Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

Published: June 24, 2014 doi: 10.3791/51666
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2, 2, 2
1Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology, 2Department of Internal Medicine, Yale Cardiovascular Research Center and Section of Cardiovascular Medicine

Abstract

Kolayca tek bir işlem içinde çok sayıda izole edilebilir, çünkü Birincil sıçan neonatal kardiyomiyositlerde vitro Kardiyovasküler araştırmalarda temel yararlıdır. Nedeniyle mikroskop teknolojisindeki ilerlemeler bu hücrelere fototoksisite ilişkin en az endişe ile gerçek zamanlı olarak hücresel olayları araştırmak amacıyla canlı hücre görüntülerini yakalamak için nispeten kolaydır. Bu protokol hücrenin özelliklerini modüle Lentiviral ve adenoviral transdüksiyon izleyen bir konfokal dönen disk mikroskop kullanılarak primer sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin canlı hücre timelapse görüntüleri çekmek için nasıl açıklar. Virüs iki farklı uygulama daha kolay iki farklı genler için uygun bir iletim hızı ve ekspresyon seviyelerini elde etmek için yapar. Peki odaklı canlı hücre görüntüleri uzun süreler boyunca istikrarlı odak tutar mikroskop otofokus sistemi kullanılarak elde edilebilir. Bu yöntemde, dışsal mühendisinin işlevlerikültürlenmiş primer hücrelerde ifade ed proteinlerin analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu sistem siRNA'lar kullanımı yoluyla hem de kimyasal modülatörlerinin genlerin fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir.

Introduction

İlköğretim sıçan yenidoğan kardiyomiyositler uzun vitro 1 kardiyomyosit fonksiyonlarını araştırmak için kullanılmıştır. Onlar birkaç iyi kurulmuş yöntemlerle 2-4 sıçan yavrular izole etmek kolaydır. En yaygın yöntem kolajenazı önce veya hücre izolasyonu için kalbin bağ dokusu sindirmek için tripsin kullanır. Araştırmacılar ayrıca yetişkin kemirgenler 5-8 yanı sıra yenidoğan farelerin 9,10 dan kardiyomiyositlerin izole etmek için yöntemler geliştirmişlerdir.

Bu protokol, iki aşamalı bir prosedür kullanılarak enzim sindirimi, neonatal sıçan yavrularından kardiyomiyositlerde izole edilmesi için bir yöntem tarif eder. Tripsin ilk 4 ° C 'de O / N el ve 37 ° C sıcaklıkta ve sonra saf bir kolajenaz 4 ° C'de tripsin O / N, kalp dokusu inkübasyonu sıcak bir enzim solüsyonu 2 ardışık inkübasyonlar kullanan yöntemleri ile karşılaştırıldığında hücre hasat için gerekli adımları azaltır. Buna ek olarak, saflaştırılmış co kullanarakllagenase daha basit bir enzimlere göre, çok partiye değişkenlik dolayısıyla daha tekrarlanabilirlik sağlayan, elimine edilebilir.

, Belirli bir proteinin fonksiyonel çalışmalar, genellikle bir adenovirüs 11-13 ve / veya 14-16 lentivirüs kullanarak bir protein ifade sistemi kullanır. [Uyarıcı not] viral üretim ve manipülasyon NIH talimatlarına göre yapılmalıdır.

Adenovirüs konakçı genomu içine entegre değildir. Bu bölünen hücreler ve bölünmeyen hücreleri de dahil olmak üzere pek çok hücre tipi, hem birincil hücre ve hücre serileri de transdüksiyon çok yüksek bir etkinliğe sahiptir. Bu, adenovirüs gen ifadesi için güvenilir bir vektör sağlar. Adenovirüs vektörü tarafından kodlanan proteinin yüksek seviyeleri transdüksiyonu takip eden 48 saat içinde gelişir ve bunlar birkaç hafta 17 sürebilir. Bununla birlikte, protein ekspresyonu için bir adenovirüs kullanımının bir dezavantajı olduğu bir yeniden birleştirici ade geliştirilmesiAdenovirüs karmaşık ve zaman alıcı hem de. Birçok araştırmacı rekombinant gen ifadesi için Lentivirüslerden dönüm edilmiştir neden bu dezavantajı kısmen açıklıyor. Adenoviral yapıları aksine, bir lentiviral yapı üreten hızlı ve kolaydır. Lentivirüsler genellikle her iki bölme ve bölünmeyen hücrelere adenovirüs daha düşük transdüksiyon verimliliği, sahip olmakla birlikte, bunlar bir konakçı genom içine entegre yok. Sonuç olarak, kalıt aktarılan genin ifadesi için adenovirüsler daha lentivirüsler daha kararlıdır.

Nedeniyle mikroskopi alanındaki teknolojik gelişmeler, bu rekombinant proteinleri ifade eden hücrelerin, canlı hücre görüntülerini yakalamak için çok daha kolaydır. Bu bile edinimi video oranı hızlarda geçerlidir. Bu durum araştırmacı ilgilenilen proteinin, özellikle işlevsel değişiklikler, gerçek zamanlı olarak etki hücreyi belirlemek için izin verir. Konfokal dönen disk mikroskop o liv için optimal bir tekniktir yapmak birçok önemli özelliklere sahiptirE hücre görüntüleme 18,19. Aynı anda nokta tarama konfokal mikroskoplar çok daha az lazer güç kullanırken Yokogawa eğirme disk, çok daha hızlı görüntü elde etmek için izin verir. Bu özelliklerin her ikisi de lazer örnekler aynı zamanda geçtiği çok sayıda eş odaklı delik içeren dönen bir disk, kaynaklanmaktadır. Satın alma sırasında disk kendisini hızla ve sürekli olarak 18-20 spin. Mikroskop otofokus sistemi kullanarak, istikrarlı odak uzun süreler boyunca devam edilir. Bu araştırmacılar, iyi odaklanmış canlı hücre görüntü almasına izin veriyor. Edinsel Görüntülerin bir film dosyası olarak oynatılır. Görüntüleri, ImageJ 21,22, FIJI 23 ya da başka ticari olarak temin edilebilen yazılımı gibi görüntü analizi yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin 1. İzolasyon

  1. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve kültür ortamı olarak fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin / streptomisin (P / S) ile takviye edilmiş minimum temel ortam (MEM) kullanın. Izolasyon sonraki ilk 2 gün boyunca fibroblastların büyümesini önlemek için ortama bromodeoksiuridini (BrdU) ilave edin.
Taban ortamı FBS BrdU (mM) P / S (U / ml)
seçim DMEM % 10. 0 20
İlk gün DMEM % 10. 0.1 10
Ertesi gün DMEM / MEM % 5 0.1 10
Bundan başka kültürü DMEM / MEM % 5 0 10

Tablo 1:. Sıçan neonatal kardiyomiyosetlere Orta sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin kültürleme için bu ortam kullanın. DMEM / MEM, DMEM ve MEM ortamının 01:01 karışımıdır.

