Summary
Cette étude présente une procédure expérimentale détaillée pour mesurer la dynamique de boucle d'ADN double-brin en utilisant une seule molécule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Le protocole décrit également comment extraire la densité de probabilité boucle appelée facteur de J.
Abstract
La flexion de l'ADN double brin (ADNdb) est associée à de nombreux processus biologiques importants tels que la reconnaissance protéine-ADN et ADN emballage dans des nucléosomes. Thermodynamique de l'ADN double brin de flexion a été étudiée par une méthode dite de cyclisation qui repose sur l'ADN ligase pour joindre de manière covalente des extrémités cohésives courtes d'un ADN double brin. Cependant, l'efficacité de la ligature peut être affectée par de nombreux facteurs qui ne sont pas liés à ADN double brin boucle comme la structure de l'ADN entourant les extrémités collantes jointes, et ligase peut également affecter le taux de boucle apparente à travers des mécanismes tels que la liaison non spécifique. Ici, nous montrons comment mesurer dsADN cinétique de boucle sans ligase en détectant transitoire formation de boucle d'ADN par FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). les molécules d'ADNdb sont construites en utilisant un protocole simple basé sur la PCR avec une paire de FRET et une séquence de liaison à la biotine. La densité de probabilité de boucle connue comme le facteur J est extrait à partir de la vitesse en boucle et le taux d'hybridation entre deux déconnexionextrémités cohésives TED. En testant deux dsDNAs avec des courbures différentes intrinsèques, on montre que le facteur de J est sensible à la forme intrinsèque de l'ADN double brin.
Introduction
Comprendre les propriétés mécaniques des ADN double brin est d'une importance fondamentale dans les sciences fondamentales et les applications d'ingénierie. La structure de l'ADN bicaténaire est plus compliqué que d'une échelle hélicoïdale droite parce angles roulis, d'inclinaison et de torsion entre les paires de base successives peuvent varier en fonction de la séquence. Fluctuations thermiques peuvent provoquer des ADN double brin à subir divers modes de fluctuations conformationnelles telles que la flexion, de torsion et d'étirement. Transitions comme la fonte et de déformation peuvent également se produire dans des conditions extrêmes.
Parmi ces propositions, ADNds flexion a l'impact le plus notable biologique 1. ADNdb flexion est associée à la répression ou l'activation de gènes en amenant deux sites distants proches les uns des autres. Il joue également un rôle important dans l'emballage de l'ADN à l'intérieur du noyau de la cellule ou une capside virale. Déformation en flexion de l'ADN bicaténaire peut être visualisée expérimentalement par microscopie à haute résolution (AFM 2 et 3 TEM), et la ThermodynAmics et cinétique peuvent être étudiés par des analyses en boucle, qui relient des sites chimiquement juxtaposés de l'ADN double brin.
Un tel dosage est une ligase dépendante cyclisation 4. Dans ce dosage, les molécules ADN double brin avec des extrémités collantes "cohésives" () sont circularisées ou dimérisés par l'ADN ligase. En comparant les taux de cercle et la formation de dimère, on peut obtenir une concentration molaire efficace d'une extrémité de l'ADN dans le voisinage de l'autre extrémité, qui est connu comme le facteur de J. Ce facteur de J est dimensionnellement équivalente à la densité de probabilité de trouver une extrémité de l'ADN à une courte distance de l'autre extrémité, et reflète ainsi la flexibilité de l'ADN. Mesurer le facteur de J en fonction de la longueur de l'ADN révèle de nombreuses caractéristiques de la mécanique d'ADN dont la longueur de persistance 4,5.
La chaîne de ver (WLC) modèle a été largement considéré comme le modèle de polymère canonique pour la mécanique ADN double brin sur la base de son succès dans explicationining les courbes force-extension obtenus dans l'ADN tirant expériences 6 et prédire correctement les facteurs de J dsDNAs plus de 200 pb 7. Cependant, en utilisant l'essai de cyclisation de molécules d'ADNdb aussi courtes que 100 bp, et Cloutier Widom mesuré les facteurs J pour être de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que la prédiction du modèle WLC 8. Un an plus tard, Du et al. produite facteurs J en accord avec le modèle WLC en utilisant le test de cyclisation avec des concentrations plus faibles de ligase et attribué le résultat anormal dans le groupe Widom à des concentrations élevées ligase utilisé 9. Cette controverse illustre l'influence inévitable de l'ADN ligase sur la cinétique de cyclisation en utilisant le test classique 9. En outre, l'ADN ligase peut également affecter la structure de l'ADN et de la rigidité à travers non spécifique 10,11 liaison.
