Abstract
彼らは簡単に単一のプロシージャで大量に単離することができるので、初代ラット新生児心筋細胞では、基本的なin vitroでの心血管系の研究に有用です。原因顕微鏡技術の進歩には、細胞への毒性に関する最小限の懸念をリアルタイムに細胞事象を調査する目的で生細胞の画像をキャプチャすることは比較的容易である。このプロトコルは、細胞の性質を調節するためのレンチウイルスおよびアデノウイルス形質導入後の共焦点回転ディスク顕微鏡を用いて、初代ラット新生児心筋細胞の生細胞タイムラプス画像を撮影する方法を説明します。ウイルスは二つの異なるタイプのアプリケーションは、簡単に2つの異なる遺伝子のための適切な伝達率および発現レベルを達成することができる。ウェル集束生細胞画像が長期間にわたって安定したフォーカスを維持し、顕微鏡のオートフォーカスシステムを用いて得ることができる。この方法は、外因的にエンジニアの機能を適用すること初代培養細胞において発現編タンパク質は分析することができる。さらに、このシステムは、siRNAの使用を介して、並びに化学モジュレーターの遺伝子の機能を調べるために使用することができる。
Introduction
初代ラット新生児の心筋細胞は、長い試験管 1 に心筋細胞の機能を調べるために用いられてきた。彼らはいくつかのよく確立された方法2-4でラットの子から隔離するのは簡単です。最も一般的な方法は、従来の細胞分離に対する心臓の結合組織を消化するコラゲナーゼまたはトリプシンを採用しています。研究者はまた、大人のげっ歯類5-8だけでなく、新生仔マウス9,10から心筋細胞を単離する方法を開発した。
このプロトコルは、2段階の酵素消化手順を用いて、新生仔ラットから心筋細胞を単離するための方法を記載している。トリプシンは最初に、4℃でO / Nを使用し、次いで、37℃で、精製されたコラゲナーゼ4℃でのトリプシンのO / Nと心臓組織のインキュベーションは、温かい酵素液2シーケンシャルインキュベーションを用いる方法に比べて収穫細胞に必要な手順を軽減します。加えて、精製されたCOを使用して、むしろ粗酵素よりllagenase、ロット間変動は、このように強化された再現性を提供し、排除することができる。
特定のタンパク質の機能的研究は、多くの場合、アデノウイルス11-13および/ または14-16レンチウイルスを用いたタンパク質発現系を使用する。 [注意事項]ウイルス産生および操作は、NIHガイドラインに従って実施されるべきである。
アデノウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれない。これは、分裂細胞および非分裂細胞を含めたほとんどの細胞型、ならびに初代細胞および樹立細胞株における形質導入の非常に高い効率を有する。これは、アデノウイルスの遺伝子発現のための信頼性のベクトルになります。アデノウイルスベクターによってコードされるタンパク質の高レベルの形質導入後48時間以内に発症し、それらは数週間続く ことができる17。しかし、タンパク質発現のためのアデノウイルスを使用して1つの欠点は、組換えADEの開発novirusは複雑で時間がかかるの両方です。多くの研究者は組換え遺伝子発現のためのレンチウイルスに目を向けてきたのはこの欠点は、部分的に説明しています。アデノウイルス構築とは異なり、レンチウイルスコンストラクトを生成することは、迅速かつ簡単です。レンチウイルスは、一般に、アデノウイルス形質導入のより低い効率を有するが、分裂および非分裂細胞の両方において、それらは、宿主ゲノムに組み込まない。その結果、形質導入された遺伝子の発現は、アデノウイルス、レンチウイルスに対するよりも、より安定である。
による顕微鏡の分野における技術の進歩のために、組換えタンパク質を発現する細胞の生細胞画像を取り込むことがはるかに簡単である。これは、さらに、取得ビデオレート速度で成り立つ。これは研究者は、目的のタンパク質の特定の改変は、機能的に、リアルタイムで細胞に影響を与える方法を決定することができます。共焦点回転ディスク顕微鏡は、LIVのための最適な手法にするいくつかの重要な機能を持っているEセルイメージング18,19。同時に、点走査型共焦点顕微鏡よりもはるかに少ないレーザーパワーを利用して横河スピニングディスクは、はるかに迅速な画像取得を可能にする。これらの特別な機能の両方は、レーザがサンプルに同時に通過する多数の孔を含有する共焦点スピニングディスク、によるものである。収集中に、ディスク自体は、迅速かつ継続的に18〜20を回転させる。顕微鏡のオートフォーカスシステムを使用することにより、安定したフォーカスが長期間にわたって維持される。これは研究者が十分に焦点を当てた生細胞の画像を撮影することができます。取得した画像を動画ファイルとして再生されます。画像は、ImageJの21,22、フィジー23、又は他の市販のソフトウェアなどの画像解析ソフトウェアを用いて分析する。
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Protocol
ラット新生児心筋細胞の1。分離
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および培養培地としてウシ胎児血清（FBS）およびペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充した最小必須培地（MEM）を使用。単離後の最初の2日間線維芽細胞の増殖を防ぐために培地にブロモデオキシウリジン（BrdUの）を追加する。
| 基本培地 | FBS | のBrdU（MM） | P / S（U / ml）を | |
| 選択 | のDMEM | 10パーセント | 0 | 20 |
| 初日 | のDMEM | 10パーセント | 0.1 | 10 |
| 次の日 | DMEM / MEM | 5％ | 0.1 | 10 |
| さらに文化 | DMEM / MEM | 5％ | 0 | 10 |
表1：ラット新生児心筋細胞用培地は、ラット新生児の心筋細胞を培養するための、このメディアを使用してください。 DMEM / MEMはDMEMおよびMEM培地の1:1混合物である。
- 心筋細胞の単離、1日目（推定必要時間、約1時間）