  1. Kardiyomyosit izolasyon, 1. Gün (Tahmini gereken süre, yaklaşık 1 saat)
    NOT: neonatal kemirgenler ile çalışma için, hayvan bakım programları tarafından belirlenen yerel üniversite kurallar ve kurallara başvurmak ve kurumsal olarak onaylanmış hayvan protokollere uygun. Bu protokol açıklanan tüm yöntemler Yale Hayvan Kaynak Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
    1. Reaktifler ve araçları hazırlayın: kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS CMF), 30 ml x 2, 10 ml x 2, buz üzerinde; Buz üzerinde CMF HBSS 2 ml ile yeniden 1 mg tripsin; araçları otoklave % 70 250 ml çanak içinde etanol (EtOH); dört adet 10 cm plastik tabaklar, kalplerin izolasyonu için üç ve tripsinleme için bir sterilize.
    2. Sipariş 1 Littdeneysel hayvan distribütör kendi baraj ile 1-to-2-günlük fare yavrularının (yaklaşık 10 yavrular) arasında er.
    3. Gün1, küçük kafes yavrular aktarın ve ketamin / ksilazin kokteyl (Ketamin, 200ml/10g ve ksilizin 20ml/10g) doz aşımı ile baraj euthanize.
    4. Bir yavru almak ve% 70 EtOH ile tüm vücut sterilize. Diğer yavrular izole bir yerde steril bir 10 cm plastik tabak bakımlı keskin cerrahi makas ile yavru işten çıkarmak.
      Not: kısa sürede örnekleri toplamak için, bu kemirgen ömrünü sona erdirilmesi için en hızlı ve etkili bir yöntem kullanmak en iyisidir. Düzgün bakımlı ekipmanları ile uzman profesyoneller tarafından kullanılan Decapitation hayvan için daha az korku ve kaygı neden ve ötenazi diğer formları daha hızlı ve pratik olabilir. Bu Hayvanların ötanazi Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Yönergeleri tavsiyeleri ile uyumludur.
    5. Kaldır he dayaksterilize araçları ile sanat, ve 50 ml konik tüp içinde 30 ml buz soğutulmuş CMF HBSS'de kalp koydu. NOT: Mümkün olduğunca çabuk kalpleri çıkarın ve hemen buz üzerine koydu. Vücuttan kalbini çıkardıktan sonra, tüm işlemler buz üzerinde yapılmalıdır.
    6. Buz soğutulmuş CMF HBSS, 30 ml soğutulmuş ve buz CMF HBSS başka bir 30 ml geri kalan 5 kalplerinde 5. kalpleri toplayın. Kalpleri durulama tüp girdap. NOT: Bu aşamadan sonra, bir laminar akış başlığı içinde bütün işlemleri gerçekleştirmek.
    7. Süpernatantı atın ve buz üzerinde yeni bir steril 10 cm plastik tabak için kalpleri aktarın. NOT: aspiratör ile aspire kalpleri için dikkatli olun.
    8. Büyük gemiler ve / veya istenmeyen dokuları kaldırmak. Kalpleri durulama çanak buz soğutulmuş CMF HBSS 10 ml ekleyin.
    9. Buz üzerinde yeni bir steril 10 cm plastik tabak için bütün kalpleri aktarın. Buz üzerinde en az 1 mm ila 3 makas ile kalpleri kıyma.
    10. Soğutulmuş CMF HBSS 9 ml ekleyin. Soğutulmuş tripsin reconsti 1 ml ekleyinCMF HBSS (son 50 ug / ml) ile ikâmeli.
    11. Parafilm çanak Seal ve alüminyum folyo ile örtün, sonra soğuk bir odada (4 ˚ C) o gecede yerleştirin.
  2. Kardiyomyosit izolasyon, 2. Gün (Tahmini gereken süre, yaklaşık 4 saat)
    1. Hazırlayın reaktifler ve araçları: 50 ml konik tüp x 2; Buz üzerinde CMF 1 ml HBSS ile yeniden 2 mg tripsin inhibitörü; Oda sıcaklığında (RT) Leibovitz L-15, 5 ml ile yeniden 1500 tane kolajenaz; Leibovitz L-15, steril 1 litre su ile tekrar oluşturulmuş ve bir 0.22 mikron filtre, oda sıcaklığında 8 ml geçirilerek filtre edilmektedir; Su içinde 10 mg / ml (32.6 mM) BrdU; P / S; DMEM +% 10 FBS; MEM; iki adet 10 cm plastik hücre kültürü yemekleri; 3.5 cm cam alt yemekler.
    2. Day2, jelatin kaplı yemekler hazırlanıyor. Kaplamak için bir görüntüleme deney için, 3.5 cm cam alt çanak% 0.1 jelatin çözeltisi 1 ml ilave edilir. Daha sonra aspire ve kullanımdan önce jelatin solüsyonu atın, birkaç saat boyunca 37 ° C'de ˚ yemekler inkübe edin.
      HAYIRTE: 3,5 cm cam alt tabak bir flüoresan mikroskop kullanılarak bir görüntüleme deney için uygundur. Western blot (WB) ile protein ekspresyonunu tespit etmek için birinci kardiyomiyositlerde proteinlerin ekstre edilmesi için,% 0.1 jelatin kaplı plastik hücre kültürü tabakları kullanılabilir.
    3. Steril kaputu buz üzerinde bir 50 ml konik tüp tamponla gece boyunca tripsin ile sindirilmiş bütün kalp dokusu aktarın. CMF HBSS tripsin inhibitörü 1 ml (son 182 ug / ml) eklenir. 50 ml konik tüp yakın kapak sıkıca bulaşmasını önlemek için.
    4. Doku ısınmaya bırakılmış ve 30-37 ˚ C'ye tampon için 37 ˚ C inkübatör içinde yaklaşık 30 dakika boyunca inkübe edin Tüpü Leibovitz L-15 olarak 5 ml kollajenaz (nihai 94 birim / ml) eklenir. Yumuşak (37 ˚ C kuluçka makinesi içinde 170-200 rpm çalkalama) çalkalama ile 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ˚.
      Not: Bu adım laminar akış başlığı dışında yapılabilir. Tüm takip eden aşamalar oda sıcaklığında yapılmalıdır.
    5. % 70 EtOH ile 50 ml konik tüp dışında dezenfekte edin ve koyunsterilize kaput o.
    6. 20 kez hız 3 ml / sn pipetleme ile otomatik pipet kullanarak öğütün dokular. Doku kalıntısı 70 um hücre süzgeç ile süpernatant 3 dakika dinlendirilir ve filtre için izin verin.
      Not: A normal boyut 10 ml pipet toz haline getirme için kullanılabilir.
    7. Kalan doku kümeleri ve trituratının için Leibovitz L-15 5 ml ekleyin ve tekrar süpernatant filtre. Leibovitz L-15, 2 ml hücre süzgeç yıkayın.
    8. Kolajenaz kısmen bozulmuş kolajen sindirimi izin 60 dakika - 20 için bir başlık olarak, süzüldü hücre çözeltisi yerleştirin.
    9. 5 dakika boyunca 100 x g 'de tortu hücreleri. ,% 10 FBS ve yüksek konsantrasyon P / S (20 U / ml) ihtiva eden DMEM, 20 ml hücrelerin yeniden askıya.
    10. Kardiyomiyosit seçim için 37 ˚ ° C'de CO2 inkübatörü içinde, 1 saat boyunca iki adet 10 cm plastik hücre kültürü tabakları üzerine, ön plaka hücreleri. NOT: Fibroblastlar kardiomyositlerindeki daha yemeğin altına daha kolay eklemek.
    11. WhIle bekleme, DMEM,% 10 FBS, P / S (10 U / ml) ve 0.1 mM BrdU içeren hazırlar. % 10 FBS ve P / S ihtiva eden DMEM içinde 325 ml 10 mg / ml 1 ml BrdU ekleme
    12. Nazikçe yemekleri girdap ve iki adet 10 cm yemekleri kardiyomyosit içeren süpernatant toplamak.
      NOT: Çoğu kardiyomiyositlerde hala inkübasyondan 1 saat sonra yüzer yüzen olacaktır. Hafifçe çanak bağlı olan fibroblast ile kirlenmesini önlemek için, pipetleme süpernatantı toplamak yok.
    13. İsteğe bağlı> hücre canlılığı kontrol etmek için tripan mavisi ile ve% 0.2 olmadan yüzer hücreleri sayın.
    14. 5 dakika boyunca 100 x g 'de tortu hücreleri. % 10 FBS, P / S (10 U / ml) ve 0.1 mM BrdU içeren DMEM içinde hücrelerin yeniden askıya. Mikroskop kullanarak gözlem için jelatin kaplı 3.5 cm cam alt yemekler 2 x 10 5 hücre / tabak plaka hücreleri. NOT: 37 ˚ C'de CO 2 inkübatör en az 24 saat boyunca kaplama sonra hücrelerin rahatsız etmeyin
    15. Gün 3, ChaNGE ortamı, 24 saat,% 5 FBS, P / S ve 0.1 mM BrdU içeren DMEM / MEM için kaplama sonrası.
    16. Gün 4,% 5 FBS ve P / S ihtiva eden DMEM / MEM sonra kaplama ortamı 48 saat değiştirme
      NOT:% 5 FBS ve P / S ihtiva eden DMEM / MEM ile her 2-3 günde bir ortam değiştirme