Pour éliminer les problèmes techniques de tests de bouclage protéine dépendante, nous avons récemment démontré une prottest de bouclage ein, à base de Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12. Dans ce procédé, des conformations en boucle sont détectées par FRET entre le donneur et l'accepteur attaché à proximité des extrémités cohésives d'une molécule d'ADN. Un total de microscope de fluorescence par réflexion interne du type à objectif (TIRFM) est utilisé pour enregistrer des trajectoires en boucle réversible et débouclage événements à partir de molécules d'ADN simple surface immobilisé pendant une période de temps prolongée. Cette méthode comporte l'assemblage de molécules d'ADN à base de PCR pour générer des molécules d'ADN libre mésappariement, ce qui est une amélioration cruciale sur une méthode similaire par Vafabakhsh Ha et 13. L'aspect unique molécule de ce protocole permet la mesure des distributions en plus de Ensemble moyennes tandis que l'aspect FRET permet de mesurer la dynamique de l'ADN de boucle à plusieurs reprises de la même molécule, même dans des conditions qui peuvent nuire à l'activité de ligase.
La configuration de TIRFM est illustré à la figure 1. Une coutumeStade-éprouvette conçu est placé sur un corps de microscope Olympus IX61. 532 nm et 640 nm lasers sont introduits à partir du côté et sont réfléchies par les miroirs elliptiques minuscules 14 dans l'objectif d'atteindre une grande NA angle d'incidence critique à l'interface lamelle couvre-objet dans l'eau. Nous notons que plus répandue TIR par-objectif en utilisant des miroirs dichroïques ou configurations de TIR sur la base de prisme peut également être utilisé pour cette application de FRET. L'image de fluorescence formée par le microscope est divisée en images de donneur et d'accepteur par un miroir dichroïque. Ils sont ensuite convertis à la sur les deux moitiés d'un EMCCD. Filtres d'émission passe-longue supplémentaires sont utilisés pour réduire le signal de fond.
Contrôle de la température est essentielle pour acquérir des données cinétiques reproductibles. Pour le contrôle de la température, l'objectif est séparée de la pièce de nez du corps de microscope pour minimiser le transfert de chaleur, et de l'eau à partir d'une température contrôlée refroidisseur / réchauffeur est mis en circulation par l'intermédiaire d'un collier en laiton qui s'adapte étroitement deautour du métal intérieur sous la veste objectif. Cette configuration est en mesure de réaliser robuste contrôle de la température à la surface de la lamelle couvre entre 15 et 50 ° C (Figure 2). Dans ce travail, la température de l'échantillon a été maintenue à 24 ° C.
Le protocole ci-dessous présente la procédure étape par étape pour la construction d'ADN, de l'estimation de la forme de l'ADN, molécule expérience unique, et la détermination du facteur J.
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Protocol
1. Préparation ADN double brin de l'échantillon
- Concevoir ADN courbes globalement en répétant une séquence de 10-mer. Par exemple 5'-GTGCCAGCAACAGATAGC, - (TTTATCATCCTTTATCATCC X) 7 - TTTCATTCGAGCTCGTTGTTG-3 'de l'ADN est une courbe de 186 bp, où X est une base aléatoire supplémentaire et la séquence flanquant la séquence 10-mère sont des séquences de répétition adaptateur.
REMARQUE:. Dans cet exemple, deux 10-mères ayant des préférences opposées à la formation nucléosome basé sur une grande échelle étude d'occupation nucléosome par Kaplan et al 15 ont été choisis. Depuis la répétition hélicoïdale de l'ADN bicaténaire est proche de 10 pb, toute déviation nette de l'axe hélicoïdal de la 10-mer s'accumule pour produire une forme d'arc de cercle (figure 3A). Etant donné que la période hélicoïdale est plus proche de 10,5 pb, une base supplémentaire est inséré après tous les deux répétitions de conserver la structure recourbée comme plane que possible. Ces séquences plus courtes de 200 pb peuvent être commandés auprès de companies qui offre gène service de synthèse. Il est commode pour flanquer ces séquences avec des séquences d'adaptation communes pour les étapes ultérieures. Le mode opératoire est schématisé sur la figure 3B. - Effectuer PCR avec l'amorce 1 (GTGCCAGCAACAGATAGC) et l'amorce 2 (/ 5Cy3/TAAATTCCTACAACAACGAGCTCGAATG). NOTE: Primer 2 est marqué avec le Cy3 donneur FRET à l'extrémité 5 '. Une recette typique de la PCR et le protocole de cyclage sont présentés dans les tableaux 1 et 2.
- Faire la PCR Primer 3 (/ 5BioTEG/GAAACATAG/iCy5/GAATTTACCGTGCCAGCAACAGATAGC) et l'amorce 4 (CAACAACGAGCTCGAATG). NOTE: Primer 3 est marqué avec l'accepteur Cy5 FRET à travers la colonne vertébrale et la biotine-segment de liaison à l'extrémité 5 '. Recette PCR et le protocole de cyclisme sont comme ci-dessus.
- Purifier les produits de la PCR en utilisant un kit de nettoyage de PCR.
- Mélanger le produit marqué au Cy3 et Cy5 le produit marqué dans un tampon pour l'échange de brin (100 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,0, 1 mM EDTA) à des concentrations finales de 0,4 et# 181; M et 0,1 uM, respectivement. NOTE: Le Cy3-ADN en excès augmente la concentration du duplex portant à la fois Cy3 et Cy5 en tant que résultat de l'échange de brin.
- brins de change par incubation à 98,5 ° C pendant 2 min, refroidissement progressif à 5 ° C avec un taux de 0,1 ° C / s de la rampe, et en incubant à 5 ° C pendant 2 heures.
2. Gel d'électrophorèse pour détecter ADN double brin courbure
- Verser le gel de polyacrylamide en mélangeant 16,17 acrylamide et de solutions de bis-acrylamide à un rapport 29.2:0.8, 5% (p / v) dans 1 x Tris / Borate / EDTA (TBE) tampon à pH 8,0. Note: 10 ml de solution de gel contient: 1.217 ml 40% d'acrylamide, 0,667 ml 2% de bis-acrylamide, 1 ml TBE 10X, 100 L persulfate d'ammonium (APS) 10%, 10 L TEMED, et le reste est dH 2 O. Solidification complète du gel prend environ 30 min.
- Charger le gel de polyacrylamide avec des échantillons d'ADN et de l'échelle d'ADN dans un tampon de charge 1X (5% de glycerol, 0,03% (p / v) de bromophénol blue) et exécuter le gel à 5-8 V / cm à 4 ° C pendant 45 min ou jusqu'à ce que le front de colorant se rapproche de l'extrémité du gel.
- Colorer le gel en utilisant un tampon TBE 1X contenant 0,5 g / ml de bromure d'éthidium pendant 30 min. Identifier les bandes d'ADN sous illumination UV. Comparer les positions des bandes avec le marqueur de taille (100 bp DNA ladder) pour calculer les tailles apparentes des molécules d'ADN. NOTE: Curved ADN se déplacent généralement plus lent que les ADN droites.
3. Préparation de débit cellulaire
- Percer 6-7 paires de trous le long de deux bords opposés d'une lame de verre (3'' x 1'') à l'aide d'une perceuse à colonne et des trépans de forage diamantés. Après le perçage, frotter la lame dans l'eau qui coule pour enlever la poudre de verre visible. REMARQUE: Les trous servent entrées et sorties perfusion. Pendant le forage, la lame de refroidissement à l'eau est importante pour empêcher la fissuration.
- Placer les lames en position verticale dans un bocal de verre et de le remplir avec de l'eau. Soniquer pendant 15 minutes et de les transférer dans un autre pot de verre dedicated pour le nettoyage à l'acétone. Remplissez-le avec de l'acétone et de traitement par ultrasons pendant 15 min. Rincer les lames avec de l'éthanol à l'aide d'un flacon pulvérisateur, puis avec de l'eau. Placez-les dans un bocal en polypropylène, le remplir avec 5 M d'hydroxyde de potassium, et de traitement par ultrasons pendant 15 min. Enfin, soniquer les diapositives dans l'eau pendant 15 min. Nettoyer les lamelles (n ° 1, 24 x 40 mm) en utilisant le même protocole. NOTE: diapositives et des lamelles nettoyés peuvent être stockés dans dH 2 O pour une utilisation à long terme.
- Mélanger 1 mg de biotine-PEG-silane (MW 3400) avec 80 mg de la norme MPEG-silane (MW 2000) dans 340 L de 0,1 solution de bicarbonate de sodium M. Bien mélanger et centrifuger le mélange brièvement pour se débarrasser de bulles. REMARQUE: La fonctionnalisation de la surface avec du polyéthylène glycol (PEG) permet de réduire la liaison non spécifique de l'ADN à la surface.
- Mettre 80 L de la solution de PEG à chaque lame et une lamelle couvre-objet abaisser doucement dessus. Attendez 45 min. Séparer la lamelle de la diapositive avec des pincettes, les rincer abondamment avec de l'dH 2 O et laisser tourlet sèche à l'air libre.
- Placez minces bandes de ruban adhésif double face sur la diapositive à former des canaux. Aligner une lamelle dessus et appuyez fermement sur la lamelle contre la glissière pour former des canaux étanches aux liquides. Utilisez cinq minutes époxy pour sceller les bords des canaux.
4. Préparation de Trolox Solution
- Mettez ~ 30 mg Trolox et 10 ml dH 2 O dans un ballon et utiliser une barre aimant d'agitation pour agiter la solution à l'air libre pendant 18 heures.
- Filtrer la solution à l'aide d'un filtre de 0,2 um et ajuster le pH à 7 par addition de ~ 6 pi de 1 M de base Tris (pH 11). Remarque: le Trolox est un réactif anti-clignotement qui est couramment utilisé dans une seule molécule études 18. L'action de antidécoloration de Trolox vient de son dérivé oxydé qui est présent dans la solution Trolox partiellement dégradé 19. À dissolution rapide Trolox dans le méthanol ou solution Tris pH élevé doit être évitée en raison de l'oxydation inefficace.
5. Single-molImagerie ecule
- Injecter 15 ul de solution de neutravidine (0,5 mg / ml) dans le canal et attendre pendant 2 minutes avant de rincer avec 100 ul de tampon T50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,0).
- Injecter 50 ul d'échantillon d'ADN (50 à 100 pM) dans le canal. Attendez 5 minutes et rincer l'ADN non lié à une distance de 100 L de tampon T50. NOTE: les molécules d'ADN vont se lier spécifiquement à la surface à travers l'interaction neutravidine-biotine.
- Remplir les puits avec le tampon de formation d'image qui contient un système de piégeage de l'oxygène 20 (100 mM PCD, PCA 5 mM, 1 mM de Trolox, et NaCl 500 mM).
- Réglez le EMCCD en mode de transfert de trame pour écouter 2 x 2 images regroupées par casiers (256 x 256) à l'ordinateur à 25 images par seconde.
- Mettre de l'huile d'immersion sur l'objectif du microscope, et fixer la cellule d'écoulement sur la platine du microscope en utilisant des clips spécimens. Gros la mise au point en regardant le motif de réflexion de laser sur le mur. Ajustez la mise au point avec l'affichage en direct de la fluorescence imans sur le moniteur.
- Commencer l'acquisition de données avec le laser 532 nm sur. Vérifiez l'affichage en direct et la mise au point si nécessaire. Arrêter l'acquisition des données lorsque la plupart des molécules ont Photo-blanchissement.
NOTE: Dans cette installation, un programme de laboratoire écrit C pour contrôler le microscope et afficher des images en direct sur l'écran quand ils sont enregistrés sur le disque dur est utilisé.
6. Traitement de l'image et l'analyse des données
REMARQUE: Une série de temps de 256 x 256 images sont traitées par un code MATLAB pour générer une seule molécule traces de temps de Cy3 et Cy5 intensités. Pour jumeler pixels entre le canal et le canal donneur accepteur de l'image split-vue, 6-7 paires de Cy3 et Cy5 taches, chaque paire de la même molécule uniformément dispersés dans le champ de vision, sont récoltés manuellement, et une transformation affine est calculée en utilisant les coordonnées de ces points en tant que points d'ancrage.
- Utilisation d'un script MATLAB, regarder à travers tous les temps seule molécule traces tchapeau montrent de multiples transitions entre les signaux faibles et élevées de FRET. Identifier les États boucle et non bouclé.
REMARQUE: Le signal de FRET est définie comme l'intensité Cy5 (I a) divisé par la somme des intensités Cy3 et Cy5 (I a + I d). État boucle a une valeur élevée de FRET en état non bouclé a une valeur faible de FRET. L'histogramme de signaux FRET partir d'une seule molécule est bimodale distribué en raison du bouclage et débouclage réversible. - Trouver le seuil qui sépare les deux distributions en déterminant l'intersection entre les deux courbes de Gauss de rangement.
- Calculer l'efficacité de FRET comme
et assigner les États en boucle avec des valeurs élevées de FRET et les Etats non tricotées avec de faibles valeurs de FRET. - Utilisation d'un script MATLAB, analyser le nombre cumulatif de molécules (N (t)) qui en boucle (ouatteint l'état haut FRET) à différents laps de temps depuis le début de l'acquisition de données. NOTE: Depuis une molécule ADN double brin peut commencer à n'importe quel conformation de l'état non bouclé au début de l'acquisition de données, le taux d'accroissement de la population en boucle reflète le taux moyen boucle moyenne sur conformations initiales. Extraire la boucle de vitesse k boucle en ajustant N (t) avec une fonction exponentielle:
Si l'augmentation biphasique, il peut être muni d'une double fonction exponentielle: 
Dans ce cas, k boucle est obtenu à partir: 
NOTE: En théorie, la probabilité de survie que d'un polymère n'a pas bouclé au temps t n'est pas une fonction exponentielle simple ou double 12. FITT exponentielleING est utilisé comme un moyen pratique d'extraire le temps de doublement moyen.
et assigner les États en boucle avec des valeurs élevées de FRET et les Etats non tricotées avec de faibles valeurs de FRET. 
Si l'augmentation biphasique, il peut être muni d'une double fonction exponentielle: 
Dans ce cas, k boucle est obtenu à partir: 
NOTE: En théorie, la probabilité de survie que d'un polymère n'a pas bouclé au temps t n'est pas une fonction exponentielle simple ou double 12. FITT exponentielleING est utilisé comme un moyen pratique d'extraire le temps de doublement moyen. 7. Détermination du facteur J
NOTE: Le facteur J représente la façon concentrée une extrémité d'un ADN double brin est de l'ordre de l'autre extrémité. Elle peut être déterminée par interpolation de la concentration d'un segment d'extrémité de l'ADN qui produirait la même vitesse de réaction avec l'autre segment d'extrémité comme mesuré le taux de bouclage. Expérimentalement, un segment d'extrémité est immobilisée sur la surface, et l'autre segment d'extrémité est introduit à une certaine concentration c. Si le taux de recuit mesurée entre les deux extrémités est recuit k, alors le facteur de J 21 est donnée par 
. La constante de vitesse de recuit (recuit k = k recuit / C) est indépendant de la concentration de la sonde.