注：新生児げっ歯類での作業のために、動物のケアプログラムで設定された地元の大学のガイドラインやルールを参照し、制度的に承認された動物のプロトコルに準拠しています。このプロトコルで説明されているすべてのメソッドは、イェール大学の動物資源センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されている。- 試薬およびツールを準備し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス液（CMF HBSS）、30ミリリットル×2、10ミリリットル×2、氷の上で;氷上CMF HBSSの2ミリリットルで再構成1mgのトリプシン;オートクレーブ処理ツール; 250mlビーカー中の70％エタノール（EtOH）; 4は、10cmのプラスチック皿、心を単離するための3およびトリプシン処理のための1つを滅菌した。
- オーダー1私信実験動物ディストリビューターからのダムとの1対2日齢のラットの子（約10匹）のER。
- 1日目は、小さなケージに子犬を移し、ケタミン/キシラジンカクテル（ケタミン、200ml/10gおよびキシラジン20ml/10g）過剰摂取でダムを安楽死させる。
- 1子犬を取り、70％エタノールで、その全身を消毒する。他の子犬から隔離場所で殺菌10cmのプラスチック皿上手入れの行き届いた鋭い外科はさみで子犬の首。
NOTE：可能な限り迅速にサンプルを収集するためには、齧歯動物の寿命を終了させるための最も迅速で効率的な方法を使用するのが最適である。きちんと手入れの行き届いた設備と熟練した専門家によって使用断頭は、動物にはあまり恐怖や不安を生じ、安楽死の他の形態よりも、より迅速かつ実用的であり得る。それは、動物の安楽死のためのアメリカ獣医師会ガイドラインの勧告と一致している。 - 彼破っ取り外し滅菌ツールとアート、そして50ミリリットルコニカルチューブに30ミリリットルの氷で冷やし、CMF HBSS中で心を置く。注：可能な限り迅速に心を取り出して、すぐに氷上にそれらを置く。身体から心を除去した後、すべての手順は、氷の上で行ってください。
- 氷で冷やし、CMF HBSSの30ミリリットルと氷で冷やし、CMF HBSSの別の30ミリリットルの残りの5心の中に5心を集める。心を洗うためにチューブを旋回。注：このステップの後、層流フード内のすべての手順を実行します。
- 上澄み液を捨て、氷の上に新しい滅菌10cmのプラスチック皿に心を移す。注：アスピレーターで心を吸引しないように注意してください。
- 大型船および/または望ましくない組織を削除します。心をすすぐために皿に氷で冷やし、CMF HBSSの10ミリリットルを追加します。
- 氷の上に新しい滅菌10cmのプラスチック皿にすべての心を転送します。氷上で1mm未満3にハサミで心をミンチ。
- チルドCMFのHBSS 9ミリリットルを追加します。チルドトリプシンreconstiの1ミリリットルを追加します。CMF HBSS（最終50 UG / ml）でtuted。
- パラフィルムで、皿を密封し、アルミホイルでそれをカバーし、一晩、低温室（4˚C）に置きます。
- 心筋細胞の分離、2日目（推定必要時間、約4時間）
- 準備試薬およびツール：50ミリリットルコニカルチューブ×2;氷上でCMF HBSS 1mlので再構成2mgのトリプシン阻害剤;室温（RT）でのリーボビッツL-15、5 mlで再構成ユニット1500コラゲナーゼ;リーボビッツL-15、滅菌した1リットルの水で再構成し、0.22ミクロンのフィルター、RTで8ミリリットルを通して濾過;水に10 mg / mlの（32.6ミリモル）のBrdU; P / S; DMEM + 10％FBS; MEM; 2つの10センチメートルのプラスチック細胞培養皿; 3.5センチメートルのガラスボトムディッシュ。
- 2日目、ゼラチンコーティングされた料理を準備。コーティングするためにイメージング実験用の3.5cmガラスボトムディッシュを0.1％ゼラチン水溶液1ミリリットルを追加します。使用前にゼラチン溶液を吸引し、廃棄した後、数時間で37˚Cでの料理をインキュベートする。
NOTE：3.5センチメートルのガラスボトムディッシュでは、蛍光顕微鏡を用いてイメージング実験に適している。ウェスタンブロット（WB）によりタンパク質発現を検出するために、初代心筋細胞からタンパク質を抽出するために、0.1％ゼラチン被覆されたプラスチック細胞培養皿を用いることができる。 - 滅菌フード内において50ミリリットルコニカルチューブに緩衝液と一夜トリプシン消化し、すべての心臓組織を転送します。 CMF HBSS中トリプシンインヒビターの1ミリリットル（最終182 UG / ml）を追加します。を50mlコニカルチューブの開閉蓋をしっかり汚染を防止する。
- 組織を温めて30〜37˚Cにバッファリングするために37˚Cのインキュベーター内で約30分間チューブをインキュベートリーボビッツL-15（最終94単位/ ml）にコラゲナーゼの5ミリリットルを追加します。穏やかに振盪（37˚Cのインキュベーター内で170〜200回転シェーカー）で45分間37˚Cでインキュベートする。
注：このステップでは、層流フードの外側に行うことができる。それ以降のすべてのステップは室温で行われる必要があります。 - 70％エタノールで50ミリリットルコニカルチューブの外側を消毒して置くそれ滅菌フード内。
- 20倍の速度を3ml /秒でピペッティングして、自動ピペットを用いて磨砕組織。組織残留が3分のために解決し、70 UMセルストレーナーで上清をフィルタリングすることができます。
NOTE：レギュラーサイズを10mlピペットでトリチュレートために使用することができる。 - 残りの組織塊と粉砕物にリーボビッツL-15の5ミリリットルを加え、再び上清をフィルタリングします。リーボビッツL-15 2mlのセルストレーナーを洗浄します。
- コラゲナーゼは、部分的に分解されたコラーゲンを消化できるようにするために60分 - 20フード内で濾過した細胞液を配置します。
- 5分間100×gで沈降細胞。 10％FBS及び高濃度P / S（20 U / ml）を含有する20mlのDMEM中で細胞を再懸濁する。
- 心筋細胞の選択のため37˚CでのCO 2インキュベーター中で1時間2 10cmのプラスチック製の細胞培養皿上で事前にプレート細胞。注：線維芽細胞は、心筋細胞よりも皿の底により容易に取り付けます。
- WHパリウェイティング、DMEM中、10％FBS、P / S（10 U / ml）および0.1 mMのBrdUをを含む準備。 10％FBSおよびP / Sを含むDMEMの325ミリリットルに10 mg / mlののBrdU 1ミリリットルを追加します。
- 優しく料理を旋回し、2 10cmの皿から心筋細胞を含む上清を収集します。
注：ほとんどの心筋細胞は、依然としてインキュベーションの1時間後に上清中に浮遊されます。軽くお皿に付着している線維芽細胞を汚染しないようにするには、ピペッティングにより上清を収集することはありません。 - オプションの>細胞の生存率をチェックするために、0.2％トリパンブルーでとすることなく、上清中の細胞を数える。
- 5分間100×gで沈降細胞。 10％FBS、P / S（10 U / ml）および0.1mMのBrdUを含有DMEM中で細胞を再懸濁する。顕微鏡を用いて観察するためのゼラチンでコーティングされたの3.5cmガラスボトムディッシュでの2×10 5細胞/皿のプレートの細胞。注：37˚CでのCO 2インキュベーター内に少なくとも24時間、めっき後の細胞を乱さないでください
- 3日目、チャNGE培地で24時間、5％FBS、P / Sおよび0.1mMのBrdUを含有するDMEM / MEMにめっき後。
- 4日目、5％FBSおよびP / Sを含有するDMEM / MEM培地にプレーティング後48時間に変更し
注：5％FBSおよびP / Sを含むDMEM / MEMで2〜3日ごとに培地交換
2。レンチウイルス形質導入
- レンチウイルスプラスミドのパッケージング
注：このテーマ24〜26の詳細、詳細な情報については、他の情報源を参照してください。これは、レンチウイルス溶液を調製し、約3日かかります。それは、より高い導入効率を達成するために、新鮮なレンチウイルスソリューションを使用することをお勧めします。レンチウイルスプラスミドと並行して、ラット新生児心筋細胞を単離のパッケージングを開始します。代わりに、レンチウイルスパッケージングプラスミドのポリエチレンイミン（PEI）27を使用するのではなく、市販のトランスフェクション試薬を使用することができる。メーカーの指示に従ってください。- 試薬およびツールを準備します。 HEK293T細胞を、10cmのプラスチック製の細胞培養皿、レンチウイルスプラスミド溶液（pMDLg / PRRE、のpRSV-英語、pMD2.G、レンチウイルストランスファーベクター、1.0 mg / mlの各々）、1g / lのPEI、無血清培地、20mMの70％EtOH中の水、10％漂白剤、1％SDS中クロロキン
- 0日目を 10cm当たり2〜2.5×10 6のHEK 293T細胞をトランスフェクションの前日皿プレート。
注：トランスフェクションで30〜60％のコンフルエンスが最適である。 - 1日目 、PEIトランスフェクション溶液を準備する。 1.5mlチューブ内の960のUL無血清培地に1グラム/リットルPEIの30 ULを追加します。 1.5mlチューブ内のPEIトランスフェクション溶液に4プラスミドを追加し、タップして混ぜる。
プラスミドの名前 ノート サイズ（kbpの） ボリューム追加（ML） 10cmディッシュ（mg）の中の最終量 10cmディッシュ（PM）中の最終濃度 レンチウイルス導入ベクター 包装される遺伝子をコードする 9月13日 3.6から5.2 3.6から5.2 60 pMDLg / PRRE HIV-1 GAG / POLを表現 8.8 1.76 1.76 30 のpRSV-REV HIV-1のREVを表現 4.1 0.82 0.82 30 pMD2.G VSV Gが表現 5.8 1.16 1.16 30 表2：レンチウイルスパッケージングのためのプラスミドの量は、10cmの皿でHEK293細胞をトランスフェクトするために、これらのプラスミドの量を使用する。皿当たりレンチウイルス導入ベクターの最終量は60時に皿あたりの最終濃度を維持するため、その大きさに応じて異なる場合があります。二本鎖DNAの一塩基対の平均分子量は660ダルトンである。
- 古い培地を捨てるHEK 293T細胞の10cmの皿から、ゆっくり新しい培地9ml（P / SなしのDMEM +10％FBS）を追加。
- PEI-DNA混合物を追加そっとプレートに単位を落とし、ゆっくりと媒体と混合する旋回。 10ミリリットルを培地に20mMのクロロキン（最終20 UM）10μlのを追加します。 NOTE：クロロキン、リソソームコンパートメント28内のpHの部分的な中和を介したプラスミドを含有するトランスフェクション複合体の分解を減少させると考えられている。
- 6時間、37˚CでのCO 2インキュベーターで培養する。次いで、PEI-DNA混合物を含有する培地を除去し、新しい培地10mlを加える（DMEM + 10％FBS + 20 mMの4 - （2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、pH7.4の+ P / S） 。 NOTE：インキュベーション後、ウイルスが培地中に生産されるであろう。吸引パスツールピペットおよび/またはチップには10％の漂白剤で除染する必要があります。関係なく、常に上清をこぼしたかどうかの生物学的安全キャビネットの表面を除染し、70％EtOHで汚染された可能性の機器か。スピルが発生した場合、70％EtOH中の1％SDSで十分に汚染除去が必要である。
- 一日2〜3、48〜72時間、37˚CでのCO 2中インキュベートインキュベーター。4日目 、（ セクション2.2に進みます）レンチウイルスソリューションを収集します。
注：ミディアムトランスフェクション後48時間で変更することができます。ウイルス上清を収集する48時間と72時間2倍の力価のウイルス溶液を得るために達成することができる。
- レンチウイルスソリューションおよび形質導入のコレクション
- 試薬およびツールを準備します。15ミリリットルコニカルチューブ、1M HEPES、pH7.4の（0.22 UMフィルタリング）
- 4日目 、15ミリリットルコニカルチューブにUM 0.45通ってフィルタを上清をフィルタリングして、ルアーロックシリンジに滅菌10mlでレンチウイルス粒子（レンチウイルスソリューション）を含む上清を回収。フィルターレンチウイルス溶液（最終10 mM）を1 M HEPES pH7.4の1/100のボリュームを追加します。