2.. Lentiviral transdüksiyon

  1. Lentiviral plasmidlerin ambalajlama
    NOT: Bu konu 24-26 hakkında daha derinlemesine bilgi için başka kaynaklara başvurun. Bu Lentiviral çözeltisi hazırlamak için yaklaşık 3 gün sürecek. Daha yüksek transdüksiyon etkinliğini elde etmek için taze Lentiviral çözümü kullanmak en iyisidir. Lentiviral plasmidler ve paralel olarak neonatal sıçan kardiyomiyositlerde izolasyonun paketleme başlatın. Bunun yerine lentiviral plasmidlerin paketlenmesi için polietilenimin (PEI) 27 kullanmak yerine, bir ticari olarak temin edilebilir transfeksiyon reaktifi kullanılabilir. Üreticisinin talimatlarına uyun.
    1. Reaktifler ve araçları hazırlamak; HEK293T hücreleri, 10 cm Plastik hücre kültürü kapları, lentiviral plasmid çözeltiler (pMDLg / pRRE, pRSV-Rev, pMD2.G, lentiviral transfer vektörü, 1.0 mg / ml her biri), 1 g / l PEI, serum içermeyen ortam, 20 mM % 70 EtOH içinde suda klorokin,% 10 ağartma maddesi,% 1 SDS
    2. Gün 0, 10 cm başına 2-2.5 x 10 6 HEK 293T hücreleri transfeksiyondan bir gün önce çanak Plate.
      NOT: transfeksiyondan% 30-60 izdiham uygunudur.
    3. Gün 1, PEI transfeksiyon solüsyonu hazırlanması. Bir 1.5 ml bir tüp içinde 960 ul serumsuz ortama 1 g / l PEI 30 ul ekle. 1.5 ml tüp içinde PEI transfeksiyon çözelti içine 4 plazmidler ekleyin ve dokunarak ile karıştırın.
    Plasmid Adı Not Boyut (KBP) hacmi eklenmiş (ml) 10 cm çanak Final miktarı (mg) 10 cm çanak (PM) nihai konsantrasyonu
    Lentiviral transfer vektörü paketlenecek olan geni kodlayan 9-13 3,6-5,2 3,6-5,2 60
    pMDLg / pRRE HIV-1, gag / pol ifade 8.8 1.76 1.76 30
    pRSV-Rev HIV-1 ifade eden REV 4.1 0.82 0.82 30
    pMD2.G VSV G ifade 5.8 1.16 1.16 30

    Tablo 2:. Lentiviral ambalaj plasmidlerin miktarı 10 cm tabaklarda HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu için, bu plazmid miktarda kullanın. Tabak başına lentiviral transfer vektörü nihai miktarı, boyutuna göre farklılık 60 uM'de tabak başına son konsantrasyon muhafaza edebilir. Çift şeritli DNA, bir baz çiftinin ortalama moleküler ağırlığı 660 daltondur.

    1. Eski orta atınyavaşça 10 cm HEK 293T hücreleri tabak ve yeni ortamın 9 ml ekleyin (DMEM +% 10 FBS, P / S olmadan).
    2. PEI-DNA karışımını ekleyin, yavaşça tabağa-bilge bırakın ve yavaşça orta ile karıştırın girdap. 10 ml ortama 20 mM klorokin'e (nihai 20 uM), 10 ul ekle. Not: Chloroquine lızozomal bölmeleri 28 içindeki pH kısmi nötrleştirilmesi ile plasmid ihtiva eden transfeksiyon komplekslerinden bozulmasını azaltmak için düşünülmektedir.
    3. 6 saat boyunca 37 ° C'de ˚ CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir. Daha sonra, PEI-DNA karışımını ihtiva eden orta kaldırmak ve yeni ortamı 10 ml ekleyin (DMEM +% 10 FBS + 20 mM 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), pH 7.4 + P / S) . Not: inkübasyondan sonra, virüs ortamında üretilecektir. Çekiş Pasteur pipetler ve / veya ipuçları% 10 çamaşır suyu ile dezenfekte edilmelidir. Her zaman biyolojik güvenlik kabini yüzeyi arındırmak ve bağımsız yüzer dökülmüş olup olmadığını% 70 EtOH ile potansiyel kirlenmiş ekipman,ya da. Dökülmesi oluştu,% 70 EtOH içinde% 1 SDS ile tam bir dekontaminasyon gereklidir.
    4. Gün 2-3, CO Ġnkübasyon 48-72 saat. 4. Gün boyunca 37 ˚ C'de 2 inkübatör, lentiviral çözüm (Bölüm 2.2 devam) toplamak.
      NOT: Orta transfeksiyonundan sonra 48 saat değiştirilebilir. Iki virüs süpernatant 48 saat ve 72 saat Toplama yüksek titresi virüs çözümleri elde etmek için elde edebilir.
  2. Lentiviral çözeltisi ve transdüksiyon toplanması
    1. Reaktif ve araçları hazırlayın: 15 ml konik tüpler, 1 M HEPES, pH 7.4 (0.22 um süzülmüş)
    2. 4. gün, Luer-Lok şırınga steril 10 ml lentivirüs parçacıklar (lentiviral çözelti) ihtiva eden supernatant toplamak, daha sonra 0.45 um filtre süpernatan, bir 15 mL konik tüp içine filtre. Süzüldü lentiviral çözelti (son 10 mM) ve 1 M HEPES pH 7.4 içinde 1/100 hacim.
      NOT: filtreleme için, sadece selüloz ace kullanınTate veya polietersülfon (PES) (düşük protein bağlama) filtreler. Nitroselüloz filtre kullanmayın. Nitroselüloz Lentiviral zarfın yüzey proteinleri bağlanır ve virüs yok.
    3. Bölüm 1.2 son aşamasında elde edilen sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin 3.5 cm yemekler, orta çıkarın, 3,5 cm çanak süzülmüş Lentiviral solüsyonu 1 ml ekleyin.
    4. Heksadimetrin bromit (nihai konsantrasyon 4-6 ug / ml) ilave <optional>.
      NOT: Heksadimetrin bromür Lentiviral transdüksiyon etkinliğini artırabilir. Heksadimetrin bromür konsantrasyonu optimize edilmelidir.
    5. Lentiviral transdüksiyon boyunca 37 ° C'de ˚ CO2 inkübatörü içinde 6 saat boyunca inkübe çanak, sonra% 5 FBS ve P / S ihtiva eden yeni bir DMEM / MEM için orta değiştirmek 3 gün boyunca 37 ° C'de ˚ CO2 inkübatöründe inkübe çanak.
      Not: lentivirüs ile konakçı genom içine egzojen genin entegrasyonu 72 saat tamamlanması olarak kabul edilir.
    6. Gün 7, bir sonraki aşama için adım 2.2.5 hücreleri kullanın. Not: lentiviral plazmidinden protein sentezleme göreli ekspresyon seviyesini belirlemek amacıyla transdüksiyonunun 48-72 saat sonra WB imünosito kimyasal olarak ya da (ICH) tarafından teyit edilebilir (Şekil 1a ve 1b).
  3. Lentiviral çözeltisinin konsantrasyonu
    NOT: Bu lentıvıral çözüm titre yeterince yüksek değilse bu durumda, en yüksek iletim verimliliği elde etmek için taze Lentiviral çözümü kullanmak en iyisidir, lentiviral solüsyon polietilen glikol (PEG) çöktürme 29 konsantre edilebilir.
    1. 4x PEG çözeltisi (% 32 PEG6000, 400 mM sodyum klorür (NaCl), 40 mM HEPES pH 7.4) Hazırlanması
      1. 4x 125 ml PEG çözeltisi için, PEG6000, 40 g ağırlığında daha sonra 60 ml su içinde çözülür.
        Not: Not: (. Örneğin PEG6000, Ortalama molekül ağırlığı 6000 olan) PEG sonra sayısı ortalama molekül ağırlığıdır
        NOT: 2.3.1.2) yavaş yavaş 10 ml ekleyin5 M NaCl. Yavaş yavaş 1 M HEPES pH 7.4, 5 ml ekleyin. 2 M sodyum hidroksit kullanılarak pH 7.4 'e ayarlayın.
        NOT: 2.3.1.3) 125 ml su ekleyin. Bir 0.22 um filtre ile membran filtrasyonu ile 4x PEG solüsyonu sterilize ve 4 ˚ C'de saklayın
    2. Lentivirüstür konsantrasyonu
      1. Filtre lentiviral, 0.45 um filtre kullanılarak yeni bir 50 ml tüp içine süpernatant kalıt.
        NOT: yüzer = 01:03): 2.3.2.2) 4x PEG çözüme 01:03 oranını (PEG çözüm ekleyin. 16-48 saat boyunca 4 ˚ C'de saklayın.
        Not: 30 dakika boyunca 4 ° C'de ˚ 2600 x g de 2.3.2.3) santrifüjleyin. 5 dakika boyunca 4 ° C'de ˚ 2600 x g de santrifüj süpernatan ve atın.
        NOT: 2.3.2.4) pelet rahatsız etmemek için dikkatli bir şekilde süpernatant atın. Yeniden askıya 1/2, orijinal süpernatan hacminin 1/25 hacme kadar kullanılarak serum barındırmayan ortam içinde pelet.
        NOT: 2.3.2.5) doğrudan kullanın ya da daha sonra -80 ˚ C'de saklamak sıvı azot kullanılarak dondurmak

3.. Adenoviral iletimi

Not: adenoviral yapıların 13 inşası ve yayılması için yöntemler için diğer kaynaklara bakınız. Çekiş Pasteur pipetler ve / veya ipuçları% 10 çamaşır suyu ile dezenfekte edilmelidir. Her zaman biyolojik güvenlik kabini yüzeyi arındırmak ve potansiyel bağımsız yüzer dökülmüş olup olmadığını% 70 EtOH ile ekipmanları kirlenmiş. Dökülmesi oluştu,% 70 EtOH içinde% 1 SDS ile tam bir dekontaminasyon gereklidir.

