电影文件或MOV格式。从“格式”下拉菜单和所需完成的影片的时间一个电影格式，然后单击“导出”。注：在同一时间点，每5分钟可以播放的电影以每秒10帧，这比其实际速度快3000倍收购时间推移图像。

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

为了说明的技术中，慢病毒编码EGFP（增强型绿色荧光蛋白）标记的Cx43（连接蛋白43）或突变的Cx43蛋白32，来表达EGFP-标记的蛋白质在细胞和腺病毒编码FGFR1DN（成纤维细胞生长因子受体1显性失活）被用来关闭FGF信号在细胞33-35。三天之后的心肌细胞的分离，该分离的心肌细胞转导的慢病毒，以表达EGFP-标记的蛋白质在细胞内。然后后的慢病毒转导后3天，分离的心肌细胞进一步转导的腺病毒编码FGFR1DN消除FGF信号中的单元格。允许足够的时间让细胞以表达转导的外源基因后，共聚焦旋转盘显微镜被用来捕捉活细胞的图像。采集的图像回放的电影文件，并使用图像分析软件进行分析。如需更详细的代表性略去结果请参见Sakurai 等 32。

以下的慢病毒转导是通过共聚焦旋转盘镜72小时以下的慢病毒转导的图1A-B证实了EGFP的表达标记蛋白。 FGFR1DN由腺病毒转导的表达由世界银行和国际商会腺病毒转导图1C-D的24小时后得到了证实。腺病毒除了3.5厘米菜肴的时间被定义为在时间0和时间推移使用一个腔室的加热器，以保持温度在37˚C.被获取的图像具有40倍的空气NA 0.9的物镜，每5分钟6小时在采取了通过共聚焦旋转盘显微镜初级心肌细胞的EGFP-标记蛋白的时间推移图像示于补充影1-2。

在情况下，温度平衡是不够的，还是多采集模式是不正常，拍摄的图像时，工作正常的自动对焦系统稳定保持焦点可能会移动在xy平面补充动画1。然而，这并没有发生。如图补充电影2，当温度平衡是适当的和被收购的兴趣只有一个区域，拍摄的图像质量非常高的。

心肌细胞的搏动被后以证实细胞活力长期的时间推移活细胞成像评估。即使经过16小时的时间推移成像EGFP表达的心肌细胞保持其功能性和节拍有节奏地补充电影3。

图1
下面的慢病毒或腺病毒转导图1。确认蛋白的表达。 （A）隔离乳鼠心肌细胞表达Cx43蛋白-WT-EGFP转导后3天转用Ad-FGFR1DN。另见补充电影1（B）隔离乳鼠心肌细胞表达Cx43-S325/328/330E（3SE）-EGFP转导后3天转用Ad-FGFR1DN。继转导后，国际刑事法院24小时检测腺病毒转导又见补充电影2（C）的蛋白表达。 FGFR1DN蛋白的以下通过转导后WB 24小时检测到腺病毒转导的血凝素（HA）蛋白标记的FGFR1DN用常规IC卡的方法用抗-HA抗体检测，α-辅肌动蛋白被用来作为标记的心肌细胞（D）的表达。 HA-标记的FGFR1DN用抗HA抗体检测由WB，β-微管蛋白用作上样对照。

大鼠离体新生车补充电影1。时间推移成像 diomyocytes表达Cx43蛋白-WT-EGFP转用Ad-FGFR1DN的时间推移图像被收购与40倍的物镜，每5分钟6小时用共焦纺丝磁盘显微镜。采集的图像进行回放作为一部电影每秒10帧。这部影片已被修改Sakurai 等 32。 请点击此处观看该视频。

补充电影2。离体大鼠乳鼠心肌细胞表达Cx43-S325/328/330E-EGFP转用Ad-FGFR1DN时间推移成像。被收购的时间推移图像用40倍物镜6小时，每隔5分钟用共聚焦旋转盘显微镜。采集的图像进行回放作为一部电影每秒10帧。这部影片已被修改Sakurai 等 32。“目标=”_blank“>请点击此处观看该视频。

离体大鼠乳鼠心肌细胞补充电影3。时间推移成像回放时的实际速度。离体大鼠乳鼠心肌细胞表达Cx43蛋白-EGFP转导与被收购AD-FGFR1DN用40倍物镜每200毫秒10的时间推移图像秒，共聚焦旋转盘显微镜下16小时的时间推移收购。采集的图像进行回放的电影在每秒5张的实际速度。 请点击此处观看该视频。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

