Summary
この研究は、単一分子蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて二本鎖DNAのループダイナミクスを測定するための詳細な実験手順を提示する。プロトコルは、Jファクターと呼ばれるループする確率密度を抽出する方法を説明します。
Abstract
二本鎖DNA（dsDNA）の屈曲は、ヌクレオソーム内に、例えばDNA-タンパク質認識およびDNAのパッケージングのような多くの重要な生物学的プロセスに関連している。二本鎖DNAの曲げの熱力学は、共有結合dsDNAの短い付着末端を結合するDNAリガーゼに依存している環化と呼ばれる方法で研究されている。しかし、ライゲーション効率は、そのような接合粘着末端を取り囲むDNA構造としてループdsDNAに関係のない多くの要因によって影響され得る、およびリガーゼはまた、非特異的結合の機構を通じて明らかなループ速度に影響を与えることができる。ここでは、FRET（蛍光共鳴エネルギー移動）による一過性DNAループの形成を検出することによってリガーゼなしでのdsDNAのループ速度を測定する方法を示している。二本鎖DNA分子は、FRET対とビオチンリンカーを有する単純なPCRベースのプロトコルを使用して構築される。 J因子として知られているループする確率密度は2 disconnec間をループレートとアニール速度から抽出されるテッド粘着末端。異なる固有の曲率を有する2つのdsDNAsを試験することによって、我々は、J因子はdsDNAの固有の形状に敏感であることを示している。
Introduction
dsDNAの機械的性質を理解することは、基礎科学や工学アプリケーションで基本的に重要である。連続した塩基対間のロール、チルト、およびねじれ角がシーケンスで変化することができるので、二本鎖DNAの構造はストレートヘリカル梯子よりも複雑です。熱揺らぎは、二本鎖DNAは、曲げねじれやストレッチングなどの立体配座の変動の多様なモードを受ける可能性があります。このような溶融やねじれなどの遷移はまた、極端な条件で発生する可能性があります。
これらの動きの中では、二本鎖DNA曲がりが最も顕著な生物学的影響は1を持っています。二本鎖DNAの曲がりは互いに近接2遠隔部位にすることによって遺伝子抑制または活性化に関連している。それはまた、細胞核又はウイルスキャプシドの内側DNAパッケージングにおいて重要な役割を果たしている。 dsDNAの曲げ変形は、高解像度顕微鏡（AFM及びTEM 2 3）、およびthermodynにより実験的に可視化することができるamics及び動力学は、化学的にdsDNAの並置部位をリンクループアッセイによって研究することができる。
1つのそのようなアッセイはリガーゼ依存環化4である。このアッセイでは、「スティッキー」（凝集）末端を有する二本鎖DNA分子は、DNAリガーゼにより環状又は二量体化される。サークル及び二量体形成の速度を比較することによって、J因子として知られている他端の近傍のDNAの一端の有効モル濃度を得ることができる。このJ係数は、他端から短い距離でDNAの一端を見出す確率密度と寸法的に等価であり、したがって、DNAの柔軟性を反映する。 DNAの長さの関数としてのJ係数を測定することは持続長4,5含むDNA力学に関する多くの特性を明らかにする。
ワームのようなチェーン（WLC）のモデルが広くexplaでの成功に基づいて二本鎖DNA力学の正規ポリマーモデルと見なされてきた力伸長曲線ining実験6を引いたDNAで得られ、かつ正確に、より長い200塩基対7よりdsDNAsのJ要因を予測する。しかし、100bpのできるだけ短い二本鎖DNA分子上の環化アッセイを用いて、クルーティエとWidomは、WLCのモデル予測8よりも桁違いに高くなるようにJ因子を測定した。一年後、ドゥら 。リガーゼの低い濃度で環化アッセイを使用してWLCモデルと一致J因子を生産し、Widomグループから9リガーゼを使用する高濃度に異常な結果に起因。従来のアッセイ9を使用する場合、この論争が環化速度に及ぼすDNAリガーゼの不可避の影響を例示する。また、DNAリガーゼはまた、非特異的な結合10,11を介してDNA構造および剛性に影響を与えることができる。
タンパク質依存ループアッセイの技術的な問題を解消するために、我々は最近、PROTが実証蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）12に基づいてEINのないループアッセイ。この方法では、ループのコンフォメーションは、DNA分子の付着末端付近に取り付けられたドナーとアクセプターの間のFRETにより検出される。対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）は、可逆ループと、長期間にわたって表面固定単一DNA分子からunloopingイベントの軌跡を記録するために使用される。この方法は、Vafabakhshとハ13による同様の方法上の重要な改良で、ミスマッチのないDNA分子を生成するために、DNA分子のPCRベースのアセンブリを提供しています。このプロトコルの単一分子の態様は、FRETの態様であってもリガーゼ活性を損なう可能な条件では、1つは、同じ分子から繰り返しDNAのループダイナミクスを測定することを可能にしながら平均をアンサンブルに加えて分布の測定を可能にする。
TIRFMのセットアップを図1に示す。カスタム設計された試料ステージは、オリンパスIX61顕微鏡本体上に配置される。 532 nmおよび640 nmのレーザーは、側面から導入され、カバーガラス-水界面における臨界入射角を達成するために、高NA対物レンズ内に微小な楕円鏡14で反射される。私たちは、より広範なダイクロイックミラーやプリズムベースのTIR設定を行うスルー客観TIRもこのFRET用途に使用できることに注意してください。顕微鏡によって形成された蛍光像は、ダイクロイックミラーによりドナーとアクセプターのイメージに分割される。そして、彼らはEMCCDの両半分に再度結像される。追加のロングパス放出フィルタは、バックグラウンドシグナルを減少させるために使用される。
温度制御は、再現性の速度論的データを取得するために不可欠である。温度制御のために、目的は、熱伝達を最小にするために、顕微鏡本体のノーズピースから分離され、温度制御された冷却器/加熱器からの水が密に嵌真鍮カラーを通って循環される客観的なジャケットの下にあるインテリア金属の周り。このセットアップでは、15〜50°C（ 図2）との間のカバーガラス表面に強固な温度制御を達成することができる。本研究では、試料温度を24℃に維持した。
以下のプロトコルは、DNAの構築、DNA形状の推定、単一分子実験、およびJ要因判定するためのステップバイステップ手順を提示する。
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Protocol
1。二本鎖DNAサンプル調製
- デザインは、全体的に10マー配列を繰り返すことによりDNAを湾曲。例えば、5'-GTGCCAGCAACAGATAGC - （TTTATCATCCTTTATCATCC X）7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'は、Xがランダム余分な塩基であり、繰り返し10量体配列に隣接する配列は、アダプター配列で186 bpの湾曲したDNAである。
注：カプランらによる大規模なヌクレオソーム占有研究に基づいてヌクレオソームの形成とは逆の好みにこの例では、2つの10量体15が選ばれた。二本鎖DNAの螺旋の繰り返しが10塩基対に近いので、10 -マーの螺旋軸のいずれかの正味たわみは円弧（ 図3A）のような形状を生成するために蓄積されます。ヘリカル期間は10.5 BPに近いので、余分な塩基が可能な平面として湾曲した構造を維持するために、すべての2の繰り返しの後に挿入されます。 200 BPより短いこれらの配列は、companieのから注文することができます遺伝子合成サービスを提供していますS。これは、後続のステップのための共通のアダプター配列をこれらの配列に隣接するのが便利である。手順を図3Bに図式化されている。 - プライマー1（GTGCCAGCAACAGATAGC）及びプライマー2（/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG）を用いてPCRを行う。 NOTE：プライマー2は、その5 '末端にFRETドナーCy3で標識される。典型的なPCRレシピやサイクリングプロトコルは、 表1および表2に示す。
- プライマー3（/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC）及びプライマー4（CAACAACGAGCTCGAATG）を用いてPCRを行う。 NOTE：プライマー3を5 '末端に骨格とビオチン - リンカーを介してFRETアクセプターCy5で標識される。 PCRのレシピ、サイクリングプロトコルは、上記の通りである。
- PCRクリーンアップキットを用いてPCR産物を精製する。
- 0.4＆最終濃度鎖交換用緩衝液（100mMのNaCl、10mMのトリス-HCl、pH7.0、1mMのEDTA）中のCy3標識産物およびCy5標識生成物を混合しそれぞれMと0.1μM;＃181。注：過剰のCy3-DNAは、鎖交換の結果として、Cy3およびCy5の両方を運ぶ二重鎖の濃度が増加します。
- 徐々に5まで冷却し、2分間98.5℃でインキュベートすることにより為替ストランド ランプ0.1°C /秒の速度、および5でのインキュベーションと°C 2時間Cと°。
2。ゲル電気泳動は、二本鎖DNAの曲率を検出するための
- 29.2:0.8の割合でアクリルアミドとビスアクリルアミドの溶液を混合することによりポリアクリルアミドゲル16,17を注ぎ、5％（w / v）のpH8.0の1Xトリス/ボレート/ EDTA（TBE）緩衝液中。注：ゲル溶液10mlを含有する：1.217ミリリットルの40％アクリルアミド、0.667ミリリットルの2％ビス-アクリルアミドを1ml TBE 10Xを、100 Lの過硫酸アンモニウム（APS）10％、10 L TEMED、残りはをdH 2 Oである。ゲルの全固体化には約30分かかります。
- DNA試料および1Xローディング緩衝液中のDNAラダー（5％グリセロール、0.03％（w / v）のブロモフェノールblを用いてポリアクリルアミドゲルをロードするUE）と45分間、又は染料前線がゲルの端に近づくまで4℃で5-8 V / cmとゲルを実行する。
- 30分間、0.5μg/ mlの臭化エチジウムを含有する1X TBE緩衝液を用いてゲルを染色する。 UV照射下でDNAバンドを識別します。 DNA分子の見かけの大きさを計算するためにサイズマーカー（100 bpのDNAラダー）を用いてバンドの位置を比較する。注：湾曲したDNAは、ほぼ直線状のDNAよりも遅く移動する。
3。細胞調製フロー
- ドリルドリルプレス、ダイヤモンドドリルビットを用いてガラススライドの二つの対向するエッジ（3×1''''）に沿った正孔の対6-7。掘削した後、目に見えるガラス粉末を除去するために水を流すことでスライドをこする。 NOTE：穴は、灌流入口及び出口として機能する。掘削時には、水でスライドを冷却して割れを防ぐことが重要です。
- ガラスジャーに直立スライドを置き、水でそれを埋める。 15分間超音波処理し、別のガラスジャードにそれらを転送アセトン洗浄にdicated。 15分間のアセトンと超音波処理でそれを埋める。スプレーボトルを使用してエタノールでスライドを洗い流してから水と。 、ポリプロピレンジャーに配置し、5Mの水酸化カリウムとそれを記入し、15分間超音波処理。最後に、15分間水中でスライドを超音波処理する。同じプロトコルを使用してカバーグラス（1号、24×40 mm）を清掃してください。 NOTE：クリーンスライドとカバースリップは、長期間の使用のためのdH 2 Oに保存することができる。
- 0.1 M重炭酸ナトリウム溶液の340 LでのmPEG-シラン（MW 2000）の80 mgのビオチン-PEG-シラン（MW 3400）1mgを混合する。よく混ぜ、気泡を取り除くために簡単に混合し遠心する。注：ポリエチレングリコール（PEG）で表面の機能化は、表面へのDNAの非特異的結合を減らすことができます。
- 各スライド上のPEG溶液80 Lを入れて、ゆっくりとその上にカバースリップを下げる。 45分間待ちます。 、ピンセットでスライドからカバーガラスを分離するのdH 2 Oを多量のでそれらを洗い流しとletトンオープンエアでの裾ドライ。
- チャネルを形成するスライド全体に両面テープの薄いストリップを配置します。その上にカバーガラスを合わせ、しっかりと液密チャネルを形成するスライドに対してカバースリップを押してください。チャンネルのエッジをシールするために5分エポキシを使用してください。
4。トロロックス溶液の調製を
- フラスコの中で〜30mgのトロロックスと10ミリリットルのdH 2 Oを入れて、18時間オープンエアでソリューションを攪拌し、マグネット攪拌棒を使用しています。
- 0.2μmのフィルターを用いて溶液を濾過し、1Mトリス塩基（pHが11）の〜6μLを加えることによりpHを7に調整。注意：トロロックスは、単一分子は18の研究で一般的に使用されている抗点滅試薬である。トロロックスの褪色防止作用は、部分的に分解ロックス液19中に存在し、その酸化誘導体から来ている。すぐにメタノールや高pH Tris溶液中トロロックスを溶解しているため、非効率的酸化のは避けるべきである。
5。シングルモルeculeイメージング
- チャンネルにニュートラ溶液（0.5 mg / ml）を15μlのを注入し、T50緩衝液100μl（10mMトリス-HCl、50mMのNaCl、pH7.0）でリンスする前に、2分間待ちます。
- チャネルにDNAサンプル（50〜PM）の50μLを注入。 5分間待ってから、T50バッファの100リットルで、未結合するDNAを洗い流す。 NOTE：DNA分子が特異的にニュートラアビジン - ビオチン相互作用を介して表面に結合する。
- 酸素除去システム20（100 mMのPCD、5 mMのPCA、1 mMのトロロックス、および500のNaCl）が含まれているイメージングバッファーでチャンネルを入力します。