  1. % 50 doku kültürü enfeksiyon dozu ile Adenoviral titrasyon (TCID50)
    NOT: transdüksiyon önce, adenoviral stok solüsyonu titre etmek için gereklidir. TCID50 viral titre etmek için en iyi yöntemlerden biridir. Yöntem TCID50 hesaplanan HEK 293T hücrelerine bulaşıcı bir kapasite, bir titre değerlendirir için adenovirüs stoklar gerçek Bulaşabilirliği yansıtır. PFU (plak oluşturucu units) yaklaşık 0.56 bir 30 faktörü ile TCID 50 ile orantılıdır.
    1. HEK 293T hücreleri, 10 cm hücre kültür kapları, 96-gözlü düz dipli hücre kültürü plakası, 8 kanallı pipet multi: hücreleri ve araçları hazırlanması
    2. 10 cm çanak 70-90% Konfluent HEK 293T hücreleri hazırlayın.
    3. Virüs stokunun 1/10 4 bir ön seyreltme gerçekleştirin. Bir 96-gözenekli düz tabanlı hücre kültürü plakasının her oyuğuna DMEM +% 10 FBS, 50 ul ekle. A'dan H., ilk satırda içine önceden seyreltilmiş virüs stokunun 25 ul ekle
    4. İyice karıştırın ve 8-kanallı multi pipet ile ikinci satıra kuyu ilk satırdan 25 ul aktarın. 1/3 kadar kuyuların her satır için viral çözelti seyreltme ve 11. satırda dahil olmak üzere tekrarlayın ve son 25 ul atın.
    5. Öğütün HEK 293T DMEM +% 10 FBS içinde 10 ml hücre. 1 ile 12 arasındaki sıralarındaki her bir hücre içine çözeltisinin 50 ul ekle.
    6. 11-13 gün boyunca CO2 inkübatöründe 37 ° C'de ˚ hücreleri inkübe edin. DMEM + 1, 50 ul ekle4-5 gün ve kaplama 7-8 gün sonra% 0 FBS.
    7. Enfeksiyondan sonra 11-13 gün sonra, her oyuktaki sitopatik etkiler ölçün.
    şerit 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    Satır A d d d d d d d d d
    Satır B d d d d d d d d d
    Satır C d d d d d d d d d
    Satır D d d d d d d d
    Satır D d d d d d d d d d d d
    Satır F d d d d d d d
    Satır G d d d d d d d d
    Sıra H d d d d d d d d d d d
    satır başına pozitif kuyu sayısı 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0
    satır başına pozitif olan kaynaklar oranının 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0
    d % 50 Sitopatik etkileri üzerinde gösteriliyor
    % 50 ya da hiç Sitopatik etkileri altında gösteriliyor

    Şerit 1, 1 seyreltme 3 x10 4; şerit 2, seyreltme 3 2 x10 4; ...; şerit 11, seyreltme 3 2 x10 11; Şerit 12, kontrol.
    S sıra başına pozitif kuyuların oranlarının toplamı =
    = 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,75 0,63 0,25 0,25 0 = 8.875
    TCID 50 = 3 x 10 4 x 3 x (8,875-0,5) = 2.97 x 10 8
    TCID50 / ml = 5.94 x 10 9

    Tablo 3:. Enfekte olmuş bir 96 well-levha 10 gün inkübe edildikten sonra her bir hazne içinde sitopatik etkisini ölçmek ve sıra başına pozitif kuyuların oranlarının toplamı örneği.

    1. Kaerber ait formüle uygun olarak titreyi hesaplamak
    2. TCID50 = (ilk şerit seyreltme) x (seyreltme) (S-0.5)
    3. S sıra başına pozitif kuyuların oranlarının toplamı =
      NOT: Bu protokol için, TCID 50 = (30000) x (3) (S-0.5). Viral çözeltisi 50 ul Bu protokolde kullanıldığı için, TCID50 / ml hesaplamak için 0.05 TCID50 ile bölün.
  2. Adenoviral transdüksiyon
    1. Kendi titresi (PFU / ml, ya da TCID50 / ml viral partikül /) için adenoviral çözeltinin gerekli miktarı hesaplanır. MOI (enfeksiyon çokluğu) hesaplamak için formül kullanın.
    2. em> [buraya yerleştirin Tablo 4]
    3. Serumsuz ortama virüs çözeltisi hesaplanan miktarını ekleyin (bkz. Tablo 5). İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
    4. em> [Burada Yeri Tablo 5]
    5. Day7, Bölüm 2.2 son aşamasında elde edilen çanak alın ve% 5 FBS ve P / S içeren yeni DMEM / MEM 750 ul ile orta yerine
      Not: orta hacminorijinal hacminin yaklaşık% 50 transdüksiyon yüksek transdüksiyon verimliliği için çok önemlidir.
    6. Çanak seyreltilmiş virüs solüsyonu ekleyin. 37 ˚ C'de CO2 inkübatör içinde 4-8 saat inkübe çanak Daha sonra, taze ortam ile değiştirin.
    7. 37 ˚ C'de CO2 inkübatör 24-48 saat boyunca inkübe çanak Gün, 8-9 de, canlı hücre görüntüleme deneyi için hücreler kullanın. Not: adenoviral plazmidinden protein sentezleme göreli protein ekspresyon seviyesi (Şekil 1c ve 1d) belirlemek amacıyla transdüksiyon 24-48 saat sonra WB veya ICH ile teyit edilebilir.