从新生大鼠原代心肌早就被用来研究心肌细胞功能的体外 。这个协议描述了用于从幼鼠采用两步酶消化法新生心肌细胞的分离方法，首先用胰蛋白酶O / N消化，在4℃，然后纯化的胶原酶。采用纯化的胶原酶步骤的一个优点在于，同一等级的酶被用于所有隔离。因此，分离的细胞的质量和数量是从实验的实验一致。

给定与腺病毒相关的，如果细胞培养转导的高效率是必需的一个给定的实验中，更高的转导效率，最好是使用一种腺病毒。但是，如果高浓度的转导是没有必要的，慢病毒载体都可以使用。有使用两种腺病毒或慢病毒载体的选择可以更容易地实现适当的transd减税和表达水平不同类型的基因。如果由活细胞成像用共聚焦旋转盘显微镜或IC卡中的荧光强度检测是非常低的慢病毒转导后，使用使用不同的启动子来表达目的基因的慢病毒的另一个转移载体可能会解决此问题。用腺病毒载体，如果腺病毒转导后，世行检测的频带较弱，这可能表明一个低滴度病毒原料。在这种情况下，最好是在细胞繁殖，然后再继续准备较高的滴度腺病毒的解决方案。

这种技术的一个限制是孤立的心肌细胞存活的收益率是不是从实验高度一致地去尝试，用纯化的胶原酶时也是如此。为了进行可重复的成像实验最好是分离的心肌细胞在上清液中的步骤1.2.13选择后计数存活细胞。在协议部分。然后，SE编玻璃底菜的心肌细胞在不同的稀释液。一旦细胞附着，与适当的细胞浓度为实验选择的菜肴计划。

有使用新生儿心肌细胞的许多优点，但也存在一些缺点。主要的缺点是他们从成人的心肌细胞明显的区别。完全分化成心肌细胞是杆状和孤立成人原发性心肌细胞维持其杆状形态，而孤立的新生儿原发性心肌细胞分布在各个方向36。孤立的成人和新生儿心肌细胞之间的表型差异也反映在他们的基因表达37的图案。因此，对于在其中分化的心肌细胞是必需的实验中，一个协议，用于成人心肌细胞的分离，将需要4。

采用重组的腺病毒和慢病毒转导蛋白质进入与纺纱共聚焦显微镜盘组合原代大鼠乳鼠心肌让我们来分析在现场培养原代细胞蛋白质的功能。相对于现有的方法，其利用染引入目的基因导入细胞，这种协议的一个显著优点是，腺病毒和慢病毒是非常有效地吸收由产生的感兴趣的基因在几乎所有的细胞中表达的细胞文化。此外，使用两种不同类型的病毒的基因表达可以更容易地实现适当的转导率和表达水平的多个基因。 siRNA和化学激动剂和拮抗剂也可用于在该系统中，以进一步改动和分析基因的功能和它们编码的蛋白质。

心中的制备是在协议中一个极其重要的一步。尽可能快地清除体内的心。一定要把它们放在冰立刻以保持细胞活力高。另一个重要步骤是高质量的，而且滴度慢病毒/腺病毒的股票的准备。如果质量差的病毒种群的使用，目的基因的转导和表达水平将较低。因此，他们可能不适合成像研究。

这种技术的一个重要应用前景将是在小鼠心肌细胞的使用。试点研究测试是否可用于小鼠乳鼠心肌细胞的分离这种方法已经取得了可喜的成果。由于小鼠心脏相比，这些鼠的相对小的尺寸，更低的组织最初获得的。因此，较少的细胞都使用相同的动物数量，而只是使用更多的老鼠的隔离应消除这一障碍隔绝在一个单一的步骤。隔离小鼠心肌细胞的能力，使研究人员能够研究细胞的基因改造米的隔离功能冰（转基因，基因敲除，敲入）已经产生，以研究目的基因的一种特殊形式。

一个在心血管研究的主要障碍已与调查给定基因的实时表示的心脏组织中在体内的表达和功能相关联的难度。但是隔离功能跳动的心肌细胞，利用病毒转导调节细胞的功能，然后利用共聚焦旋转盘显微镜研究它们在实时的能力，有助于揭示出心肌细胞在体内的作用，弥合这一差距。这种方法提供了对于理解心肌功能在细胞水平上的简化系统。它允许在基因表达的扰动如何改变心肌细胞功能的实时分析。心肌细胞的活细胞成像将有助于进一步深入了解心肌功能。这种见解将导致基本cardiovascula进展Ř研究，导致新的治疗心血管疾病的治疗。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).

Tags

细胞生物学，第88期，活细胞成像，心肌细胞，原代细胞培养，腺病毒，慢病毒，纺纱共聚焦显微镜盘
原代大鼠乳鼠心肌细胞的活细胞成像继腺病毒和慢病毒转导利用共聚焦旋转盘显微镜
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. … More

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter