Summary
Human infektion med Entamoeba histolytica fører til amoebiasis, en væsentlig årsag til diarré i tropiske lande. Infektion initieres af patogen interaktioner med tarmepitelceller, provokerer åbningen af celle-celle-kontakter, og dermed diarré, undertiden efterfulgt af lever-infektion. Denne artikel indeholder en model til at vurdere de tidlige vært-patogen interaktioner at forbedre vores forståelse af amoebiasis patogenese.
Abstract
Entamoeba histolytica er det agens af human amoebiasis, en væsentlig årsag til diarré og hepatisk absces i tropiske lande. Infektion initieres ved interaktion af patogenet med intestinale epitelceller. Denne interaktion fører til forstyrrelse af intercellulære strukturer såsom stramme vejkryds (TJ). TJ sikre forsegling af epithellaget at adskille værtsvæv fra tarmlumen. Nylige undersøgelser viser, at forstyrrelse af TJ af den parasitiske protein EhCPADH112 er en forudsætning for E. histolytica invasion, der er ledsaget af epitelbarriere dysfunktion. En analyse af molekylære mekanismer involveret i TJ demontering under E. histolytica invasion er af afgørende betydning for at forbedre vores forståelse af amoebiasis patogenese. Denne artikel præsenterer en nem model, der tillader en vurdering af de første host-patogen interaktioner og parasitten invasion potentiale. Parametre, der skal analyseres omfatter transepithelial elektrisk modstand, interaktion af EhCPADH112 med epiteloverflade receptorer, ændringer i udtryk og lokalisering af epitelial forbindelsemotiver markører og lokalisering af parasit-molekyler inden epitelceller.
Introduction
Entamoeba histolytica er en enkelt celle protozo ansvarlige human amoebiasis en tarminfektion forårsager betændelse og diarré. E. histolytica inficerer op til 50 millioner mennesker årligt, men kun omkring 10% af de smittede mennesker udvikler symptomer forbundet til amoebiasis 1. Smitte sker ved indtagelse af forurenet mad eller vand, som indeholder E. histolytica cyster. I tarmen, cyster producerer levende trofozoitter der overholder kolon mucin og formere 2. Trofozoitter sædvanligvis cyster, der udskilles via afføring. I andre tilfælde og endnu ukendte grunde trophozoitter bryde den intestinale epitel lag og invadere underliggende væv. I værste tilfælde, de træder ind i blodet og påvirke andre organer såsom lever 3..
Breaking epitelbarrieren kræver afbrydelse af epitelial transmembrale strukturer, der opretholder cellerne samles. Epitelcellekontakter dannes ved apikale forbindelsesmangfoldighed kompleks bestående af fast (TJ) og adherens junctions (AJ) og desmosomes 4. De mest apikale junctions er TJ, og derfor er de første barriere fornærmet af E. histolytica og nogle andre patogener under host invasion. TJ består af transmembrale adhæsionsreceptorer såsom claudins, occludin og Junctional adhæsionsmolekyler (JAM), der deltager i homo-eller heterofile interaktioner med receptorer på det tilstødende celle. De er intracellulært bundet af stillads molekyler af de zonula occludens (ZO) familie, der forbinder adhæsionsreceptorer til aktincytoskelet at give yderligere mekanisk styrke til epitel. TJ er ansvarlige for forsegling tarmvæv fra tarmlumen, forhindrer overdreven vand og opløste lækage. Således, efter TJ er forstyrret af parasitten, er væv invaderet. E. histolytica udskiller flere molekyler såsom: (i) der er involveret i vedhæftning af amøber til TargET celler 5; (Ii) faktorer membranaktive deltager i drab af værtsceller ved exocytose, for eksempel ionkanal-dannende peptider betegnes amoebapores 6,7; og (iii) proteinaser, som nedbryder ekstracellulære matrixproteiner og medierer væv disintegration 5,8,9.
Den cysteinprotease EhCP112 og adhesionsmolekylet EhADH112 der tilsammen danner EhCPADH112 komplekset er to E. histolytica virulens proteiner, der spiller en stor rolle i demonteringen af TJ 10. Levende trophozoitter, deres samlede lysater og udskilte produkter fremkalde molekylære ændringer i TJ komplekse og funktionelle forstyrrelser af epitelbarriere. I denne undersøgelse er det vist, at EhCP112 og EhADH112 interagere med occludin og claudin-1-proteiner, der fører til internalisering og nedbrydning af celle proteiner, hvilket vil lette E. histolytica indgang gennem paracellulære vej.
Vores data og dem, of andre grupper 11-17 tyder stærkt på nødvendigheden af specifikke vært-patogen interaktioner, der tillader parasit invasion. Unraveling det molekylære grundlag af disse interaktioner er af allerstørste betydning for en bedre forståelse af amoebiasis patogenese. Selektiv forstyrrelse af TJ af trophozoitter, kendetegnet ved forøget paracellulær permeabilitet, kan måles ved et fald i transepithelial elektrisk modstand (TER). Overføringen af parasitiske proteiner hen imod værten epitel kan bestemmes ved hjælp af immunfluorescens-farvning og konfokal lasermikroskopi, en metode, kan også afsløre co-lokalisering af amøber virulensfaktorer med epiteliale synaptiske markører angiver mulige direkte vekselvirkninger. I denne artikel beskriver vi i detaljer, hvordan epitelceller og trophozoitter dyrkes, høstes og manipuleret til at undersøge host-patogen interaktioner og deres konsekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Etablering og opretholdelse af E. histolytica Cultures
- Grow axenisk (helt fri for alle andre kontaminerende organismer) 1 x 10 5 trofozoitter af Entamoeba histolytica stamme HML: IMSS klone et 18 i 16 x 125 mm podningsrør med Teflon liner skruelåg (eller 1 x 10 6 trofozoitter i en engangs-T- 25-kolbe), og 15 ml (eller 50 ml i T-25-kolbe) af Tyi-S-33-medium (TYI bouillon suppleret med 3% Diamond vitaminblanding, 10% varmeinaktiveret serum fra voksent kvæg, 0,5 IE / ml penicillin og 35 ug / ml streptomycin) 19 i en inkubator ved 37 ° C.
- Harvest trofozoitter under den logaritmiske vækstfase sædvanligvis ved 48-96 timers mellemrum (figur 1) ved at afkøle de podningsrør i 5-10 minutter i et is-vand-bad til at frigive trophozoitter fastgjort til glasset kultur rør.
- Overfør kulturen ind i en konisk rør og vend det flere gange for at sprede CELls. Bestem celle nummer ved hjælp af et hæmocytometer (Neubauer kammer) og overføre et inokulum i en kultur rør indeholdende frisk TYI-S-33 medium.
- Brug lavt antal amøber længere inkubationsperioder (~ 3 x 10 5 celler til ~ 5 dage) og et højere antal for kortere perioder (~ 1 x 10 6 celler for ~ 1 dag). Mens optalte inokulum er ønskelige, blive etablerede kulturer forudsigelig, så skønnede mængder inocula er mulige.
- Mængden af trofozoitter titreres for at optimere celle numre for hvert forsøg.
- Opretholde en parallel eksemplarer kultur at have en back-up i tilfælde af utilsigtet forurening eller rør brud.
- Låg på rørene og inkubere dem ved 37 ° C i en 5 ° skrå horisontale vinkel.
- Check kulturer ved visuel inspektion regelmæssigt, da en overdreven vækst af kulturen kan indeholde mange lyserede celler.
2.. Etablering og opretholdelse af MDCK Kultur </ P>
- Grow MDCK (Madin Darby Canine Kidney)-celler type I (høj resistens) i engangs T-75-kolber med 10 ml DMEM-medium suppleret med penicillin (100 IU / ml), streptomycin (100 mg / ml), insulin (0,08 U / ml) og 10% nyfødte kalveserum i en befugtet atmosfære af 5% CO2 og 95% luft ved 37 ° C.
- At opdele celler, tjek dem på et inverteret mikroskop. Split celler, når de er ~ 85-100% sammenflydende.
- Brug en vakuum aspirator i en steril hætte og en steril glas Pasteur-pipette for at fjerne medierne fra kulturen. For at undgå at skrabe celler, vend kolben på hovedet og aspirere medier fra det nederste hjørne.
- Doser 10 ml forvarmet PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, pH 7,4) i en T-75 kolbe (5 ml i tilfælde af en T-25-kolbe ), og vip forsigtigt kolben for at vaske cellerne. Fjern PBS ved vakuum aspiration. Omfattende vask er nødvendig, da serum hæmmer trypsin.
- Doser 1,5 ml 0,05% trypsin i en T-75 kolbe (for T-25 kolbe anvende 0,5 ml) og blidt kolben til at dække cellelaget med trypsin.
- Inkuberes i 5-10 minutter i inkubatoren (nøjagtige tidspunkt afhænger af trypsin aktivitet).
- Check for celle løsrivelse ved at holde kolben mod lyset og se efter strømmende celler. Cell detachement (afrundede celler) kan også kontrolleres ved hjælp af et mikroskop. Ofte slipper celler hurtigere med en hurtig, blid lussing på siden af kolben.
- Tilsættes 15 ml suppleret DMEM til et T-75 kolbe (5 ml til en T-25 kolbe). Resuspender celler ved at pipettere op og ned 4 eller 5 gange.
- At udbrede celler fortyndes cellesuspensionen 1:05 med frisk suppleret DMEM. Celler nummer kan også bestemmes på dette tidspunkt ved hjælp af et hæmocytometer men det er normalt kun nødvendigt, hvis opdele celler i særlige formater for visse analyser.
3.. Fremstilling af trophozoite alt Lysater
- Frigør trofozoitter fra cuLTURE rør ved afkøling af røret i 5-10 minutter i et is-vand-bad. Overfør aseptisk kultur i et konisk rør og centrifugeres ved 360 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Kassere forsigtigt supernatanten ved dekantering, tilsættes iskold PBS til pelleten Vend røret flere gange for at dispergere cellerne og centrifugeres igen ved 360 x g i 10 min. Gentag dette trin to gange for at fjerne alle spor af TYI-S-33 medium.
- Bestem trofozoitter nummer ved hjælp af et hæmocytometer.
- Lyse trofozoiter ved fryse-tø-cykler. Snap-fryse en målte inokulum på trofozoitter (600.000 trofozoitter / ml) fortyndet i iskoldt PBS, i flydende nitrogen i 1 min. Frigøre prøven ved 4 ° C og vortex kraftigt. Gentag nedfrysning og optøning 3 gange for at fuldføre cellelysering.
- Aktiver proteaser er til stede i lysaterne med 0,02% β-mercaptoethanol.
4.. Fremstilling af trophozoite secernerede produkter
- Udfør trin 3,1-3,2.
- Bestemceller antal og levedygtighed på dette punkt ved hjælp af et hæmocytometer og anvendelse af et trypanblåteksklusion test 20:
- Fortynd 9 x 10 6 trofozoitter i 3 ml iskold PBS og overføre celler i en 50 ml konisk rør. Tag 10 pi af denne suspension og tilsæt 1 ml af 0,4% trypanblå stamopløsning pH 7,2.
- Brug en Neubauer kammer til at tælle celler ved lav forstørrelse.
- Tæl alle celler og adskille antallet af blå celler, da blå celler har taget op farvestoffet og må betragtes som død.
- Procentdelen af levedygtige celler ved at dividere antallet af levedygtige celler med det samlede antal af celler og multiplicere med 100.
- Overfør konisk rør indeholdende trophozoite suspensionen i inkubatoren ved 37 ° C i 2 timer i en 5 ° skrå vandret vinkel.
- At indsamle de udskilte produkter, centrifugeglas ved 360 xg i 10 min. Brug et engangs-og steril sprøjte og omhyggeligt indsamle supernatant undgå kontaminering af prøverne med trophozoitter fra pelleten. Fjerne eventuelle overførte celler ved at lade supernatanten gennem et 0,22 um celluloseacetatmembran. Aktiver proteaser med 0,02% β-mercaptoethanol.
- At kassere formodet uønsket forurening med molekyler frigivet fra døde celler, genanvende trypanblåteksklusion test for cellernes levedygtighed. Levedygtige og totale antal celler skal være den samme som opnået i trin 4.2. Hvis dette ikke er tilfældet, kan de indsamlede supernatant ikke kun indeholde udskilte proteiner, og bør kasseres.
5.. Interaktion af MDCK celler med trofozoiter, trophozoite Lysater eller udskilte produkter
- Inkuber sammenflydende MDCK-celle-monolag med levende trophozoitter (en MDCK-til-amøbe forholdet 1:1), trophozoite lysater (en MDCK-til-amøbe forholdet 1:2) eller udskilte produkter (en MDCK-til-amøbe forholdet 1 : 10) ved 37 ° C i 2 og 30 min (figur 2A).
- Vask epitelceller fem gange med iskold PBS for at fjerne ubundne molekyler eller trophozoitter.
6.. Forberedelse af prøver til Immunofluorescence
- Kultur MDCK-celler på sterile dækglas placeret inde i en 24-brønde celledyrkningsskål. Undersøg cellerne i inverteret mikroskop, indtil de når 100% af sammenløb. Derefter udskiftes mediet med 1 ml frisk suppleret DMEM-medium og overføre pladen til en 37 ° C inkubator i 24 timer mere.
- Fjern mediet ved hjælp af en vakuum aspirator, og en steril glas Pasteur-pipette, og der tilsættes 1 ml varmt PBS til hver brønd. Fjern PBS og gentag vask med frisk PBS. Pas på ikke at skrabe cellerne fra bunden af brønden med glaspipette.
- Tilføj forskellige forhold i trofozoitter fortyndet i 1 ml varmt PBS: levende trofozoitter (t), trophozoite samlede lysater (TL) og udskilles produkter (SP).
- Sæt kulturen pladen i inkubatoren for 2 eller 30 min.