- Débit 20 pi de 30-50 pM biotine-Cy5 oligo (Primer 3) into un canal neutravidine revêtu. Rincer le canal avec 100 pi de T50 à laver oligos non liés.
- Préparer le tampon de formation d'image tel que décrit dans la partie 5 avec l'addition d'oligo Cy3 (amorce 2) à une concentration finale de 50 nM. Couler ce tampon d'imagerie dans le canal.
- Tout en gardant le laser 532 nm, tournez brièvement le laser 640 nm à identifier les emplacements des oligos Cy5 liés à la surface. Éteignez le laser 640 nm et commencer à surveiller le signal de FRET.
REMARQUE: Lors de l'hybridation d'un oligo Cy3 à un Cy5 oligo lié à la surface, Cy5 fluorescence se posera de FRET. - Utilisation d'un script MATLAB, analyser le nombre de molécules qui commencent dans l'état non lié (faible intensité de Cy5), mais se transforment plus tard en l'état (haute intensité de Cy5) recuit en fonction du temps à partir des traces d'intensité Cy5.
- Tracer ce nombre de molécules en fonction du temps recuits. Monter cette courbe avec une fonction exponentielle simple (
(k recuit). - Répéter cette expérimentation à différentes concentrations Cy3 oligo (60, 100, et 180 nM) pour confirmer la linéarité entre le taux d'hybridation et la concentration des réactifs. Extraire la constante de vitesse de recuit de second ordre (k recuit ) À partir de la pente.
- Calculer le facteur de J de
, Où k est le taux boucle en boucle mesurée dans les mêmes conditions de tampon.
(k recuit). 
, Où k est le taux boucle en boucle mesurée dans les mêmes conditions de tampon. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
molécules d'ADN utilisées pour l'étude de bouclage sont constitués d'une région duplex de longueur et séquence variable et des surplombs simple brin qui sont complémentaires les unes aux autres. Les saillies, qui sont à base de temps 7, peuvent s'hybrider à l'autre pour capter l'état de boucle. Chaque surplomb contient soit Cy3 ou Cy5 qui est lié à l'ossature de l'ADN grâce à la chimie amidite. Le Cy5-faux est également lié à la biotine-TEG (15 atome Tetra-éthylène glycol entretoise) pour l'immobilisation de surface (voir la figure 4A). Toutes ces modifications peuvent être incorporées dans l'ADN double brin suivant un protocole à base de PCR (protocole n ° 1 et la figure 3B). La longueur choisie et la séquence des surplombs bien travailler pour produire des événements FRET détectables et réversibles dans des conditions expérimentales normales. Le bouclage et de débouclage de la cinétique de la boucle d'ADN sont sensibles à la température environnante, et par conséquent, un contrôleur de température est essentielle pour la reproductibilité. Une telle controller peut être facilement incorporé dans le microscope (Figure 2).
Utilisation TIRFM, les fluctuations des signaux provenant des molécules d'ADN double brin de surface immobilisé (accepteur) ont été observées (figure 4B) Cy3 (donateurs) et Cy5 anti-corrélés. Dans l'état de boucle, la distance entre deux colorants est inférieure à 5 nm, ce qui se traduirait par Cy5 signal de haute et basse de signal Cy3 en raison de l'efficacité de FRET haute (figures 4A et 4C). Plusieurs expériences de contrôle ont été réalisées pour prouver que l'état FRET haut représente l'état en boucle. La durée de vie de l'état de FRET élevé augmente avec la longueur de faux, ce qui suggère que l'état haut de FRET est stabilisé par appariement de bases entre les deux surplombs. La durée de vie de l'état de FRET haute a également diminué avec la diminution de la longueur de l'ADN, qui est prévu en raison de la boucle sans augmentation d'énergie que la boucle devient plus petit 12. Sur la base de ces éléments de preuve, la station haute et basse FRETtes peuvent être affectées à des états et non tricotées en boucle, respectivement.
Pour tester l'effet de la courbure intrinsèque d'ADN double brin sur une boucle, deux dsDNAs 186 pb avec des courbures différentes ont été construits, qui sont nommés (S-ADN) «droite» et (C-ADN) «courbée» sur la base de leur courbure. La séquence 10-mère est TTTATCATCC répétant pour le C-ADN et TGACAGCAAC de l'ADN de S. La courbure globale de chacun de ces dsDNAs a été vérifiée par PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide), qui est la méthode la plus utilisée pour estimer la courbure de l'ADN bicaténaire 16,22. Figure 5 montre que le S-ADN fonctionne de manière similaire à l'ADN de la même taille à l'échelle d'ADN (comparer les voies 1 et la piste 2 sur la figure 5). D'autre part, l'ADN-C montre une taille apparente plus grande par rapport à sa contrepartie dans l'échelle d'ADN (~ 1,2 plus grande que sa taille réelle, voir ligne 1 et ligne 3). Cette observation indique que le C-ADN possède une plus grande cu intrinsèquervature de l'ADN S.
La figure 6 montre une fluorescence représentant trace de temps à partir de l'extrémité C-ADN (Figure 6A) et la trace correspondant FRET (figure 6B). Par rapport à l'ADN S (figures 4B et 4C), l'ADN C produit plus d'événements haut de FRET au cours de la même période de temps; l'ADN-C boucles de quatre fois plus souvent que le S-ADN pendant le même temps d'acquisition (figure 7). Ce résultat démontre que la courbure intrinsèque de l'ADN peut affecter de manière significative la dynamique en boucle.
Pour extraire le facteur de J à partir de la vitesse en boucle, il est nécessaire de mesurer la constante de vitesse de deuxième ordre indépendante de la concentration pour l'hybridation entre les deux surplombs déconnectées. Une réalisation d'une telle mesure est représenté sur la figure 8A. L'hybridation de l'oligo Cy3 à la Cy5 oligo immobilisé produit Cy5 rafales d'intensité en raison de FRET. De mea multiplesurements avec différentes concentrations d'oligo-Cy3 (voir la figure 8B), on peut extraire d'une manière statistiquement robuste. Dans notre expérience, la constante de vitesse de recuit entre les deux oligos à 500 mM de NaCl a été déterminée comme étant de 0,45 ± 0,04 x 10 6 M -1 sec -1. Le facteur J a été calculé en divisant le taux de boucle (k de la boucle) par la constante de vitesse de recuit de deuxième ordre (k 'recuit). Il était de 61 ± 3 nM pour le S-ADN et 265 ± 48 nM pour l'ADN C. Le facteur de J de l'ADN S (figure 9) est en bon accord avec les mesures précédentes à la même longueur 7.
Figure 1. Type Objectif TIRFM. A) excitation optique. Les 532 nm et 640 nm lasers sont collimatés séparément à un autdiamètre de ar, fusionné dans la même voie par un miroir dichroïque, et focalisé sur un petit miroir elliptique placé sous l'ouverture dos objectif. Il est important d'utiliser une lentille de focalisation achromatique pour réduire au minimum l'aberration chromatique. B) optique de microscope. La position latérale du miroir miniature doit être ajustée finement de manière à pouvoir réfléchir le faisceau laser à travers l'objectif, tout en bloquant au minimum l'émission de fluorescence. Par conséquent, il doit être monté sur une petite platine de translation. Un autre miroir sur le côté opposé reflète le laser sortant pour l'empêcher de pénétrer dans le système optique de détection. Au plan de l'image à l'extérieur du corps du microscope, une fente réglable est placé pour recadrer l'image à la moitié de la taille de la zone de détection du capteur CCD. L'émission de fluorescence est divisé par un miroir dichroïque en deux canaux, et les lentilles relais former la seconde image sur le CCD à 01:01 grossissement. L'un des miroirs réfléchissants est légèrement tourné pour compenser le donneuret images accepteurs. Un passe-bande et un longpass filtres sont utilisés pour réduire le fond dans les canaux de donneur et accepteur, respectivement. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Contrôle de la température pour les expériences d'une seule molécule. La température de consigne (T s) est la lecture sur le refroidisseur d'eau / chauffage. La température réelle (T a) est mesurée par un thermocouple en contact de la surface supérieure de la lamelle couvre-objet sur le microscope. Le tracé des températures réelles contre six températures de consigne différentes (carrés noirs) donne une excellente linéarité (vert pointillés). La robustesse du contrôleur est représenté par des mesures aléatoires effectués à des temps ultérieurs (losanges rouges). L'encart est l'image de la coopération de la températureunité et l'objectif ntrolling dans leur assemblage final. La ligne rouge représente une pente de l'unité. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. L'ADN de conception. A) Courbe ADN double brin. Un ADN double brin 10-mère est représentée par un segment de tube incurvé, et les deux brins simples que les lignes en pointillés. L'axe d'hélice de tout ADN 10-mère n'est pas parfaitement droite, et donc chaque concaténation d'un tel 10-mère va conduire à l'inclinaison progressive de l'axe d'hélice dans la même direction. Cet effet peut être exploitée pour générer un plan, molécule superhélicoïdale. B) la préparation d'ADN double brin par PCR. ADN simple brin sont indiqués par une ligne horizontale. Leur courbure réelle n'est pas représenté ici. Le segment central en noir représente l' une partie unique du fragment d'ADN. Affichés en gris clair sont les séquences d'adaptation communes à tous les ADN utilisés dans cette étude. Primer 1 et 4 recuit pour les adaptateurs avant et arrière, respectivement. Primer 2 est marqué avec Cy3 à l'extrémité 5 '. Amorce 3 'a une étiquette de biotine à l'extrémité 5' et une Cy5 lié intérieurement. Les régions bleu clair de l'amorce 2 et 3 contiennent des séquences complémentaires qui fonctionnent comme extrémités collantes. Soit d'un plasmide ou d'ADN génomique qui contient la séquence d'intérêt est utilisé comme matrice dans deux réactions de PCR distinctes. ADN double brin marqué au Cy3 est produit en utilisant les amorces 1 et 2, et l'ADN marqué au Cy5 biotinylé est produit en utilisant les amorces 3 et 4. Ces deux produits de PCR sont chauffés et refroidis en même temps pour l'échange de brin. Quatre dsDNAs différents sont formés, dont un seul contient Cy3, Cy5, et la biotine. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 4. Régime expérimental. A) unique molécule expérience FRET. molécules d'ADNdb marquées avec Cy3 (vert) sur un côté et Cy5 (rouge) sur l'autre sont immobilisées sur le PEG (polyéthylène glycol) revêtu en surface. Boucle réversible et débouclage de dsDNAs résultent en grande FRET (en boucle) et bas (FRET) non tricotées Etats, respectivement. B) Une molécule unique trace de temps typique de donateurs (vert) et accepteur (rouge) intensités de fluorescence. Les Etats FRET haut et bas sont identifiés comme les États boucle et non tricotées, respectivement. Également indiqué pour la première fois en boucle qui est utilisée pour calculer le taux de bouclage. (Encadré) Le zoom de la figure montre l'anti-corrélation des intensités Cy3 et Cy5. C) Une trace de temps de FRET efficacité calculée à partir de donneur et accepteur intensité retrace dans B. Figure 4B et
Figure 5. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (29.2:0.8 acrylamide / bis-acrylamide, 5% dans du tampon TBE, pH 8,0) d'ADN synthétiques. De gauche à droite, les voies contiennent 1 kb marqueur, l'ADN droite 186 pb et pb 186 ADN courbe. Ce chiffre est en partie adapté d'une publication précédente 12 avec permission. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 6. Des traces représentatives de l'ADN courbe (C-ADN) (A) et la trace de FRET correspondant (B). Comparaison de l'intensité et de FRET traces entre S-ADN (figures 4B et 4C) et C-ADN (figures 6A et 6B) montre clairement que l'ADN courbe boucles plus fréquemment que l'ADN linéaire dans le même état de la mémoire tampon. (Encadré) Le chiffre de zoom-in montre l'anti-corrélation des intensités Cy3 et Cy5. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 7. La moyenne des premiers temps de bouclage de la ligne droite et les courbes ADN. Chaque time a été extrait à partir de ~ 500 molécules dans 5 domaines différents. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM) calculé à partir de trois expériences indépendantes. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 8. Détermination de la constante de vitesse de recuit à partir de l'oligo hybridation. A) Vue schématique de la mesure du taux de recuit. Cy5 amorce est immobilisée sur la surface, et Cy3 amorce est présente à 50 à 180 nM. Reliure et sans engagement de l'amorce Cy3 à 50 nM se produit de façon réversible et conduit à des éclats accepteurs détectables, qui sont présentés dans l'encart. B) Le taux de recuit dépend linéairement de la concentration de l'oligo libre. La pente de la droite représente la constante de vitesse de recuit de deuxième ordre (k 'ANNEA l). Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 9 Les facteurs J des ADN droites et courbes calculées en nM Le facteur J a été déterminée sur la base de deux paramètres mesurables:... L'taux de bouclage de la boucle ADN double brin et la constante de vitesse de recuit des saillies complémentaires gratuits Cliquez ici pour agrandir l'image .
| Composant | Volume/50 réaction de pi | Concentration finale |
| 36 pi | ||
| Tampon de phusion 5x | 10 pl | 1x |
| MM dNTP 10 | 1 pl | 200 pM de chacun |
| Amorce avant (25 M) | 1 pl | 0,5 uM |
| Amorce inverse (25 M) | 1 pl | 0,5 uM |
| Phusion démarrage à chaud ADN polymérase (2 U / pl) | 0,5 pl | 0,02 U / pl |
| Patron de l'ADN | 0,5 pl | ~ 1 ng |
Tableau 1. Mélange réactionnel de PCR. Le protocole est optimisé pour la polymerase Phusion ADN. Les articles doivent être ajoutés dans cet ordre.
| étape du cycle | Température | Temps | Nombre de cycles |
| Dénaturation initiale | "> 95 ° C30 sec | 1 | |
| Dénaturation | 95 ° C | 5 sec | 30 |
| Recuit | 60 ° C | 10 sec | |
| Extension | 72 ° C | 15 sec / kb | |
| Extension finale | 72 ° C | 5 min | 1 |
| 4 & #176; C | tenir |
Tableau 2. Instructions de cycles de PCR. Est déterminée la température de recuit en fonction de la température de fusion des amorces. Le temps d'extension est optimisée pour la polymerase Phusion ADN.
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Discussion
Un test simple molécule unique basé sur le FRET a été utilisé pour étudier la cinétique de bouclage des ADN de différentes formes intrinsèques. ADN courbes peuvent être préparés par la répétition d'une séquence 10-mère en phase avec la période d'hélice de 10,5 pb, et leurs courbures peuvent être estimées en utilisant PAGE. Ces dsDNAs sont conçus avec des extrémités cohésives pour permettre la stabilisation de la boucle transitoire. Nous avons extrait le taux de bouclage de l'augmentation exponentielle du nombre de molécules en boucle au fil du temps. La constante de vitesse de recuit entre les segments déconnectés d'extrémité collante est utilisée pour déterminer la concentration de l'équivalent de la densité de probabilité en boucle, qui est connu comme le facteur de J.
Dans un dosage de cyclisation à base de ligase d'ADN, la mesure de la fermeture de l'ADN probabilité est sensible à la concentration de ligase, et le facteur de J peut être surestimée si ligase est excessive 9. La liaison non spécifique de l'ADN ligase à ADN peuvent aussi influer sur la boucle 10. En outre, Ligasactivité de e dépend de sel et se désintègre au fil du temps. Ainsi, il est difficile d'étudier l'ADN en boucle dans des conditions sous-optimales pour l'activité de ligase. En revanche, un test en boucle basé FRET est exempt de toutes ces préoccupations.
Notre protocole expérimental est similaire à celle de Vafabakhsh et Ha 13, sauf deux aspects importants qui méritent de discussion. Vafabakhsh et Ha 13 construits leurs molécules ADN double brin par ligature plusieurs oligos synthétiques. Bien que l'erreur (insertion, délétion ou substitution) par le taux de la synthèse des nucléotides oligo est négligeable (0,181% f) 23, la fraction de séquences d'ADN non désirées augmente de manière linéaire avec la longueur de l'oligo. Par conséquent, un échantillon de duplex de 100 points établi par ce protocole peut contenir jusqu'à ~ 33% duplex imparfaits qui peuvent entraîner des taux plus élevé de bouclage 24. En comparaison, notre protocole utilise réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour synthétiser les molécules d'ADNdb, qui a une fidélité beaucoup plus élevée que l'ADN chemosynthesis 25. Selon les données du fabricant, la polymérase haute fidélité, nous avons utilisé générerait une molécule d'ADN de 100 pb à 99,8% correct probabilité après 30 cycles d'amplification par PCR.
Une autre différence essentielle entre les deux études est le système d'immobilisation de surface. Dans notre étude, les molécules d'ADN sont attachées à la surface par l'intermédiaire de leurs extrémités, alors que dans le protocole par Vafabakhsh Ha et 13, ils sont fixés au moyen d'une base interne. Il a été prédit que sur la base de l'effet de confinement seul, un ADN double brin à l'intérieur goupillé peut boucle plus fréquemment que d'un ADN double brin libre, jusqu'à un facteur de cinq en fonction de l'emplacement de brochage interne 26. Par conséquent, lorsque l'on mesure le facteur de J en fonction de la longueur de contour de l'ADN, brochage interne peut introduire une variabilité inattendue. Il est également possible que la base modifiée avec le groupe de liaison a une capacité d'appariement des bases plus faibles, ce qui peut entraîner un taux de bouclage supérieur. Cependant, despite ces différences apparentes, les deux protocoles produisent des facteurs de J similaires à 100 pb (~ 3 nM vs ~ 2 nM).
Ce test en boucle basé FRET est prometteur pour l'étude d'un large éventail de phénomènes liés à la boucle ADNds y compris l'effet des asymétries, des entailles ou des lacunes sur ADN double brin boucle 27, l'effet de l'ADN des protéines de liaison à ADN double brin boucle, et la dépendance de la température de ADNds flexibilité. Ces sujets seraient difficiles à traiter avec la cyclisation à base de ligase conventionnelle. Le test en boucle basé FRET peut également être utilisé pour mesurer le facteur de J vs la longueur de contour, qui est la relation standard pour tester les modèles de polymère. Toutefois, le protocole que nous avons présenté ici n'est pas bien adapté à l'étude de bouclage de ADNds plus courte de 100 pb. En dessous de cette longueur, ADN double brin boucle devient extrêmement lente, et donc la vitesse mesurée sera affectée par d'autres procédés inattendus tels que photoblanchiment. On peut accélérer la cinétique de bouclage apparentes par nousment forte concentration de sel ([Na +]> 500 mm), mais la pertinence physiologique d'une telle mesure devient discutable. Par conséquent, l'enquête de ADNds flexion à des échelles de longueur inférieure à 100 pb bénéficiera d'une approche orthogonale à des analyses basées sur cyclisation.
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.
Acknowledgments
Nous remercions James Waters, Gable Wadsworth et Bo Broadwater pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également quatre évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles. Nous reconnaissons l'appui financier du Georgia Institute of Technology, le prix du Burroughs Wellcome Fund carrière à l'interface scientifique, et la subvention du réseau de recherche de l'étudiant de la NSF Physique des systèmes vivants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 ml | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 ml | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1,000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2 μm CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2,000 1 g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3,400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006S Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532 nm 50 mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30 mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25x36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100X/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2 mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
References
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