- 毎秒25フレームの速度でパソコンに2×2ビニングされた画像（256×256）をストリーミングするために、フレーム転送モードでEMCCDを設定します。
- 顕微鏡対物レンズにイマージョンオイルを入れて、試験片のクリップを使用して、顕微鏡ステージ上でフローセルを修正。壁にレーザー反射パターンを見ることで、フォーカスを粗調整します。蛍光IMのライブビューを使ってピントを微調整モニター上の年齢層。
- 上の532 nmのレーザーを使用してデータ収集を開始します。ライブビューを確認し、必要に応じてフォーカスを調整します。ほとんどの分子が退色している時にデータ収集を停止します。
注：この機能では、顕微鏡を制御し、これらはハードディスクに保存されるようにモニターにライブ映像を表示するためのラボが作成したCプログラムが使用されます。
6。画像処理とデータ解析
NOTE：256×256画像の時系列を、Cy3およびCy5強度の単一分子タイムトレースを生成するために、MATLABコードによって処理される。ドナーチャネルとスプリットビュー画像の受容チャネルとの間のピクセルを対にする、Cy3およびCy5スポットの6-7組、均等に視野に分散し、同じ分子からの各ペアは、アフィン変換を手動で拾い、アールアンカーポイントとしてこれらのスポットの座標を用いて計算される。
- MATLABスクリプトを使用して、すべての単一分子の時間に目を通すトンをトレース帽子は高低のFRETシグナルの間に複数の遷移を示しています。ループ状にループしない状態を識別します。
NOTE：FRET信号（I a）は、Cy3およびCy5強度（I dはI +）との和で割ったCy5の強度として定義される。ループしない状態が低いFRET値を有しながらループ状態が高いFRET値を有する。単一分子からのFRETシグナルのヒストグラムが二峰性のため、可逆ループしunlooping分散されている。 - 2フィットガウス曲線との交点を決定することにより、二つの分布を分離しきい値を検索します。
- FRET効率などを計算する
と高いFRET値と低いのFRET値がループしない状態でループ状態を割り当てます。 - MATLABスクリプトを使用して、分子（N（t））との累積数を分析することは、ループ（またはデータ収集の開始から異なる時間が経過においてFRETハイ状態）に達した。注：二本鎖DNA分子は、データ収集の開始時にループしない状態のいずれかのコンフォメーションで起動することができますので、ループの人口の増加率は平均ルーピング率は初期のコンフォメーションで平均化が反映されます。指数関数で、N（t）を当てはめることによって、ループ速度k ループを抽出します。
二相性が増加すると、二重指数関数を取り付けることができる。 
この場合、k個のループはから得られる。 
注：理論的には、ポリマーは時刻tにループしていないことを生存確率は、単一または二重の指数関数12ではありません。指数関数的なFITTING平均ループ時間を抽出するための実用的な手段として使用される。
と高いFRET値と低いのFRET値がループしない状態でループ状態を割り当てます。 
二相性が増加すると、二重指数関数を取り付けることができる。 
この場合、k個のループはから得られる。 
注：理論的には、ポリマーは時刻tにループしていないことを生存確率は、単一または二重の指数関数12ではありません。指数関数的なFITTING平均ループ時間を抽出するための実用的な手段として使用される。 7。、J係数を決定
NOTE：J係数はdsDNAの一端が他端の周囲にどのように濃縮表す。これは、測定された速度ループなどの他の端部セグメントと同じ反応速度を産生するDNAの一方の端部セグメントの濃度を補間することによって決定することができる。実験的には、一方の端部セグメントが表面上に固定され、他方の端部セグメントは、特定の濃度cで導入される。両端の測定されたアニール速度がk アニールである場合、J因子21は次式で与えられる。 
。アニール速度定数（k = kのアニールアニール / C）は、プローブ濃度とは無関係である。
- 30〜50 pMのビオチン-Cy5のオリゴの20μL（プライマー3）を流れ、IニュートラコートされたチャネルNTO。未結合のオリゴを洗い流すために、100μlのT50とのチャネルを洗浄します。
- 50nMの最終濃度のCy3オリゴ（プライマー2）を添加した部分5に記載のように撮像緩衝液を調製する。チャンネルにこの画像バッファフロー。
- 上の532 nmのレーザーを維持しながら、簡単に表面に結合したCy5のオリゴの位置を識別するために640 nmのレーザーをオンにします。 640 nmのレーザーをオフにして、FRETシグナルの監視を開始。
注：表面に結合したCy5のオリゴへのCy3オリゴのハイブリダイゼーションの際、Cy5の蛍光は、FRETから発生します。 - MATLABスクリプトを使用して、結合していない状態（低Cy5の強度）で起動が、後にCy5の強度トレースから時間の関数としてアニールした状態（高Cy5の強度）に変わる分子の数を分析する。
- アニールされた分子対時間のこの数をプロットします。 （単一指数関数でこの曲線にフィット
速度（k アニール ） を得た。 - アニール速度と反応物濃度との間の直線性を確認するために、さまざまなCy3のオリゴ濃度（60、100、および180 nm）のこの実験を繰り返します。二次アニール速度定数（k アニールを抽出する ）の傾きから。
- Jからの係数を計算する
k個のループは同じ緩衝液条件で測定ループレートである。
速度（k アニール ） を得た。 
k個のループは同じ緩衝液条件で測定ループレートである。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ループ試験のために使用されるDNA分子は、可変配列および長さと互いに相補的な一本鎖オーバーハングの二本鎖領域からなる。 7塩基の長さである突出部は、ループ状態をキャプチャするために互いにアニールすることができる。各オーバーハングはダイト化学によりDNA骨格にリンクされているのCy3またはCy5のいずれかが含まれます。 Cy5標識オーバーハングもまた、ビオチン-TEG 表面固定化のための（15原子テトラエチレングリコールスペーサー）（ 図4A参照 ）にリンクされている。全てのこれらの改変は、PCRベースのプロトコル（プロトコル1および図3B）は、以下の二本鎖DNAに組み込むことができる。オーバーハングの選択された長さおよび配列は、通常の実験条件で検出可能でかつ可逆的なFRETイベントを生成するために適しています。 DNAループのループとunlooping動態は、周囲温度に敏感であり、したがって、温度コントローラは、再現性のために必須である。このようなコントロLLERは、容易に顕微鏡（ 図2）に組み込むことができる。
TIRFMを使用して、Cy3標識（ドナー）及びCy5表面固定のdsDNA分子から（アクセプター）シグナルが観察された（ 図4B）の変動を反相関。ループ状態では、2つの色素間の距離は、高いFRET効率（ 図4Aおよび4C）に高いCy5シグナルと低いCy3シグナルをもたらすであろう、これは5nm未満である。いくつかの対照実験は、高いFRET状態がループした状態を表していることを証明するために行った。 FRETハイ状態の寿命は、高いFRET状態二つのオーバーハングの間の塩基対形成によって安定化されていることを示唆して増加オーバーハングの長さと共に増加した。 FRETハイ状態の寿命は、ループ12が小さくなると、ループの自由エネルギーが増加するため、予想されるDNAの長さを減少すると共に減少した。この証拠、ハイとローのFRET STAに基づくTESは、それぞれループ状にループしない状態に割り当てることができます。
ルーピング上の二本鎖DNAの固有の曲率の効果をテストするには、曲率の異なる2 186 bpのdsDNAsは 'ストレート'（S-DNA）の名前が付けられており、構築し、それらの曲率に基づい「湾曲した」（C-DNA）。繰り返し10マー配列は、S-DNAのためのC-DNAおよびTGACAGCAACためTTTATCATCCです。これらdsDNAsの各々の全体的な曲率を曲率のdsDNA 16,22を推定するために最も広く使用されている方法である、PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により確認した。 図5は、S-DNAは、同じサイズのDNAと同様に実行されることを示しているDNAラダーで（レーン1および図5のレーン2と比較されたい）。一方、C-DNAは、DNAラダーとなる相手と比較して、より大きな見かけの大きさを示している（〜その実際のサイズよりも大きい1.2は、レーン1およびレーン3を参照）。この観察は、C-DNAが大きい固有の立方を有することを示すS-DNAよりrvature。
図6は、C-DNA（図6A）とそれに対応するFRETトレース（ 図6B）からの代表の蛍光時間トレースを示しています。 S-DNA（ 図4Bおよび4C）と比較すると、C-DNAは、同じ期間中に、より高いFRETイベントを生成します。 C-DNAは、同じ取得時間中に、S-DNA（ 図7）よりも頻繁に4回ループします。この結果は、DNAの固有の曲率が著しく力学ループ影響し得ることを実証する。
ループ率からJ因子を抽出するために、ある2つの切断されたオーバーハングとの間のハイブリダイゼーションのための濃度に依存しない二次速度定数を測定する必要がある。このような測定の実現は、図8Aに示されている。固定化されたCy5のオリゴへのCy3オリゴのハイブリダイゼーションは、FRETによるCy5の強度バーストを生成します。複数のMEAから異なるのCy3-オリゴ濃度のsurements（ 図8Bを参照）、1は統計的に堅牢な方法で抽出することができます。我々の実験では、500mMのNaClにおける2つのオリゴ間のアニーリング速度定数は、0.45±0.04×10 6 M -1秒-1であると決定された。 J係数は、二次焼鈍速度定数（k ' アニール ）によってループ速度（k ループ ）で割ることによって計算した。これは、C-DNAのためのS-DNAおよび265±48nmのための61±3であった。 S-DNA（ 図9）のJファクターは、同様の長さが7時前の測定値とよく一致する。
図1。目的型TIRFM。A）の励起光学系。 532 nmおよび640 nmのレーザーはsimilに別々にコリメートされるarの直径は、ダイクロイックミラーで同じパスにマージされ、対物背面開口の下に配置された小さな楕円鏡上に集光。これは、色収差を最小限に抑えるために集束するための色消しレンズを使用することが重要である。B）顕微鏡光学系。小型のミラーの横方向の位置は、最小の蛍光発光を阻止しながら、対物レンズを介してレーザビームを反射することができるように微調整しなければならない。そのため、小型のトランスレーションステージにマウントする必要があります。反対側に別のミラーが検出光学系に入るのを防ぐために、出力レーザを反映している。顕微鏡本体外側の像平面に、調節可能なスリットは、CCDの検出領域の半分の大きさに画像をトリミングするために配置されている。蛍光発光は、2つのチャンネルにダイクロイックミラーによって分割され、リレーレンズは、1:1の倍率でCCD上に第2の画像を形成する。反射ミラーの一つは、わずかにドナーを相殺するために回転されるとアクセプターの画像。バンドパスとロングパスフィルターは、それぞれ、ドナーとアクセプターのチャネルのバックグラウンドを低減するために使用されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。単一分子実験のための温度制御。設定温度（T S）は、水チラー/ヒーターの読みである。実際の温度（T aは ）顕微鏡カバースリップの上部表面に接触する熱電対によって測定される。実際の温度対 6の異なる設定温度（黒い四角）のプロットは、優れた直線性を（緑の破線）を示しています。コントローラのロバスト性は、後の回（浦和レッズ）で行われたランダムな測定によって示されている。挿入図は、温度係数の写真です彼らの最終的な組立単位と目的をntrolling。赤い線は、統一の傾きを表しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。のDNAデザイン。A）カーブのdsDNA。 10マーのdsDNAが、湾曲したチューブセグメント、破線のような2つの一本鎖として表される。任意の10-merのDNAのらせん軸が完全に直線ではなく、したがってそのような10マーの各々の連結が同一方向に螺旋軸の傾きの増分をもたらす。この効果は、平面、超らせん分子。B）dsDNAのPCRベースの準備を生成するのに悪用される可能性があります。一本鎖DNAは、水平線として示されている。それらの実際の曲率は、ここで示されていない。黒で中央セグメントは表し DNA断片のユニークな部分。この研究で使用されるすべてのDNAに共通するアダプター配列は薄い灰色で示されている。前面と背面のアダプタにプライマー1と4のアニールであった。プライマー2は、5 '末端をCy3で標識される。プライマー3は、5 '末端にビオチンタグと結合したCy5の内部を有する。プライマー2及び3の水色の領域は、粘着末端を機能相補的配列を含む。関心対象の配列を含むプラスミドまたはゲノムDNAのいずれか2つの別個のPCR反応においてテンプレートとして使用される。 Cy3標識二本鎖DNAは、プライマー1および2を用いて製造され、ビオチン化Cy5標識DNAを、プライマー3および4を使用して製造され、これら2つのPCR産物を加熱し、鎖交換のために一緒に冷却した。四つの異なるdsDNAsをCy3で、Cy5で、ビオチンが含まれているそのうちの一つだけが形成されている。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。実験スキーム。A）単一分子FRET実験。他方の片側およびCy5（赤色）上のCy3（緑色）で標識した二本鎖DNA分子は、PEG（ポリエチレングリコール）でコーティングされた表面上に固定化される。可逆ループしunlooping dsDNAs結果の高いFRETの（ループ）と低FRET（ループしない）状態であった。B）ドナーの代表的な単一分子リアルタイムトレース（緑）とアクセプター（赤）の蛍光強度。ハイとローのFRETの状態は、それぞれ、ループ状のループしない状態として識別されます。また、ループ速度を計算するために使用される第一のループ時間があることを示した。 （挿入図）ズームアップ図はCy3およびCy5強度の逆相関を示している。C）ドナーとアクセプターの強度から算出したFRET効率の時間トレースは、Bでトレースします。 図4Bは、と
図5。合成DNAのポリアクリルアミドゲル電気泳動 （29.2:0.8アクリルアミド/ビスアクリルアミド、TBE緩衝液中5％、pHは8.0）。左から右へ、レーンが1キロバイトマーカー、186 bpのストレートのDNAと186塩基対が含まれている湾曲DNA。この図は、部分的に許可を得て、以前の出版物12から適応されます。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図6に湾曲DNA（C-DNA）（A）およびその対応するFRETのトレース（B）からの代表的トレース。強度の比較S-DNA（ 図4Bおよび4C）お よびC-DNA（ 図6Aとの間のトレースをFRETおよび6B）を明確に湾曲したDNAは、より頻繁に、同じ緩衝液条件の直線DNAよりもループしていることを示しています。 （挿入図）は、ズームインの図は、Cy3およびCy5強度の逆相関を示しています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図7。直線と曲線のDNAの平均最初のループ回数。各tIMEは、5つの異なるフィールドの中で〜500の分子から抽出した。エラーバーは、3つの独立した実験から計算した平均の標準誤差（SEM）を表す。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図8のオリゴハイブリダイゼーションからアニール速度定数を決定する。アニール速度の測定A）概略図である。 Cy5標識プライマーは、表面上に固定化し、Cy3標識プライマーは50〜180 nmで存在する。 ）結合およびCy3プライマーのアンバインド50 nmで可逆的に発生し、挿入図に示されている検出可能なアクセプタバーストにつながる。Bアニール速度は、フリーのオリゴの濃度に直線的に依存している。線の傾きは、2次アニール速度定数（k ' を表すannea L）。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図9 nMで計算された直線と曲線のDNAのJ因子が 、J係数は2 measurablesに基づいて決定した。。。二本鎖DNAループで無料の補完的なオーバーハングのアニール速度定数のルーピング率拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください。
| コンポーネント | Volume/50μl反応 | 最終濃度 |
| 36μL | ||
| 5XのPhusionバッファ | 10μL | 1X |
| 10のdNTP | 1μL | 200μMの各 |
| フォワードプライマー（25μM） | 1μL | 0.5μM |
| リバースプライマー（25μM） | 1μL | 0.5μM |
| のPhusionホットスタートDNAポリメラーゼ（2 U /μL） | 0.5μL | 0.02 U /μL |
| テンプレートDNA | 0.5μL | 〜1 NG |
表1。PCR反応ミックス。プロトコルのPhusion DNAポリメラーゼのために最適化される。アイテムの順番で添加されるべきである。
| サイクルステップ | 温度 | 時間 | サイクル数 |
| 最初の変性 | "> 95℃30秒 | 1 | |
| 変性 | 95℃ | 5秒 | 30 |
| アニーリング | 60°C | 10秒 | |
| 延長 | 72℃ | 15秒/ KB | |
| 最終伸長 | 72℃ | 5分 | 1 |
| 4＆＃176、C | ホールド |
表2：PCRサイクリング命令。アニーリング温度は、プライマーの融解温度に基づいて決定される。伸長時間は、のPhusion DNAポリメラーゼのために最適化される。
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Discussion
FRETに基づく単純な単一分子アッセイは、異なる固有形状のDNAのループ動態を研究するために使用した。湾曲DNAは10.5塩基の螺旋周期と同位相で10マー配列を繰り返すことにより調製することができ、それらの曲率は、PAGEを用いて推定することができる。これらdsDNAs過渡ループの安定化を可能にするように粘着末端を有するように設計されている。私たちは、時間をかけてループされる分子の数が指数関数的に上昇にルーピング率を抽出した。切断された粘着末端セグメント間のアニーリング速度定数はJ因子として知られているループの確率密度の等価な濃度を決定するために使用される。
リガーゼベースのDNA環化アッセイでは、DNA閉鎖確率の測定は、リガーゼ濃度に敏感であり、リガーゼ9多すぎるJ係数が過大評価することができる。 DNAとDNAリガーゼの非特異的結合はまた、ループ10に影響を与えることができる。さらに、ligas電子活性は塩に依存し、時間の経過とともに減衰する。したがって、リガーゼ活性のための最適以下の条件でDNAのループを研究することは困難である。これとは対照的に、FRETに基づくループアッセイは、これらの懸念のすべてから自由である。
私たちの実験プロトコルは、議論に値する2の重要な側面を除いてVafabakhshとハ13の場合と同様である。 Vafabakhshとハ13は、いくつかの合成オリゴを連結することにより、その二本鎖DNA分子を構築した。オリゴヌクレオチド合成における当たりの誤差（挿入、欠失、または置換）速度は23（0.181パーセントfは）無視できる程度であるが、意図しないDNA配列の画分は、オリゴの長さと共に直線的に増加する。したがって、このプロトコルにより調製し100 bpの二重サンプルが高いループ率が24になることがあり〜最高33％不完全な二重鎖を含むことができます。比較では、我々のプロトコルは、DNAチェよりもはるかに高い忠実度を有する二本鎖DNA分子を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用しmosynthesis 25。製造業者のデータによると、我々が使用した高忠実度ポリメラーゼは、PCR増幅の30サイクル後に99.8％の確率で正しい100-bpのDNA分子を生成する。
2研究間のもう一つの重要な違いは、表面固定化スキームである。 Vafabakhshとハ13によってプロトコルにおいて、それらは内部ベースを介して結合されているのに対し、我々の研究において、DNA分子は、それらの端部を介して表面に取り付けられている。それは、一人で閉じ込め効果に基づいて、内部的にピン止めのdsDNAは5倍までより頻繁に無料で二本鎖DNAよりもループが、内部には26ピン止めの位置に応じてできることが予測された。 DNAの輪郭長の関数としてのJ率測定したがって、内部ピニングは、予期しない変動性を導入することができる。これは、リンカーを有する修飾された塩基は、より高いループ率をもたらすことができるより弱い塩基対形成能力を有することも可能である。しかし、despこれらの明らかな差異をITE、2つのプロトコルが100、BP（〜3 nMの対〜2 nm）における類似のJ個の因子を産生する。
このFRETに基づくルーピングアッセイは、DNAの効果は二本鎖DNAループ、および二本鎖DNAの柔軟性の温度依存性に結合タンパク質、27ループのdsDNAにニックまたはギャップは、ミスマッチの影響を含む二本鎖DNAループに関連した現象の広い範囲を研究するための可能性を秘めています。これらのトピックでは、従来のリガーゼベースの環化に対処することは困難である。 FRETベースのアッセイループはまた、ポリマーのモデルをテストするための標準的な関係である輪郭長対 J係数を測定するために使用することができる。しかし、我々はここで紹介するプロトコルは、100塩基対より短い二本鎖DNAのループを研究によく適していない。この長さの下に、二本鎖DNAループが極端に遅くなるので、測定された速度は、光退色などの他の意図しないプロセスによって影響を受ける。一つは、我々が見かけ上ループ速度を加速することができますING高塩濃度（[Na +を]> 500 mm）であるが、このような測定の生理学的関連性は疑問になる。したがって、100bpの下の長さスケールでの曲げdsDNAの調査は、環化をベースとするアッセイに直交するアプローチの恩恵を受ける。
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Disclosures
著者らは、利害の衝突を宣言していません。
Acknowledgments
私たちは、批判的に原稿を読み取るためのジェームズ·ウォーターズ、ゲーブルワズワースとボーブロードウォーターに感謝します。我々はまた、有益なコメントを提供するための4の匿名査読に感謝します。私たちは、ジョージア工科大学、科学的なインタフェースでバローズWellcomeの基金のキャリア賞、生物系のNSFの物理学の学生の研究ネットワークの助成金からの財政支援を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
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