4. Canlı hücre görüntüleme

  1. Sıcaklık kontrollü bir oda ile bir konfokal dönen disk mikroskop ve CO 2 çevre sistemi (isteğe bağlı) kullanarak görüntü elde etme
    1. Tüm cihazlar önce satın başlamasından 37 ˚ ° C'ye kadar dengeye, böylece önceden satın alınması, en az 1 saat üzerindeki sıcaklık kontrol sistemi getirin. Confoc açınal diski mikroskop sistemi (PC operasyon için, mikroskop, dönen disk ünitesi, CCD kamera, lazerler, floresan ışık kaynağı, normal ışık kaynağı, motorlu sahne ve otomatik kepenkler) iplik.
      NOT: Daha fazla 1 saat tüm cihazların tam sıcaklığı dengeye ulaşmak için gereklidir.
    2. Gerekirse, edinimi için istenen ortama 3,5 cm cam alt yemekler orta değiştirin. Sıcaklık kontrollü odasında konfokal dönen disk mikroskop sahnede çanak yerleştirin.
      NOT: nedeniyle No 1.5 cam kapak ile 3.5 cm cam alt çanak (yaklaşık 0,16-0,19 mm kalınlık) mikroskopi kullanılarak optimum gözlem için küresel sapmaları idealdir. Kullanılan amacı, düzeltme yaka varsa, 0.17 mm'den daha kalındır örtücü camları elde görsel düzeltilebilir. Ayrıca, Fenol kırmızı hafif bir floresan var. Bazen fenol kırmızısı olmadan bu DMEM gibi bir fenol kırmızı içermeyen ortam, kullanımı tercih edilir. CO denetlemek için bir cihaz varsa 2 bağımsız uzun vadeli time-lapse görüntüleme için HEPES'e tarafından tamponlu, orta ya da orta.
    3. Okülerlerinde ışık yolu seçin.
    4. Üzerinde parlak bir alan ışık kaynağının deklanşöre çevirin. Göz mercekleri ile mikroskop altında hücrelere odağı ayarlayın. Aydınlık alan ışık kaynağı off için deklanşöre çevirin.
    5. Üzerinde floresan ışık kaynağı için deklanşöre çevirin. Göz mercekleri ile mikroskop altında floresan proteinleri ifade eden hücrelerin bulun. Floresan ışık kaynağı off için deklanşöre çevirin.
    6. İsteğe> Basın time-lapse edinimi sırasında sabit odak tutmak için üzerinde mükemmel odaklama sistemi açmak için mikroskop önünde mükemmel odaklama sistemi için aktivasyon düğmesine basın.
    7. Dönen bir disk konfokal mikroskop ışık yolu değiştirin. Uygun görüntüler displa kontrol, işletim yazılımı kullanarak edinimi için ayarlarınıEkranda yed. (Örneğin Odak, lazer güç, etki süresi, CCD kamera kazanç ve off-set)
    8. Işletim yazılımı kullanılarak floresan görüntü elde etmek için set ayarları. Örnek: Kanal biri için EGFP'nin floresan sinyali elde etmek: "ışık yolları kullanarak kanal değiştirme" ve "EGFP Kanal 1" seçeneğini seçin.
    9. Işletim yazılımı kullanarak zaman atlamalı görüntü almak için time-lapse ayarlarını yapılandırarak zaman noktaları arasındaki frekansı ayarlayın. Örnek: Bir zaman noktasını her 5 dakikada kazanmak için, açılan menüden "Time-noktası başına Dakika" seçeneğini seçin ve metin alanına 5 girin.
      NOT: gerçek hızda bir film yapmak için "Maksimum Hız" seçeneğini seçin. Floresan protein ifadesi düşükse, floresan time-lapse edinimi sırasında hızlı beyazlatabilir. Bu durumda, bu satın alma zaman noktalarının sayısını azaltmak için daha iyidir.
    10. "Sta tıklayarak time-lapse satın alma başlayınBir görüntü dizisini elde etmek rt "düğmesine basın.
      NOT: Birden fazla puan toplama işlevini kullanmak daha iyi değil. Bu time-lapse görüntüleme sırasında görüntüleme alanında odak veya hareket kaybına neden olabilir.
  2. Alınan görüntülerin Analizi
    NOT: Edinsel Görüntülerin bir film dosyası olarak oynatılır ve analiz yazılımı kullanılarak analiz edilebilir.
    1. Bir filmde dahil edilecek edinilen görüntüleri seçin. Gerekirse, kırpma görüntüleri ilgi bölgeleri ve işletim yazılımı kullanarak filmin dosya boyutunu azaltmak için ilginç bir zaman-noktalarını seçin.
    2. Bir AVI film dosyasına veya MOV formatında İhracat görüntüler. "Format" açılır menüsünden ve bitmiş film için gerekli zamanlama bir film biçimini seçin, ardından "Export" tıklayın. NOT: Her 5 dakikada gerçek hızdan 3.000 kat daha hızlı saniyede 10 kare, bir film olarak geri çalınabilir bir zaman noktasında edinilen Time-lapse görüntüleri.

    3. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Teknik, lentivirüs encoding EGFP (gelişmiş yeşil floresan protein)-etiketli Cx43 (Connexin43) veya hücrelerde EGFP-etiketli proteinleri ifade etmek için kullanılan bir mutasyona uğramış Cx43 32 ve bir adenovirüs kodlama FGFR1DN (fibroblast büyüme faktörü reseptörü 1 baskın negatif açıklamak için ) hücrede 33-35 FGF sinyalizasyon kapatmaya kullanıldı. Kardiyomiyositlerde izolasyonu, aşağıdaki üç gün, izole edilmiş kardiyomiyositlerde hücrelerinde EGFP-etiketli proteinleri ifade etmek için lentivirüs ile transdüse edilmiştir. Daha sonra lentiviral transdüksiyon 3 gün sonra, izole edilmiş kardiyomiyositlerde ayrıca hücrelerde FGF sinyallemesini ortadan kaldırmak için bir adenovirüs kodlama FGFR1DN ile transdüse edilmiştir. Transduse dışsal genleri ifade hücreleri için yeterli süre bırakıldıktan sonra, bir dönen disk konfokal mikroskop canlı hücre görüntü yakalamak için kullanıldı. Edinsel Görüntülerin bir film dosyası olarak oynatılır ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilmektedir. Daha ayrıntılı temsilcisi içintive sonuçları Sakurai ve ark 32 bakınız.

EGFP ifade lentiviral transdüksiyonu lentiviral transdüksiyonu Şekil 1A-B, aşağıdaki konfokal mikroskopi döner disk 72 saat ile teyit edilmiştir, aşağıdaki etiketli proteinlerin. Adenoviral transdüksiyonu ile FGFR1DN ekspresyonu adenoviral iletim Şekil 1C-D, 24 saat sonra WB ve ICC ile teyit edilmiştir. 3.5 cm yemekleri adenoviral ilave zamanlı görüntü 37 ˚ C'de sıcaklığı korumak için bir odacık ısıtıcı kullanılarak 40x hava NA 0,9 objektif lens ile 6 saat boyunca her 5 dakikada elde edildi, 0 zamanında ve zaman atlamalı olarak tanımlandı Konfokal dönen disk mikroskobu ile alınan birincil kardiyomiyositlerindeki EGFP-etiketli proteinlerin Time-lapse görüntüleri Ek Filmler 1-2 gösterilmiştir.

Durumda, sıcaklık dengeleme yeterli değildi ya da çoklu-erişim kipi düzgün olmayan nerededüzgün otofokus sistemini stabil muhafaza odak çalışırken çekilen görüntüleri Ancak. xy düzleminde Ek Film 1 hareket olabilir ve bu meydana gelmedi. Sıcaklık dengeleme yeterli ve ilgi duyulan tek bir bölge satın alınmıştır Ek Film 2, gösterildiği gibi, çekilen görüntüler çok yüksek bir kalitede.

Kardiyomiyositlerin dayak hücre canlılığı teyit etmek için uzun vadeli time-lapse canlı hücre görüntüleme sonra değerlendirildi. Zaman atlamalı görüntüleme EGFP ifade kardiyomiyositlerin 16 saat fonksiyonel özelliklerini muhafaza ve ritmik Ek Movie 3 dövdü sonra bile.