注：フィルタリングのために、唯一のセルロースエースを使用テートまたはポリエーテルスルホン（PES）（蛋白質結合の低いもの）フィルタ。ニトロセルロースフィルターを使用しないでください。ニトロセルロースは、レンチウイルスエンベロープ上の表面タンパク質に結合し、ウイルスを破壊する。 - 1.2節の最後のステップで得られたラット新生児心筋細胞の3.5センチメートルディッシュから培地を除去3.5 cmディッシュにフィルタレンチウイルス溶液1mlを加える。
- 臭化ヘキサジメトリン（最終濃度4-6 UG / ml）を追加し<Optional>。
NOTE：ヘキサジメトリンブロミドは、レンチウイルス形質導入の効率を高めることができる。ヘキサジメトリンブロミドの濃度が最適化されるべきである。 - レンチウイルス形質導入のため37˚CでのCO 2インキュベーターで6時間、お皿をインキュベートし、5％FBSおよびP / Sを含む新しいDMEM / MEMに培地を変更3日間、37˚CでのCO 2インキュベーター内で料理をインキュベートする。
NOTE：レンチウイルスによる宿主ゲノムへの外来遺伝子の組み込みは、72時間までに完了していると考えられる。
注：これは、レンチウイルス溶液の力価が十分に高くない場合には、最も高い形質導入効率を達成するために、新鮮なレンチウイルス溶液を使用するのが最適であり、レンチウイルス溶液は、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿29によって濃縮することができる。
- 4倍のPEG溶液（32％PEG6000、400mMの塩化ナトリウム（NaCl）を、40mMのHEPES pH7.4）中の調製
- 125ミリリットル4X PEG溶液のために、そして60ミリリットルの水に溶かし、PEG6000の40グラムの重量を量る。
注：注：（。 すなわち PEG6000の平均分子量は6000である）、PEGの後の数字は平均分子量である
注：2.3.1.2）をゆっくりと10ミリリットルを追加の5M NaCl。ゆっくりと1のHEPES pH7.4の5mlのを追加します。 2Mの水酸化ナトリウムを用いてpHを7.4に調整する。
注：2.3.1.3）125ミリリットルに水を追加します。 0.22μmのフィルターを用いて膜濾過により4X PEG溶液を殺菌し、4˚Cで保管して
- 125ミリリットル4X PEG溶液のために、そして60ミリリットルの水に溶かし、PEG6000の40グラムの重量を量る。
- レンチウイルス濃度
- フィルタレンチウイルスは、0.45μmのフィルターを用いて新たな50mlチューブに上清を形質導入した。
注：上清= 1:3）：2.3.2.2）4X PEG溶液を1:3の比（PEG溶液を追加します。 16〜48時間、4˚Cで保存してください。
注：30分間4˚Cでの2600 X gで2.3.2.3）遠心分離する。 5分間4˚Cでの2600 X gで上清遠心を捨てる。
注：2.3.2.4）のペレットを乱さないように注意し、上清を捨てる。再懸濁1/2元の上清容積の1/25容積するため使用する無血清培地中でペレット。
注：2.3.2.5）を直接使用するか、液体窒素を用いて凍結し、-80˚Cで保存
- フィルタレンチウイルスは、0.45μmのフィルターを用いて新たな50mlチューブに上清を形質導入した。
3。アデノウイルスの形質導入
注：アデノウイルス構築13の構成および増殖のための方法のために他の情報源を参照してください。吸引パスツールピペットおよび/またはチップには10％の漂白剤で除染する必要があります。常に生物学的安全キャビネットの表面を除染して、潜在的に関係なく、上清をこぼしたかどうかの70％エタノールで機器に汚染。スピルが発生した場合、70％EtOH中の1％SDSで十分に汚染除去が必要である。
- 50％組織培養感染量によってアデノウイルス滴定（TCID 50）
注：形質導入する前に、アデノウイルスのストック溶液を滴定することが必要である。 TCID 50は、ウイルス溶液を滴定するための最良の方法の一つである。この方法は、HEK 293T細胞への感染力によって力価を評価しているため、計算されたTCID 50は、アデノウイルスストックの実際の感染能を反映している。 PFU（プラーク形成UNITS）約0.56 30倍でTCID 50に比例している。- 細胞およびツールを準備する：HEK 293T細胞を10cmの細胞培養皿、96ウェル平底細胞培養プレート、8チャンネルマルチピペット
- 1 10cmの皿に70％〜90％コンフルエントのHEK 293T細胞を準備します。
- ウイルスストックの1月10日4の予備希釈を行う。 96ウェル平底細胞培養プレートの各ウェルにDMEM + 10％FBS50μlのを追加する。からHに、最初の行に予め希釈したウイルスストックの25 ULを追加
- よく混合し、8チャンネルマルチピペットを用いて二行に井戸の最初の行から25 ULを転送します。 1月3日までの井戸の各行へのウイルス溶液の希釈と11行を含むを繰り返して、最後の25 ULを捨てる。
- DMEM +10％FBSの10ミリリットルに粉末化したHEK 293T細胞。 1〜12行から各ウェルに細胞溶液の50μlのを追加します。
- 11月13日日のCO2インキュベーターで37˚Cでの細胞をインキュベートする。 DMEM +10 1の50 ULを追加4-5日とメッキの7-8日後には0％のFBS。
- 感染後11から13日後に各ウェルの細胞変性効果を測定します。
レーン 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 行A D D D D D D D D D 行B D D D D D D D D D 行のC D D D D D D D D D 行D D D D D D D D 行E D D D D D D D D D D D 行F D D D D D D D G行 D D D D D D D D 行H D D D D D D D D D D D 行当たりの陽性ウェルの数 8 8 8 8 8 8 8 6 5 2 2 0 行当たりの陽性ウェルの割合 1 1 1 1 1 1 1 0.75 0.63 0.25 0.25 0 D 50％以上の細胞変性効果を表示する 50％の下に表示されないか、または細胞変性効果 レーン1、希釈3 1×10 4;レーン2、3 2倍希釈物4; ···;レーン11、希釈3 2×10 11;レーン12、コントロール。
Sは、行ごとの陽性ウェルの比率の合計を=
= 1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0.75 0.63 0.25 0.25 0 = 8.875
×10 8 TCID 50 = 3×10 4×3×（8.875から0.5）= 2.97
TCID 50 / mlの= 5.94×10 9表3：感染した96ウェルプレート10日間のインキュベーション後 、各ウェル内の細胞変性効果を測定し、行ごとの陽性ウェルの比率を合計する例 。
- Kaerberの式に従って力価を計算します
- TCID 50 =（最初のレーンの希釈）×（希釈）（S-0.5）
- Sは、行ごとの陽性ウェルの比率の合計を=
注：このプロトコルの場合、TCID 50 =（30000）X（3）、（S-0.5）。ウイルス液50μlのこのプロトコルで使用されているため、TCID 50 / mlで計算するために0.05 TCID 50を分割する。
- アデノウイルス形質導入
- その力価（PFU / mlのmlまたはTCID 50 / mlのウイルス粒子/）から、アデノウイルス液の必要量を計算します。 MOI（感染多重度）を計算するための式を使用しています。
- EM> [ここに置いて表4]
- 無血清培地にウイルス溶液の計算された量を追加する（表5参照）。よく混ぜ、室温で20分間インキュベートする。
- EM> [ここに置いて表5]
- 7日目には、2.2節の最後のステップで得られた料理を取り、5％FBSおよびP / Sを含む新しいDMEM / MEMの750 ULを含む培地を交換してください
注：中量の削減元の体積の約50％に伝達において高い導入効率のために重要である。 - お皿に希釈したウイルス液を追加します。 37˚CでのCO 2インキュベータ内で4〜8時間の皿をインキュベートその後、新鮮な培地と交換してください。
- 37˚CでのCO 2インキュベータ内で24〜48時間のために料理をインキュベート一日8-9で、生細胞イメージング実験のための細胞を使用してください。 NOTE：アデノウイルスプラスミドからのタンパク質発現は、相対タンパク質発現レベル（図1c、1dに）を決定するために、形質導入の24〜48時間後にWB又はICHにより確認することができる。
4。ライブセルイメージング
- 温度制御室とスピニングディスク共焦点顕微鏡を用いた画像取得およびCO 2環境システム（オプション）
- すべてのデバイスが買収前の先頭に37˚Cまで平衡化するように、買収前に、少なくとも1時間に温度制御システムをオンにします。 confocをオンにするら、ディスク顕微鏡システム（PC操作のため、顕微鏡、スピニングディスク装置、CCDカメラ、レーザ、蛍光光源、通常光光源、電動ステージ、自動シャッター）スピニング。
NOTE：複数の1時間は、すべてのデバイスの完全な温度平衡を達成するのに必要である。 - 必要に応じて、取得のために必要な培地は3.5センチメートルガラスボトムディッシュにメディアを変更します。温度制御されたチャンバー内の共焦点回転するディスクの顕微鏡のステージ上の皿を置きます。
注：原因番1.5カバーガラスで3.5センチメートルガラスボトムディッシュ（約0.16〜0.19ミリメートルの厚さ）の顕微鏡を用いて、最適な観察のための球面収差を理想的です。使用される目的は、補正環を有する場合には、0.17ミリメートルよりも厚いカバーガラスを用いて得られた画像を補正することができる。また、フェノールレッド、わずかな蛍光を持っています。場合によっては、フェノールレッドを含まないDMEM例えば、フェノールレッドを含まない培地を用いることが好ましい。 COを制御するための装置がまだ存在しない場合 - 接眼レンズへの光路を選択します。
- 上の明視野光源のシャッターを切ります。接眼レンズを通して顕微鏡下で細胞にピントを合わせます。明視野光源オフのためにシャッターを切ります。
- 上の蛍光光源にシャッターを切ります。接眼レンズを通して顕微鏡下で蛍光タンパク質を発現する細胞を見つける。オフ蛍光光源のためにシャッターを切ります。
- 別売>プレスタイムラプス収集中に着実にフォーカスを維持するために、上の完璧なフォーカスシステムをオンにする顕微鏡の前で完璧なフォーカスシステムの起動ボタン。
- 回転するディスク共焦点顕微鏡への光路を変更します。適切に画像のディスプレイ表示をチェックし、オペレーティングソフトウェアを使用して取得するための設定を調整します画面上YED。 （ 例えばフォーカス、レーザパワー、露光時間、CCDカメラゲインおよびオフセット）
- オペレーティングソフトウェアを用いた蛍光画像取得のための一連の設定。例：チャンネル1のために、EGFPからの蛍光シグナルを取得するには、次のように「光路を使ってチャンネルを変更」を選択し、「EGFPチャンネル1」。
- オペレーティングソフトウェアを使用してタイムラプス画像を撮影するために、タイムラプスの設定を構成することで、時間の点の間の周波数を設定します。例：1の時点を5分ごとに取得するには、ドロップダウンメニューから「タイムポイントあたりミニッツ」を選択し、テキストフィールドに5を入力してください。
注：実際の速度で映画を作るために「最高速度」を選択します。蛍光タンパク質の発現が低い場合、蛍光が経時取得中に迅速に漂白よい。その場合には、取得時間点の数を減らすことが良い。 - 「STAをクリックして、タイムラプス取得を開始します画像シーケンスを取得する」ボタンを室温。
NOTE：これは、複数のポイント取得機能を使用しない方がよい。それは、タイムラプス撮影時撮像視野の焦点や移動の損失が発生することがあります。
- すべてのデバイスが買収前の先頭に37˚Cまで平衡化するように、買収前に、少なくとも1時間に温度制御システムをオンにします。 confocをオンにするら、ディスク顕微鏡システム（PC操作のため、顕微鏡、スピニングディスク装置、CCDカメラ、レーザ、蛍光光源、通常光光源、電動ステージ、自動シャッター）スピニング。
- 取得された画像の解析
NOTE：取得画像は、動画ファイルとして再生し、解析ソフトウェアを用いて分析することができる。- 映画の中で含まれるように取得された画像を選択します。必要に応じて、トリミング画像から関心領域及びオペレーティングソフトウェアを使用して、ムービーのファイルサイズを小さくすることは興味深い時点を選択する。
- AVIのムービーファイルやMOV形式としてエクスポート画像。 "フォーマット"ドロップダウンメニューと、完成したムービーに必要なタイミングからのムービーフォーマットを選択して、「エクスポート」をクリックしてください。注：1の時点で、5分ごとに取得した時間経過の画像は、実際の速度よりも3000倍速い毎秒10フレームで映画として再生することができます。
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Representative Results
技術は、レンチウイルスをコードするEGFP（強化緑色蛍光タンパク質）タグ化Cx43の（コネキシン43）又は細胞におけるEGFP-タグ融合タンパク質を発現するために使用された変異したCx43 32、およびアデノウイルスをコードFGFR1DN（線維芽細胞増殖因子受容体1ドミナントネガティブを説明するために）セル33-35においてFGFシグナリングをシャットダウンするために使用した。心筋細胞の単離後三日間は、孤立した心筋細胞は、細胞中のEGFP標識タンパク質を発現させるためにレンチウイルスを形質導入した。次に、レンチウイルス形質導入の3日後に、孤立した心筋細胞は、さらに細胞内のFGFシグナル伝達を排除するためのアデノウイルスのエンコーディングFGFR1DNで形質導入した。形質導入された外因性遺伝子を発現するように細胞のための十分な時間を与えた後、スピニングディスク共焦点顕微鏡は、生細胞の画像をキャプチャするために使用した。取得された画像は、動画ファイルとして再生し、画像解析ソフトウェアを用いて分析する。より詳細なrepresenta用TIVE結果は、桜井ら 32を参照してください。
EGFPの発現は、レンチウイルス形質導入後のタンパク質をタグ化レンチウイルス形質導入、図1A-B以下のスピニングディスク共焦点顕微鏡72時間で確認した。アデノウイルス形質導入によるFGFR1DNの発現は、アデノウイルス形質導入、図1C〜Dの24時間後にWBおよびICCにより確認した。の3.5cm皿にアデノウイルスの添加時間は0として定義され、タイムラプス画像が37˚℃に温度を維持するために、チャンバヒータを用いて6時間ごとに5分間、40倍空気NA 0.9の対物レンズを用いて取得した共焦点回転ディスク顕微鏡で撮影した初代心筋細胞におけるEGFP標識タンパク質の経時画像は補足作品1-2に示します。
温度平衡が十分ではなかったか、複数の収集モードが正しく機能していなかった、場合によっては撮影した画像は、xy平面補足動画1に移動可能性があります。適切にオートフォーカスシステムを操作する場合しかし、安定し、フォーカスを維持し、これは発生しませんでした。温度平衡が適切であり、興味のある唯一の領域が取得された補足動画2に示すように、撮像画像は、非常に高い品質のものである。
心筋細胞の拍動は、細胞生存率を確認するために長期の時間経過の生細胞イメージング後に評価した。タイムラプスイメージング、EGFPを発現する心筋細胞の16時間は、その機能特性を保持し、かつリズミカルに補足ムービー3を破った後でも。
レンチウイルスやアデノウイルス形質導入後のタンパク質発現の図1。確認。 G>（A）のCx43-WT-EGFPを発現している単離したラット新生児心筋細胞を3日間形質導入後のAd-FGFR1DNで形質導入。また、 補足動画1を参照してください。（B）の 3日間形質導入後のAd-FGFR1DNで形質導入Cx43-S325/328/330E（3SE）-EGFPを発現している単離したラット新生児心筋細胞。形質導入後、ICC 24時間で検出されたアデノウイルス形質導入後の補足ムービー2も参照してください。（C）タンパク質発現。形質導入後WB 24時間で検出されたアデノウイルス形質導入後FGFR1DNタンパク質のヘマグルチニン（HA）タンパク質タグ化FGFR1DNは、従来のICCの方法を用いて、抗HA抗体により検出されたが、α-アクチニンは、心筋細胞のマーカーとして使用した。（D）発現。 HA-タグ化FGFR1DNはWBにより、抗HA抗体により検出した、β-チューブリンはローディング対照として使用した。
単離されたラット新生児の車の補足動画1。タイムラプスイメージングのAd-FGFR1DNで形質導入のCx43-WT-EGFPを発現しているdiomyocytesは。タイムラプス画像は、共焦点回転するディスク顕微鏡で6時間、5分毎に40倍の対物レンズを用いて取得された。取得した画像を毎秒10フレームでムービーとして再生されました。この映画は、桜井ら 32から変更されている。 動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足ムービー2。のAd-FGFR1DNで形質導入Cx43-S325/328/330E-EGFPを表現する単離されたラット新生児心筋細胞のタイムラプスイメージング。タイムラプス画像は、共焦点で6時間ごとに5分40倍の対物レンズを用いて取得されたディスク顕微鏡スピニング。取得した画像を毎秒10フレームでムービーとして再生されました。この映画は、桜井ら 32から変更されている。「ターゲットは= "_blank">この番組をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
単離されたラット新生児心筋細胞の補足作品3。タイムラプスイメージングは、実際の速度で再生。のAd-FGFR1DNで形質導入のCx43-EGFPを発現している単離されたラット新生児心筋細胞のタイムラプス画像は10ごとに200ミリ40倍の対物レンズを用いて取得されたタイムラプス取得の16時間後の共焦点回転するディスク顕微鏡秒。取得された画像は、実際の速度で毎秒5フレームでムービーとして再生された動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
新生児ラットから単離された初代心筋細胞は、長いin vitroで心筋細胞の機能を研究するために使用されてきた。このプロトコルは、第4℃でトリプシンO / Nで消化し、次いで精製されたコラゲナーゼ、二段階の酵素消化法を用いて、仔ラットから新生児の心筋細胞を単離するための方法が記載されている。精製されたコラゲナーゼ工程を用いる利点の一つは、酵素の同じグレードの全ての単離のために使用されることである。このように、単離された細胞の品質と量は実験から実験と一致している。
細胞培養物の形質導入の高い効率は、所定の実験が必要である場合には、アデノウイルスに関連したより高い形質導入効率を考えると、アデノウイルスを使用することをお勧めします。高レベルの形質導入が不要な場合は、レンチウイルスベクターを使用することができる。アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターのいずれかを使用するオプションを持つことが容易適切なtransdを達成することを可能にする遺伝子の異なるタイプのはじめ発現レベル。共焦点スピニングディスク顕微鏡またはICCを用いて生細胞イメージングにより検出された蛍光強度は、レンチウイルス形質導入後の非常に低い場合、目的の遺伝子を発現させるために、異なるプロモーターを使用する別のレンチウイルス導入ベクターを使用してこの問題を解決することができる。 WBによって検出されたバンドは、アデノウイルス形質導入後のわずかである場合、アデノウイルスベクターを用いて、これが低力価のウイルスストックを示すことができる。その場合には、先に進む前に細胞内での増殖によってより高い力価のアデノウイルス溶液を調製することをお勧めします。
この技術の1つの制限は、単離された生存可能な心筋細胞の収率が精製されたコラゲナーゼを用いても、実験する実験からの非常に一貫性がないことである。再現性のイメージング実験を行うためには、ステップ1.2.13での上清中の孤立した心筋細胞を選択した後に生存細胞をカウントすることをお勧めします。プロトコルセクションにある。その後、SE様々な希釈率でガラスボトムディッシュ上で心筋細胞を編細胞が添付したら、計画された実験のための適切な細胞濃度で料理を選択します。
新生児の心筋細胞を使用することの多くの利点があるが、いくつかの欠点もある。主な欠点は、成人の心筋細胞からの明確な違いである。完全に分化した成人の心筋細胞は棒状であり、孤立した新生児の初代心筋細胞は、全ての方向36に広がるのに対し、孤立した大人の初代心筋細胞は、その棒状の形態を維持。孤立し、成人および新生児の心筋細胞間の表現型の違いは、遺伝子発現の37の彼らのパターンに反映されます。したがって、分化した心筋細胞が必要とされる実験のために、成人の心筋細胞の単離のためのプロトコルは、4が必要であろう。
組換えのアデノウイルスやレンチウイルス形質導入を採用共焦点回転するディスク顕微鏡と組み合わせて、初代ラット新生児の心筋細胞へのタンパク質は、私たちは、培養生きた初代細胞内のタンパク質の機能を解析することができます。細胞内に目的の遺伝子を導入するために、トランスフェクションを利用する既存の方法に対して、このプロトコルの重要な利点は、アデノウイルスおよびレンチウイルスが非常に効率的にほぼ全ての細胞における目的の遺伝子の発現をもたらす細胞に取り込まれることである文化。さらに、遺伝子発現のためのウイルスの二つの異なるタイプの使用は、簡単に複数の遺伝子のための適切な伝達率および発現レベルを達成することができる。 siRNAは、化学的アゴニストおよびアンタゴニストはさらに遺伝子およびそれらがコードするタンパク質の機能を撹乱し、分析するために、このシステムでも使用することができる。
心の準備は、プロトコルで非常に重要なステップです。可能な限り迅速に、身体から心を取り除きます。に確認してください細胞の生存率を高く保つためにすぐに氷上にそれらを置く。もう一つの重要なステップは、高品質、力価、レンチウイルス/アデノウイルス株の製造である。質の悪いウイルスストックが使用される場合、目的の遺伝子の形質導入および発現レベルが低くなる。したがって、それらは、イメージング研究には適していない。
この技術の重要な将来のアプリケーションでは、マウスの心筋細胞での「使用されます。この方法は、マウス新生児心筋細胞の単離のために使用することができるかどうかをパイロット研究試験は有望な結果が得られている。によるラットのものと比較してマウス心臓の比較的小さなサイズのために、より少ない組織が最初に得られる。従って、より少ない細胞は、動物の同じ数を使用して、単一の手順で単離されているが、単に単離のためのより多くのマウスを用いて、この障害物を排除すべきである。マウス心筋細胞を単離する能力は、研究者が遺伝的に修飾されたm個から単離された細胞の機能を調べることを可能にする氷（トランスジェニック、ノックアウト、ノックイン）目的の遺伝子の特定の形態を研究するために製造されている。
心臓血管研究の主要な障害の1つは、リアルタイムでインビボで心臓組織において発現所定の遺伝子の発現および機能を調べることに伴う困難であった。しかしながら、機能的な拍動心筋細胞を単離ウイルス形質導入を用いて細胞機能を調節し、その後、共焦点スピニングディスク顕微鏡を用いてリアルタイムでそれらを研究する能力は、 インビボでの心筋細胞の役割を解明し、このギャップを埋めるのに役立つ。この方法は、細胞レベルで心筋細胞の機能を理解するための簡略化されたシステムを提供しています。これは、遺伝子発現の摂動が心筋細胞の機能を変化させる方法のリアルタイム分析を可能にする。心筋細胞の生細胞イメージングは、心筋細胞の機能へのさらなる洞察を提供します。このような洞察力は、基本的なcardiovasculaの進歩につながる心臓血管疾患の治療のための新規な治療法をもたらすr個の研究。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Scissors for decapitation | WPI | 501749 | Autoclave before use |
| 1 Fine scissors for heart isolation and chopping | WPI | 14393 | Autoclave before use |
| 2 Fine forceps (Dumont No. 5) | Sigma | F6521 | Autoclave before use |
| 3 Sterilized 10 cm plastic dishes | Sigma | CLS430165 | For heart isolation |
| 3.5 cm Glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C | For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative. |
| 3.5 cm Glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0.17-14-C | For TIRF or high resolution image |