- Forbered to kontrolgrupper betingelser: den ene opkaldt Time 0 min, hvor MDCK celler bør ikke inkuberet med E. histolytica men kun med 1 ml varmt PBS; og en anden tilstand som sekundære antistoffer kontrol, i dette tilfælde inkuberes MDCK med T, TL eller SP til 2 eller 30 min og udelade inkubation med primære antistoffer.
- Vask epitelceller fem gange med kold PBS for at fjerne ubundne molekyler eller trophozoitter.
- Lave og permeabilisere cellerne med 1 ml 96% ethanol i 30 minutter ved -20 ° C.
- For at fjerne ethanol, udføre tre hurtige vaske med 1 ml PBS ved stuetemperatur.
- Udfør følgende trin i et fugtigt kammer for at undgå udtørring af prøver:
- Bruge enhver tilgængelig flad kasse, der kan lukkes og fyldes med en våd køkkenrulle, hvor prøver kan sikkert placeret. For eksempel kan en tom pipettespids kasse tjener dette formål godt.
- Inde i kammeret, jævnt placere et Parafilm lag og pipette 25 pi blokning opløsning (0,5% BSA) for hvert dækglas.
- Tag dækglas ud af brøndene med fine pincet, forsigtigt fjerne overskydende væske fra kanten med et filter papir og lægge dækglas i drop indeholdende blokerende opløsning (0,5% BSA) med cellerne vendt mod blokerende opløsning. Inkuber prøverne i 1 time ved stuetemperatur.
- Klargør en blanding af primære antistoffer i PBS: IgM muse-anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; 1:10 fortynding) og IgG kanin anti-ZO-1 (pα-ZO-1, 1:100 fortynding).
- Anbring et nyt ark Parafilm i fugtigt boks og pipette 25 ul af antistoffer løsning for hvert dækglas.
- Løft dækglas fra blokerende opløsning, tørre overskydende væske ved kanterne ved hjælp af et filter papir, og læg dem i dråber med cellerne vender antistoffet løsning. Inkuber prøverne natten over ved 4 ° C.
- Sæt hver dækglas i en brønd på en 24-brønde (celle side på toppen), og der tilsættes 1 ml af PBS.
- Klargør en blanding af fluorescerende sekundære antistoffer i PBS: ged anti-IgM mus koblet til FITC (1:100 fortynding) og gede anti-IgG kanin koblet til TRITC (1:50 fortynding).
- Anbring et nyt ark Parafilm ind i fugtigt boks og pipette 25 ul af sekundære antistoffer løsning for hver dækglas.
- Overfør prøverne som i 6.10 og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i mørke for at undgå blegning af fluorescerende farvestoffer. Gentag trin 6.11.1.
- For nuklear farvning, inkuberes i 3 minutter med 200 pi 0,05 mM DAPI opløsning ved stuetemperatur og beskyttes mod lys. Gentag trin 6.11.1.
- For at spare de fluorescerende farvestoffer, placere dækglas (celler vender nedad) i 5 pi Vecta Shield antiblegemiddel montering løsning på objektglas. Forsegl dækglas bruge neglelak for at undgå prøve tørring.
- Til langtidsopbevaring, holder dias i enobjektglas box ved -20 ° C.
- Analyser forberedelser konfokal mikroskopi gennem Z-stack sektioner og XZ-fly (figur 2A).
7.. Inkubation af trofozoiter med proteasehæmmere eller specifikt antistof
- Gentag trin 3.1 og 3.2. For hver eksperimentel betingelse, inkuberes 1 x 10 5 trofozoitter (resuspenderet i 50 pi PBS) med proteasehæmmere (1 mm Komplet og 40 ug / ml E-64) eller 30 pg monoklonalt antistof mod EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 i 20 minutter ved 4 ° C (figur 2B). Brug disse forberedelser til co-inkubations analyser som beskrevet i trin 8.5.
8.. Måling af transepithelial elektrisk modstand (TER)
- Kultur MDCK-celler på sterile Transwell gennemtrængelige understøtninger (0,4 um porestørrelse). I det øvre rum, anbringe 100 pi af cellesuspension og i det nedre kammer600 pi suppleret DMEM-medium.
- Kontroller medium niveau med jævne mellemrum. Frisk medium kan tilføjes efter behov.
- Undersøg cellerne på et inverteret mikroskop, indtil de når 100% af sammenløb. Skift medium hver 2-3 dage.
- For at forbedre cellebinding (om nødvendigt), ækvilibrere Transwell filtrene natten over ved 37 ° C i DMEM før tilsætning af cellesuspensionen.
- Steriliser stx2 elektroder i hætten ved nedsænkning i ethanol og derefter i sterilt PBS i 15 minutter hver, under UV-lys. Forbind elektroderne til en EVOM epitelial voltohmmeter og vælg modstand mode.
- Saml medium fra den øverste rum i hver transwell og samle dem. Tag 50 pi dette medie blandingen og kombinere det med 50 pi trofozoitter suspension (1 x 10 5 trofozoitter i PBS) eller med kun PBS (kontrol). Brug en lignende blanding for hver transwell.
- Føj blandinger til det øvre kammer i hver transwell containing MDCK celler. Eksperimentelle betingelser omfatter MDCK celler uden trofozoitter (kontrol), en co-kultur med trofozoitter eller med trofozoitter pre-rugede med proteasehæmmere eller mαEhCPADH112. For at eliminere modstanden fra filtre, bruge Transwells inkuberet med kun medium. For hver eksperimentel betingelse brug mindst tre Transwells.
- Straks, måle TER ved at dyppe stx2 elektroder i hver transwell.
- Sikre, at jo længere elektrode rører bunden af det nedre kammer, og at kortere elektrode er omfattet af medium i øvre rum (se figur 2B).
- Sørg for at holde elektroderne vinkelret hver gang. Dette vil forbedre reproducerbarhed betydeligt. Undgå at flytte eller vippe elektroden under målingerne, da dette vil føre til variation af data.
- Denne måling skal betragtes som den indledende TER-værdi. Derefter overvåge TER løbet af det følgende30 min.
- For at beregne den endelige TER værdi, trække TER-værdi på kun filtre. At sammenligne resultater fra forskellige eksperimenter normalisere hvert datapunkt til de indledende værdier, idet disse som 100% (figur 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For en vellykket E. histolytica kultur, skal to vigtige betingelser være opfyldt: vækst i axeniske betingelser og høst i logaritmisk fase. Tidligere, kulturer af E. histolytica blev let etableret i forbindelse med visse arter af bakterier eller trypanosomatids 22. Men i dag er det almindeligt at have aksenisk dyrkning af denne parasit betyder ubestemt subkultivering amøber i et miljø fri for metaboliserende bakterier, svampe, protozoer eller metazoan celler. Derudover høste trofozoitter i slutningen logaritmisk til tidlig stationær vækstfase er afgørende at have levedygtige og prolifererende celler 23. Derfor er det vigtigt at skelne denne fase ved kvantificering af trofozoitter langs flere dage, og også ved at undersøge deres intakte morfologi og hurtig bevægelse (figur 1).
For interaktionsundersøgelser behov epitelceller til at værei et sammenflydende monolag at repræsentere fysiologiske forhold som amøber normalt ville støde på i kroppen. Adskillige epitelcellelinier, let at dyrke, er tilgængelige. Mens en mere fysiologisk celle model system vil udlede fra tarmene såsom Caco-2 eller T84, disse cellelinjer vokser temmelig langsomt. En hurtigere voksende cellelinie, har i vidt omfang blevet undersøgt er MDCK celler 24. Disse epitelceller er af nyre oprindelse og er kendetegnet ved høj TER stærk TJ og let dyrkning. Denne cellelinje er blevet anvendt i årtier for at studere celle biologi kryds og TJ sammensætning samt mekanismer TJ montering og demontering. Af disse grunde er MDCK-celler ofte valgt af forskere, når man studerer TJ funktioner. MDCK celler er også i vid udstrækning blevet brugt som model for studiet af mekanismer fremkaldt under amoebiasis 5,8,10,25-28. I en nylig undersøgelse har vi rapporteret, at interaktionen af stamme I MDCK celler og tarmepitelceller Caco-2-celler med l.ive amøber, lysater og amøber produkter forårsagede lignende virkninger på TJ sammensætning og TER 10. Således MDCK-celler er en passende model til at undersøge mekanismerne for amøbe-epiteler interaktioner. Endvidere er anvendelsen af flere E. histolytica produkter (intakte trofozoitter, trophozoite samlede lysater eller udskilles produkter, der høstes som trofozoitter kultursupernatant) er afgørende for at give yderligere og relevante oplysninger om molekyler, der er involveret i disse interaktioner, såsom tilgængelighed, virkningsmekanisme, sekretion, deltagelse af andre molekyler og udløsning af signalveje.
Mens nå sammenflydning, epitelceller danner kontakter, der er stabiliseret med TJ og AJ. Disse strukturer er sammensat af visse molekyler, der kan visualiseres ved anvendelse af specifikke antistoffer i immunofluorescens-farvninger. For eksempel i figur 3, er celle-kontakter visualiseret ved et antistof mod TJ markør ZO-1 og en rød fluorescens labELED sekundært antistof. Som det kan ses, cellerne samles i umiddelbar nærhed til dannelse af en tæt monolag uden hul. I denne figur har amøbe-afledte kompleks EhCPADH112 blevet farvet ved anvendelse af et monoklonalt antistof, der detekteres af en grøn fluorescens-mærket sekundært antistof for at studere interaktionen af dette kompleks med epitheloverfladen. Tre forskellige kilder af denne komplekse er blevet anvendt på epithelial monolag: levende trofozoitter (t), trophozoite samlede lysater (TL) og udskilles produkter (SP). Slående, i alle tilfælde kan der observeres co-lokalisering af EhCPADH112 med ZO-1 (figur 3, pile), hvilket indikerer, at dette kompleks kan være forpligtet til at lette E. histolytica indtrængen i epitel monolag.
Selvom denne interaktion allerede kan observeres så tidligt som 2 minutter efter amøbe-epitelcelle kontakt, cellelaget endnu ikke berørt af denne vekselvirkning siden ZO-1-farvning stadig ser continuous. Dette ændrer fuldstændigt efter længere inkubationstider, som vist i fig. 4. Her blev taget billeder efter 30 min eksponering for de tre forskellige EhCPADH112 kilder. En klar afbrydelse af TJ visualiseres ved en diskontinuerlig ZO-1-farvning ved cellekanterne (figur 4, pile) med det mest indlysende virkning indtræder i MDCK-celle i kontakt med T eller TL. Derimod bliver ZO-1 internaliseres, og ses i intracellulære vesikler. Præcis co-lokalisering med enten TJ eller AJ langs sidelinjen cellemembranerne ikke kan adskilles ved bare at kigge på toppen af monolag, men snarere ved at opnå en "side"-view af celle kontakter 29. Konfokal laser mikroskopi tillader en sådan langs xz-aksen som vist i figur 3 og 4 under hver xy visning. Disse billeder viser en klar erklæring om, hvorvidt proteiner co-lokaliserer med TJ på det mest apikale del af den laterale membran eller hvis de hellere er placeretunder TJ eller over TJ på den apikale membran. I figur kan observeres 3 (pilespidser), en præcis co-lokalisering af EhCPADH112 kompleks med ZO-1, tydeligt afslører TJ som det sted, handling for denne virulensfaktor. I modsætning hertil, E. histolytica invasion skred (30 min for interaktion) i epithel, EhCPADH112 trængte mod den intercellulære rum som farvningen langs sidelinjen membran viste (figur 4, pilespidser). I vores nylige papir, denne metode tilladt os at skelne mellem TJ og AJ fordi dette kompleks kun co-lokaliseret med TJ markører occludin og claudin-1, men ikke med AJ markør β-catenin i 2 min for interaktion 10.
Internalisering af TJ komponenter, som det kan ses i immunofluorescens-farvninger i figur 4, er som regel ledsaget af et tab af barriere-funktion, der kan måles ved transepithelial elektrisk modstand (TER). TERafspejler ionstrøm over epitel monolag og kan måles ved hjælp af elektroder som vist i figur 2B. Når Monolaget endnu ikke helt dannet, eller forstyrret på grund af ekstracellulære signaler, er en fri strøm af ioner på tværs af cellelag angivet med en lav TER. TER blev målt af en kontrol sammenflydende monolag, der ikke har været i kontakt med amøber produkter eller monolag i kontakt med trofozoitter (figur 5). Parasite kontakt forstyrret epitelbarrieren funktion, som angives TER fald på 90% i forhold til kontrol-monolag. For at undersøge de mekanismer, som trophozoitter påvirker barrierefunktion vi præinkuberes de trofozoitter med et antistof mod EhCPADH112 at forhindre adhæsion af dette kompleks eller proteaseinhibitorer til at blokere den proteolytiske aktivitet af denne komplekse og andre proteaser vigtige for skader målcellen. Begge behandlinger førte til en næsten fuldstændig vending af TER drop, hvilket tyder på, at både proteolytiske aktivitet og klæbende egenskaber er vigtige virulensfaktorer af denne komplekse i løbet af E. histolytica invasion.
Fig. 1. Typisk vækstkurve af axenisk dyrkede E. histolytica trofozoitter. Inocula på 2 x 10 5 trofozoiter E. histolytica HMI-IMSS klon A blev dyrket i 6-brønds skåle med Tyi-S-33 medium, og efter hver 24 timers celleantal blev bestemt ved hjælp af en hematocytomer. Cellevækst blev overvåget ved lysmikroskopi og morfologi af voksende celler er afbildet i det øverste panel. Mængden af trofozoitter blev overvåget i 6 dage (D) og værdier blev afbildet i diagrammet nedenfor. Dataene repræsenterer middelværdien og standardfejlen af middelværdien af tre uafhængige målinger. Bar = 10 um./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Skematisk repræsentation af interaktioner blandt MDCK celler og forskellige betingelser for E. histolytica. A) Forskellige betingelser for E. histolytica vises: levende trofozoitter (t), i alt trofozoitter lysates (TL) og molekyler udskilles af trofozoitter i mediet (SP). Enhver eksperimentel betingelse blev analyseret for 2 og 30 min inkubation med sammenflydende MDCK celler. Efter inkubation blev MDCK-celler rigeligt vasket for at fjerne trophozoitter eller ubundne parasitiske molekyler. Så prøver blev behandlet til immunofluorescensassays, beskæftiger mαEhCPADH112 og pαZO-1 Antiboderne til at co-lokalisere den snyltende kompleks EhCPADH112 og TJ markør ZO-1, hhv. Senere blev artsspecifikke sekundære antistoffer koblet til forskellige fluorochromer anvendes til at detektere begge proteiner ved konfokal mikroskopi. B) Tilsætning af trofozoitter kun eller trophozoitter præinkuberet med mαEhCPADH112 eller proteaseinhibitorer i 20 minutter ved 4 ° C i det øvre rum i Transwells indeholdende sammenflydende MDCK-celler. TER af epitelceller blev overvåget ved hjælp af en stx2 elektrode forbundet til en EVOM voltohmeter løbet 30 minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.. Lokalisering af EhCPADH112 på TJ MDCK monolag. MDCK-celler blev inkupyres med levende trofozoitter (t), i alt trofozoitter lysates (TL) og molekyler udskilles af trofozoitter i mediet (SP) i 2 min. Overpanel: fasekontrast billeder af MDCK celler. EhCPADH112 og ZO-1-proteiner blev identificeret ved mαEhCPADH112 og pαZO-1-antistoffer og derefter med FITC-og TRITC-sekundære antistoffer, hhv. Kerner blev farvet med DAPI. Pile: protein lokalisering ved celle grænser. Pilespidser i XZ-fly: protein lokaliserings på TJ. Bar = 10 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Internalisering af EhCPADH112 i MDCK-celler. MDCK-celler blev inkuberet med levende trophozoitter (T) i alt trophozoitter lysater (TL) og molekyler udskilt af trophozoitter i mediet (SP) i 30 minutter. Overpanel: fasekontrast billeder af MDCK celler. EhCPADH112 og ZO-1-proteiner blev identificeret ved mαEhCPADH112 og pαZO-1-antistoffer og derefter med FITC-og TRITC-sekundære antistoffer, hhv. Kerner blev farvet med DAPI. Pile: protein lokalisering ved celle grænser. Pilespidser i XZ-fly: protein lokaliserings ved lateral membran (pilespidser). Bar = 10 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. E. histolytica via EhCPADH112 inducerer epitelbarriere forstyrrelser. MDCK monolag blev inkuberet med levende trofozoitter(T) eller T præinkuberet med proteasehæmmere (PI) eller mαEhCPADH112 antistof (α) i 30 min og TER blev evalueret ved angivne tidspunkter. TER var normaliseret i henhold til den oprindelige værdi for hver transwell (~ 3.200 Ω · cm 2). Middelværdier og standardfejl af middel er repræsenteret på hvert tidspunkt. Statistisk analyse blev udført med GraphPad Prism 5-softwaren ved hjælp af en-vejs ANOVA test. *** P <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at studere in vitro host-patogen interaktioner i løbet af epitelial infektion med E. histolytica, er det afgørende at arbejde med veletablerede kulturer af både epitelceller og trofozoitter. For eksempel, tidligere E. histolytica kulturer var normalt blevet etableret i forbindelse med visse arter af bakterier eller trypanosomatids 22,23. Men co-dyrkning af E. histolytica kulturer er kontraproduktivt for studiet af host-patogen interaktioner, fordi observerede virkninger på værtsceller ikke entydigt kan henføres til ameobas men kunne snarere være en effekt af de co-dyrkede celler. Således er en axenical kultur af E. histolytica er ønskeligt for undersøgelse af specifikke vært-patogen interaktioner. Den angivne protokol beskriver, hvordan sådan en aksenisk dyrkning af E. histolytica kan opnås til specifikt at udnytte sådanne kulturer til infektion studier. Derudover timingenhøst af E. histolytica er også kritisk. E. histolytica høst anbefales under sene stadier af eksponentiel vækst til at sikre et højt udbytte af celler med høj levedygtighed.
På den anden side, en veletableret monolag af epitelceller er også obligatorisk at opnå reproducerbare resultater. At emulere en fysiologisk stram epitelial monolag, behov dyrkede celler skal bruges på den rigtige timing. Monolaget skal fuldstændigt dannet uden huller. Desuden den korrekte dannelsen af TJ og AJ kræver en vis tid efter celle kontakter er etableret. Normalt epitelceller er kontakt-inhiberet, hvilket betyder, at celler stoppe prolifererende i et sammenflydende monolag, således at det normalt er bedre at give cellerne en anden dag for vækst. Dette bør dog ikke udvides, da denne kontakt hæmning er ikke ubestemt, og cellerne kan på et tidspunkt begynder at overgrow hinanden. Hvis det observeres, vil det være nødvendigt at opdele eller diskard celler og ikke bruge dem i analyser. Dannelsen af stramme epitelial monolag bedst kontrolleres ved at måle TER. Dette kræver imidlertid en stigning i Transwell filtre, som er temmelig dyrt. At udvikle et øje for en god monolag det kan være nyttigt for den uerfarne forsøgslederen at sammenligne cellevækst i samme dyrkning format efter at formidle forskellige celle numre.
Timingen af vært-parasit interaktion analysen er en anden afgørende faktor. Efter 2 min for interaktion, kunne observeres nogen epitelbeskadigelse men et samspil af EhCPADH112 med TJ molekyle ZO-1 var allerede tydeligt. Men efter 30 min interaktion blev alvorlig epitelbeskadigelse observeret ved TJ adskillelse og en dråbe TER (10 og denne undersøgelse). Disse data tyder på, at en tidlig klæbemiddel interaktion med apikale epithelial side er nødvendig for at løsne kontakterne og tillade indtrængning af andre molekyler, såsom proteaser, så bidrager tilnedbrydning af andre TJ, AJ og desmosom molekyler. Koncentrationen af trofozoitter proteiner er også vigtig. Af note, kan forskellige resultater skal overholdes ved anvendelse af levende trofozoitter eller bare lysater eller udskilles produkter af E. histolytica. Den relative andel af trophozoitter til epitelceller er tidligere bevist, 10 og selv når forholdet mellem MDCK-til-secerneret biprodukter med amøber var høj (1:10), den epitelbeskadigelse var ikke så alvorlige. Dette indikerer ikke kun, at koncentrationen af et enkelt virulens protein er kritisk, men at det også kunne være samspillet mellem forskellige faktorer, der resulterer i en effektiv epitelbeskadigelse give mulighed for hurtig invasion af amøber. For eksempel Chadee gruppe understregede vigtigheden af en anden amøbe-afledt protease, EhCP5, at fremkalde epitelbeskadigelse 16. Det forekommer sandsynligt, at et samspil af virulensfaktorer er in vivo kræves for at fremkalde amoebiasis og at manglende interaktioner på grund inhibition af en enkelt protein kan forklare det faktum, at i de fleste tilfælde infektioner er hvilende. I denne henseende er det også vigtigt at nævne, at epitel produkter såsom muciner er vigtigt at beskytte mod infektion. Navnlig mucin2 knock-out-mus er mere modtagelige for EhCP5 inducerede TJ ændringer og infektion 16. Således skal også ændringer på epithelial side anses for at vurdere amøbe invasivitet.
En vigtig begrænsning af de beskrevne teknologier til at påvise co-lokalisering er, at det ikke entydigt påvise en direkte interaktion. I dette tilfælde kunne en co-lokalisering eller interaktion også medieret af et andet protein, der er bare ikke visualiseres. At påvise en direkte interaktion, vil det være nødvendigt at producere rekombinante tagget (såsom GST eller 10xHis) proteiner og udføre immunopræcipitation for en tag-og Western blot for den anden. Anyways, immunofluorescensteknikker farvninger har den fordel at afsløre exact cellulære placering af proteinet komplekse og giver forsøgslederen en idé om de proteiner, der skal testes i sådan en in vitro-interaktion assay. En anden ulempe er, at der kun er få amøbe-specifikke antistoffer til rådighed. Så hvis man ønsker at undersøge visse amøber proteiner i sådanne interaktionsstudier, vil det højst sandsynligt være nødvendigt at fremskaffe et antistof. Men hvis antistoffer er tilgængelige, de beskrevne fremgangsmåder kan anvendes til at undersøge relevansen af andre amøber proteiner (secerneres eller overflade-bundne) til værts-patogen interaktioner.
Dette papir beskriver en nem model til at opdage co-lokalisering og vekselvirkninger mellem molekyler af vært og parasit. Viden fra disse cellebaserede forsøg kan anvendes i in vivo infektion modeller med hamstere eller mus til at underbygge den fysiologiske relevans for vært invasion af parasitten. Disse data kan derefter anvendes til udvikling af nye behandling strarende strategier.
Sammenfattende giver vi detaljerede protokoller for dyrkning af E. histolytica og epitelceller til anvendelse i vært-patogen interaktionsstudier, navnlig analyser, der tillader vurdering af co-lokalisering og TJ demontering. Timingen af kulturer såvel som for hver analyse er afgørende for at sikre reproducerbarhed af opnåede resultater. Mens timingen af kulturerne kan påvirkes ved at variere antallet af disseminerede celler, timingen af eksperimenterne, afhænger af typen af assay og typen af proteiner undersøgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