Şekil 1
Lentiviral veya adenoviral transdüksiyon aşağıdaki protein ifadesinin Şekil 1.. Onay. (A) Cx43-WT-EGFP ifade İzole sıçan yenidoğan kardiyomiyositler 3 gün transdüksiyon sonra Ad-FGFR1DN transdüksiyona. Ayrıca Ek Movie 1 Bkz. (B) 3 gün transdüksiyon sonra Ad-FGFR1DN transdüksiyona Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP ifade İzole sıçan yenidoğan kardiyomiyositler. Transdüksiyon sonra ICC 24 saat tespit adenoviral transdüksiyonuna aşağıdaki Ek Film 2 Ayrıca bakınız. (C) Protein ifade. Transdüksiyon sonra WB 24 saat ile tespit adenoviral transdüksiyon aşağıdaki FGFR1DN protein hemaglutinin (HA) protein-etiketli FGFR1DN ICC geleneksel yöntemler kullanılarak anti-HA antikoru ile tespit edildi, alfa-aktinin kardiyomiyositlerde için bir marker olarak kullanılmıştır. (D) ifadesi. HA-etiketli FGFR1DN WB anti-HA antikoru ile tespit edildi, beta-tubulin yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır.

İzole sıçan yenidoğan arabanın Ek Film 1. Time-lapse görüntüleme Ad-FGFR1DN transdüksiyona Cx43-WT-EGFP ifade diomyocytes. time-lapse görüntüleri 40x objektif lens konfokal dönen disk mikroskop ile 6 saat boyunca her 5 dk ile elde edildi. Edinsel görüntüleri saniyede 10 kare hızında bir film olarak geri oynandı. Bu film Sakurai ve ark 32 modifiye edilmiştir. Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.

Ek Film 2. Ad-FGFR1DN transdüksiyona Cx43-S325/328/330E-EGFP ifade izole sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin Time-lapse görüntüleme. Time-lapse görüntüler confocal ile 6 saat boyunca her 5 dk bir 40x objektif lens ile elde edildi Disk mikroskop iplik. Edinsel görüntüleri saniyede 10 kare hızında bir film olarak geri oynandı. Bu film Sakurai ve ark 32 modifiye edilmiştir."Target =" _blank "> Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.

İzole sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin Ek Film 3. Time-lapse görüntüleme geri gerçek hızda oynandı. Ad-FGFR1DN 10 için bir 40x objektif lens ile her 200 msn'den edinilen transdüksiyona Cx43-EGFP ifade izole sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerin zaman atlamalı görüntüleri time-lapse edinimi 16 saat izleyen bir konfokal dönen disk mikroskop ile sn. Edinsel görüntüleri gerçek hızda saniyede 5 kare bir film olarak oynatılabilir edildi. Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neonatal sıçan izole edilmiş primer kardiyomiyositlerde uzun in vitro kardiyomiyosit fonksiyonlarını incelemek için kullanılmıştır. Bu protokol, ilk olarak 4 ° C'de tripsin O / N ile sindirerek ve daha sonra saflaştırılmış kolajenaz, iki aşamalı bir enzim sindirimi yöntemi kullanılarak sıçan yavrularından neonatal kardiyomiyositlerde izolasyonu için bir yöntem tarif eder. Saflaştırılmış kolajenaz adımı kullanarak bir avantajı enzim aynı sınıf tüm izolasyon için kullanılan olmasıdır. Böylece, izole edilmiş hücrelerin kalitesi ve miktarı deney için deney tutarlıdır.

Hücre kültürünün iletimi yüksek bir verimlilik belirli bir deney için gerekli olup olmadığını, adenovirüs ile ilişkili daha yüksek transdüksiyon verimliliği göz önüne alındığında, bir adenovirüs kullanmak daha iyidir. Transdüksiyon düzeyi yüksek gerekli değildir, ancak, bir lentiviral vektör kullanılabilir. Adenoviral veya lentiviral vektörler kullanılarak ya da bir seçenek olması, kolay, uygun transd elde etmeyi mümkün kılargenlerinin farklı tipleri için uction ve ekspresyon seviyeleri. Floresan yoğunluğu konfokal mikroskop dönen disk ya da ICC kullanılarak canlı hücre görüntüleme ile saptanması durumunda, bu sorunu çözebilir ilgi konusu geni ifade etmek için farklı bir promotör kullanan başka bir lentiviral aktarım vektörü kullanılarak, lentiviral transdüksiyon sonra çok düşüktür. DB tarafından tespit bant adenoviral transdüksiyon sonra zayıf ise adenoviral vektörler, bu bir düşük titreye viral stok gösterebilir. Bu durumda, bu devam etmeden önce hücre üretilmesi ile daha yüksek bir titer adenoviral çözelti hazırlamak için daha iyidir.

Bu tekniğin bir sınırlama saflaştırılmış kolajenazı kullanırken bile izole canlı kardiyomiyositlerin verim, deneme deney son derece tutarlı olmasıdır. Tekrarlanabilir görüntüleme deneyleri gerçekleştirmek için bu aşama 1.2.13 de yüzer izole kardiyomiyositlerde seçimi sonra canlı kalan hücrelerin sayısı en iyisidir. Protokol bölümünde. Daha sonra, sedeğişen seyreltiklerinde cam alt yemekleri kardiyomiyositlerin ed. Hücrelerin bağlı sonra, deney için uygun hücre konsantrasyonu ile seçim yemekler planlanmış.

Neonatal kardiyomiyositlerin kullanmanın birçok avantajı vardır, ancak bazı dezavantajları da vardır. Büyük dezavantajı erişkin kardiyomiyositlerin onların net farktır. Tamamen farklı yetişkin kardiyomiyositlerde çubuk şekilli olan ve izole edilmiş neonatal birincil kardiyomiyositlerde her yöne 36 yayılmış ise izole edilmiş yetişkin birincil kardiyomiyositlerde, kendi çubuk-benzeri morfolojiye korumak. Izole edilmiş yetişkin ve neonatal kardiyomiyositlerinde arasındaki fenotipik farklılıklar da gen ifadesinin 37 kendi kalıpları içinde yansıtılır. Bu nedenle, farklı kardiyomiyositlerde gerekmektedir edildiği deneyler için, yetişkin kardiyomiyositlerde izolasyonu için bir protokol 4 gerekli olacaktır.

Rekombinant adenoviral ve lentiviral transdüksiyonunu istihdamkonfokal dönen disk mikroskobu ile birlikte primer sıçan yenidoğan kardiyomiyositlerde içine proteinler bize kültürlü canlı primer hücrelerde proteinlerin fonksiyonlarını analiz etmeyi sağlar. Hücrelerine ilgi konusu geni tanıtmak için transfeksiyon kullanmak mevcut yöntemlere kıyasla, bu protokol önemli bir avantajı, adenovirüsler ve lentivirüsler çok verimli bir şekilde hemen hemen tüm hücrelerde ilgi konusu genin ekspresyonu ile sonuçlanan hücreler tarafından alınır olmasıdır Kültür. Ayrıca, gen ifadesi için virüs iki farklı türde kullanımı çok daha kolay genleri için uygun iletim oranları ve ekspresyon seviyelerini elde etmek için yapar. siRNA'lar ve kimyasal agonistleri ve antagonistleri, daha da bozmakta ve genlerin fonksiyonları ve kodladıkları proteinleri analiz etmek için bu sistemde kullanılabilir.