| Ethanol solution, 70% (v/v) in water | Sigma | E7148 | |
| 2% Gelatin | Sigma | G1393 | |
| 1 Sterilized 10 cm plastic dish | Sigma | CLS430165 | For trypsinization |
| Aluminium foil | Any brand | ||
| Parafilm | Sigma | P7543 | |
| Two 10 cm plastic cell culture dish | Sigma | CLS430165 | For selection |
| Autopipette | Drummond Scientific | 4-000-300 | For trituration |
| Cell counter | |||
| Cellometer, automated cell counter | nexcelom | To check and count cells | |
| Microscope and hematocytometer | Any brand | To check and count cells | |
| Trypan blue solution, 0.4% | invitrogen | 15250-061 | |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-19AIC | |
| Incubating orbital shaker | Sigma | Z673129 | To shake heart tissue with collagenase at 37 °C at 170-200 rpm |
| 10 mg/ml BrdU solution | BD Pharmingen | 550891 | |
| DMEM, high glucose | invitrogen | 41965039 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| MEM | invitrogen | 31095029 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| Fetal bovine serum | invitrogen | 26140079 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | invitrogen | 15140-122 | |
| Section 2 Lentiviral transduction | |||
| 3 Packaging plasmids | |||
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
| Opti-MEM (serum-free medium) | invitrogen | 31985070 | |
| Transfection reagent | |||
| polyethyleneimine“Max”, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) | Polysciences | 24765-2 | It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | substitute for PEI as transfection reagent |
| Chloroquine | Sigma | C6628 | Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine. |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 10 ml Luer-Lok syringe, sterilized | BD | 309604 | |
| 0.45 μm filters | Sigma | F8677 | Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus. |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize. |
| Polyethylene glycol 6,000 | Sigma | 81260 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Section 3 Adenoviral transduction | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Some 10 cm cell culture dishes | Sigma | CLS430165 | |
| 96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile | BD Falcon | 353072 | For titration |
| Multichannel pipette, 10-100 μl, 8-channel | eppendorf | 3122 000.035 | |
| Section 4 Live cell imaging | |||
| Spinning disk confocal microspopy | PerkinElmer | L7267000 | |
| A temperature-controlled chamber | Any brand | To keep temperature at 37 °C | |
| A CO2 environmental system | Any brand | Optional to maintain CO2 concentration optimal | |
| CO2 Independent medium, no glutamine | invitrogen | 18045-054 | For long time time-lapse imaging |
| DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red | invitrogen | 21063-029 | For long time time-lapse imaging |