Kalplerin hazırlanması protokolde son derece önemli bir adımdır. Mümkün olduğunca çabuk vücuttan kalpleri çıkarın. Emin olunhücre canlılığı yüksek tutmak için hemen buz üzerine koydu. Bir diğer önemli adım kaliteli ve titresi, adenoviral / lentiviral stoklarının hazırlıktır. Kalitesiz viral stoklar kullanıldığında, ilgi konusu genin transdüksiyonu ve ekspresyon seviyesi düşük olacaktır. Bu nedenle, görüntüleme çalışmaları için uygun olmayabilir.

Bu tekniğin gelecekte önemli bir uygulama fare kardiomyositlerindeki onun 'kullanımı olacaktır. Bu yöntem fare neonatal kardiyomiyositlerde izolasyonu için kullanılabilir olup olmadığını Pilot çalışmalarda test ümit verici sonuçlar vermiştir. Nedeniyle sıçanlara kıyasla fare kalplerin nispeten küçük boyutu, daha az doku ilk olarak elde edilir. Bu nedenle, daha az hücre, aynı hayvan numarası ancak sadece izolasyonu için daha fareler kullanılarak bu engeli ortadan kaldırmak gerekir kullanarak tek bir prosedür olarak izole edilmiştir. Fare kardiyomiyositlerde izole yeteneği Araştırmacılar, genetik olarak değiştirilmiş m izole hücrelerin fonksiyonlarını incelemek sağlar:buz (transgenik, knock-out, knock-in) ilgi geninin belirli bir formu incelemek amacıyla üretilmiş olması.

Kardiyovasküler Araştırma en önemli engellerden biri, gerçek zamanlı olarak, in vivo olarak, kalp dokusunda ifade edilen, belirli bir genin ifadesini ve işlevini soruşturma ilişkili zorlanmasıdır. Ancak fonksiyonel dayak kardiyomiyositlerin izole viral iletimini kullanarak hücre fonksiyonlarını modüle, ve sonra konfokal dönen disk mikroskop kullanarak gerçek zamanlı olarak çalışma yeteneği in vivo kardiyomiyositlerin rolüne ışık tutacak ve bu uçurumu kapatmaya yardımcı olur. Bu yöntem hücresel düzeyde kardiyomiyosit fonksiyonu anlamak için basitleştirilmiş bir sistem sağlar. Bu gen ifadesinde tedirginlikler kardiyomyosit işlevini değiştirmek nasıl gerçek zamanlı analiz sağlar. Kardiyomiyositlerin canlı hücre görüntüleme kardiyomyosit fonksiyonu içine daha fazla anlayış sağlayacaktır. Bu tür anlayışlar temel cardiovascula gelişmeler yol açacaktırkardiyovasküler hastalıkların tedavisi için yeni tedavilere yol r araştırma.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Scissors for decapitation WPI 501749 Autoclave before use
1 Fine scissors for heart isolation and chopping WPI 14393 Autoclave before use
2 Fine forceps (Dumont No. 5) Sigma F6521 Autoclave before use
3 Sterilized 10 cm plastic dishes Sigma CLS430165 For heart isolation
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-1.5-20-C For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.
3.5 cm Glass bottom culture dishes MatTek P35G-0.17-14-C For TIRF or high resolution image
Ethanol solution, 70% (v/v) in water Sigma E7148
2% Gelatin Sigma G1393
1 Sterilized 10 cm plastic dish Sigma CLS430165 For trypsinization
Aluminium foil Any brand
Parafilm Sigma P7543
Two 10 cm plastic cell culture dish Sigma CLS430165 For selection
Autopipette Drummond Scientific 4-000-300 For trituration
Cell counter
Cellometer, automated cell counter nexcelom To check and count cells
Microscope and hematocytometer Any brand To check and count cells
Trypan blue solution, 0.4% invitrogen 15250-061
CO2 incubator Sanyo MCO-19AIC
Incubating orbital shaker Sigma Z673129 To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm
10 mg/ml BrdU solution BD Pharmingen 550891
DMEM, high glucose invitrogen 41965039 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
MEM invitrogen 31095029 Mix medium as indicated in the protocol and warm before use
Fetal bovine serum invitrogen 26140079
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)  invitrogen 15140-122
Section 2 Lentiviral transduction
3 Packaging plasmids
pMDLg/pRRE Addgene 12251
pRSV-Rev Addgene 12253
pMD2.G Addgene 12259
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro Clontech 632183
Opti-MEM (serum-free medium) invitrogen 31985070
Transfection reagent
polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)  Polysciences 24765-2 It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001 substitute for PEI as transfection reagent
Chloroquine Sigma C6628 Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine.
HEPES Sigma H3375
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized BD 309604
0.45 μm filters Sigma F8677 Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.
Hexadimethrine bromide Sigma H9268 Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.
Polyethylene glycol 6,000 Sigma 81260
Sodium chloride Sigma S9888
Sodium hydroxide Sigma S5881
Section 3 Adenoviral transduction
HEK 293T cells ATCC CRL-11268
Some 10 cm cell culture dishes Sigma CLS430165
96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile BD Falcon 353072 For titration
Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel eppendorf 3122 000.035
Section 4 Live cell imaging
Spinning disk confocal microspopy PerkinElmer L7267000
A temperature-controlled chamber Any brand To keep temperature at 37 °C
A CO2 environmental system Any brand Optional to maintain CO2 concentration optimal
CO2 Independent medium, no glutamine invitrogen 18045-054   For long time time-lapse imaging
DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red invitrogen 21063-029 For long time time-lapse imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
  2. Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
  3. MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
  4. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
  5. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
  6. Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
  7. Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
  8. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
  9. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
  10. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
  11. Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
  12. Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
  13. Metzger, J. M. Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).
  14. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
  15. Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
  16. Bonci, D., et al. Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
  17. Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
  18. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
  19. Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
  20. Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  22. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  24. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
  25. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
  26. Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
  27. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
  28. Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
  29. McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'. Virology. 40, 745-746 (1970).
  30. Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
  31. Kaerber, G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).
  32. Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
  33. Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
  34. Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
  35. Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
  36. Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
  37. Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 88 canlı hücre görüntüleme kardiyomyosit primer hücre kültürü adenovirüs lentivirüs konfokal dönen disk mikroskopi
İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. … More

Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy. J. Vis. Exp. (88), e51666, doi:10.3791/51666 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter