Summary
Menselijke infectie door Entamoeba histolytica leidt tot amoebiasis, een belangrijke oorzaak van diarree in tropische landen. Infectie wordt gestart door pathogeen interactie met intestinale epitheelcellen, veroorzaken de opening van cel-cel contacten en bijgevolg diarree, soms gevolgd door leverbesmetting. Dit artikel geeft een model om de vroege gastheer-pathogeen interacties beoordelen in ons begrip van amoebiasis pathogenese verbeteren.
Abstract
Entamoeba histolytica is de verwekker van de menselijke amoebiasis, een belangrijke oorzaak van diarree en lever abces in tropische landen. Infectie wordt geïnitieerd door interactie van het pathogeen met intestinale epitheelcellen. Deze interactie leidt tot verstoring van intercellulaire structuren zoals tight junctions (TJ). TJ zorgen voor afdichting van de epitheliale laag om gastweefsel scheiden van darmlumen. Recente studies tonen aan dat verstoring van TJ door de parasitaire eiwit EhCPADH112 is een voorwaarde voor E. histolytica invasie die gepaard gaat met epitheliale barrière disfunctie. De analyse van de moleculaire mechanismen betrokken bij TJ demontage tijdens E. histolytica invasie is van het grootste belang voor ons begrip van amoebiasis pathogenese verbeteren. Dit artikel presenteert een eenvoudig model dat de beoordeling van de eerste gastheer-pathogeen interacties en de parasiet invasie potentieel toestaat. Te analyseren parameters omvatten transepithelial elektrische weerstand interactie van EhCPADH112 epitheliale oppervlak receptoren, veranderingen in de expressie en localisatie van epitheliale junctie merkers en lokalisatie parasiet moleculen in epitheelcellen.
Introduction
Entamoeba histolytica is een eencellige protozoaire verantwoordelijk van menselijke amoebiasis, een darminfectie veroorzaakt ontsteking en diarree. E. histolytica infecteert tot 50 miljoen mensen per jaar, maar slechts ongeveer 10% van de geïnfecteerde mensen ontwikkelen de symptomen verbonden met amoebiasis 1. Infectie optreedt na inname van besmet voedsel of water met E. histolytica cysten. In de darm, cysten produceren levende trofozoïeten die voldoen aan dikke darm mucine en vermenigvuldigen 2. Trofozoiten vormen meestal cysten die worden uitgescheiden via de ontlasting. In andere gevallen en voor nog onbekende redenen, trofozoïeten breken de intestinale epitheliale laag en binnenvallen onderliggende weefsels. In het ergste geval, ze in de bloedbaan en invloed op andere organen zoals de lever 3.
Het doorbreken van de epitheliale barrière vereist verstoring van epitheliale transmembraanpenetratie structuren die cellen toegetreden handhaven. Epitheelcellencontacten worden gevormd door de apicale junctionele complex bestaande uit vast (TJ) en contactplaatsen (AJ) en desmosomen 4. De meest apicale knooppunten zijn TJ, en daarom zijn ze de eerste barrière beledigd door E. histolytica en enkele andere ziekteverwekkers tijdens gastheer invasie. TJ bestaan uit transmembraanpenetratie adhesie receptoren zoals Claudins, occludin en junctionele adhesiemoleculen (JAM) die zich bezighouden met homo-of heterofiele interacties met receptoren van de naburige cel. Ze worden intracellulair gebonden aan steiger moleculen van de zonula occludens (ZO) familie die adhesiereceptoren aansluiten op actinecytoskelet verdere mechanische sterkte aan het epitheel. TJ zijn verantwoordelijk voor het afdichten van darmweefsel uit de darm lumen, het voorkomen van overmatig water en opgeloste stof lekken. Zo, na TJ worden verstoord door de parasiet, weefsels zijn binnengevallen. E. histolytica scheidt verschillende moleculen, zoals: (i) die betrokken is bij hechting van amoebae te target 5 cellen; (Ii) membraan-actieve factoren die aan doden van gastheercellen door exocytose, bijvoorbeeld ion-channel vormende peptiden genoemd amoebapores 6,7; en (iii) proteïnasen die extracellulaire matrix afbreken en bemiddelen weefsel desintegratie 5,8,9.
De cysteïne protease EhCP112 en adhesiemoleculen EhADH112 die samen de EhCPADH112 complex twee E. histolytica virulentie eiwitten die een belangrijke rol spelen bij de demontage van TJ 10. Levende trofozoiten, hun totale lysaten en uitgescheiden te induceren moleculaire veranderingen in de TJ complexe en functionele verstoring van de epitheliale barrière. In deze studie wordt aangetoond dat EhCP112 en EhADH112 interactie met occludin en claudine-1 eiwitten leidt tot internalisatie en degradatie van cel eiwitten, waardoor E. vergemakkelijkt histolytica entree via de paracellulaire pad.
Onze gegevens en die of andere groepen 11-17 suggereren sterk de noodzaak van specifieke gastheer-pathogeen interacties die parasiet invasie mogelijk te maken. Het ontrafelen van de moleculaire basis van deze interacties is van groot belang voor een beter begrip van amoebiasis pathogenese. Selectieve verstoring van TJ door trofozoïeten, gekenmerkt door verhoogde paracellulaire permeabiliteit kan worden gemeten door een afname in transepitheliale elektrische weerstand (TER). De overdracht van parasitaire eiwitten naar gastheer epitheel kan worden bepaald door immunofluorescentie kleuring en confocale laser microscopie, een werkwijze die ook co-lokalisatie van amoebe virulentiefactoren epitheliale junctions bebakening mogelijke directe interacties kunnen onthullen. In dit artikel beschrijven we in detail hoe epitheelcellen en trofozoiten worden gekweekt, geoogst en gemanipuleerd om gastheer-pathogeen interacties en de gevolgen daarvan te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opzetten en onderhouden van E. histolytica Cultures
- Grow axenisch (geheel vrij van alle andere verontreinigende organismen) 1 x 10 5 trofozoiten van Entamoeba histolytica stam HML: IMSS klonen A 18 in 16 x 125 mm cultuur buizen met Teflon liner schroefdoppen (of 1 x 10 6 trofozoïeten in een wegwerp T- 25 kolf) en 15 ml (of 50 ml in T-25 kolf) van TYI-S-33 medium (TYI bouillon aangevuld met 3% Diamond vitaminemengsel, 10% hitte geïnactiveerd volwassen runderserum, 0,5 IU / ml penicilline en 35 ug / ml streptomycine) 19 in een incubator bij 37 ° C.
- Oogst trofozoïeten in de logaritmische groeifase meestal 48-96 uur tijdstippen (figuur 1) door koeling de kweek buizen gedurende 5-10 minuten in een ijs-waterbad tot trofozoïeten aan de glazen kweekbuis los.
- Breng de cultuur in een conische buis en keer het een paar keer om de cel te verspreidenls. Bepaal het aantal cellen met behulp van een hemocytometer (Neubauer kamer), en breng een entstof in een cultuur buis met verse TYI-S-33 medium.
- Gebruik lage aantallen amoebes langer incubatie (~ 3 x 10 5 cellen ~ 5 dagen) en een groter aantal voor kortere perioden (~ 1 x 10 6 cellen ~ 1 dag). Terwijl geteld inocula zijn wenselijk, opgericht culturen geworden voorspelbaar zodat geschatte volumes inocula haalbaar zijn.
- Titreer de hoeveelheid trofozoïeten aan celaantallen optimaliseren voor elk experiment.
- Handhaaf een parallel duplicaat cultuur om een back-up in geval van onbedoelde verontreiniging of buis breuk hebben.
- Cap buizen ze stevig en incubeer bij 37 ° C in een 5 ° gekanteld horizontale hoek.
- Controleer culturen door visuele inspectie regelmatig, aangezien een overmatige groei van de cultuur vele gelyseerde cellen kan bevatten.
2. Oprichting en onderhoud van MDCK Cultuur </ P>
- Groei MDCK (Madin Darby Canine Kidney) cellen type I (hoge weerstand) van het beschikbare T-75 kolven met 10 ml DMEM medium aangevuld met penicilline (100 IE / ml), streptomycine (100 mg / ml), insuline (0,08 U / ml) en 10% pasgeboren kalfsserum in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C.
- Om de cellen te splitsen, check ze op een omgekeerde microscoop. Splits cellen wanneer ze ~ 85-100% confluent.
- Gebruik een stofzuiger aspirator in een steriele kap en een steriele glazen Pasteur pipet om media uit de cultuur te verwijderen. Om te schrapen cellen te voorkomen, zet de fles ondersteboven en zuig media uit de benedenhoek.
- Doseer 10 ml voorverwarmde PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, pH 7,4) in een T-75 kolf (5 ml bij een T-25 kolf ) en schud de kolf om de cellen te wassen. Verwijder PBS door vacuüm aspiratie. Uitgebreid wassen is nodig omdat serum remt trypsine.
- Verdeel 1,5 ml 0,05% trypsine in een T-75 kolf (voor T-25 kolf gebruik 0,5 ml) en schud de kolf om de cellaag met trypsine bedekken.
- Incubeer gedurende 5-10 min in de incubator (exacte tijd afhankelijk trypsinewerking).
- Controleer op cel detachement door te oordelen fles tegen het licht en kijk voor vloeiende cellen. Cel detachement (afgerond cellen) kan ook worden gecontroleerd met behulp van een microscoop. Vaak cellen sneller laat een snelle, zachte klap tegen de zijkant van de kolf.
- Voeg 15 ml DMEM aangevuld met een T-75 kolf (5 ml voor een T-25 kolf). Resuspendeer cellen door en neer te pipetteren 4 of 5 keer.
- Om cellen verspreiden, verdunnen celsuspensie 01:05 met verse AANGEVULD DMEM. Cellen nummer kan ook worden bepaald op dit punt met behulp van een hemocytometer, maar dit is meestal alleen nodig als splitsen cellen in specifieke formaten voor sommige assays.
3. Bereiding van trophozoite Totaal Lysaten
- Los trofozoïeten van culture buizen door koeling van de buis gedurende 5-10 minuten in een ijs-waterbad. Breng de kweek aseptisch in een conische buis en centrifugeer bij 360 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi voorzichtig het supernatant door decanteren, voeg ijskoude PBS om de pellet keer de buis een paar keer om de cellen en centrifugeer opnieuw dispergeren bij 360 xg gedurende 10 minuten. Herhaal deze stap tweemaal om alle sporen van TYI-S-33 medium te verwijderen.
- Bepaal trofozoiten nummer met behulp van een hemocytometer.
- Lyse trofozoiten door vries-dooi cycli. Snap-vries een afgemeten inoculum van trofozoïeten (600.000 trofozoïeten / ml) verdund in ijskoude PBS, in vloeibare stikstof gedurende 1 minuut. Ontdooi het monster bij 4 ° C en vortex krachtig. Herhaal invriezen en ontdooien 3 keer om cellysis te voltooien.
- Activeer proteasen in de lysaten met 0,02% β-mercaptoethanol.
4. Bereiding van trophozoite uitgescheiden producten
- Voer stap 3.1 en 3.2.
- Bepalencellen nummer en de levensvatbaarheid op dit moment met behulp van een hemocytometer en het toepassen van een trypanblauwexclusie proef 20:
- Verdun 9 x 10 6 trofozoïeten in 3 ml ijskoude PBS en overdracht cellen in een 50 ml conische buis. Neem 10 pi van deze schorsing en voeg 1 pl van 0,4% trypanblauw voorraad oplossing pH 7,2.
- Gebruik een Neubauer kamer om cellen bij een lage vergroting tellen.
- Tel alle cellen en scheiden het aantal blauwe cellen, omdat blauwe cellen van de kleurstof hebben genomen en dood moet worden beschouwd.
- Bereken het percentage levensvatbare cellen door het aantal levensvatbare cellen door het totale aantal cellen en vermenigvuldigd met 100.
- Breng de conische buis met de trophozoite suspensie in de incubator bij 37 ° C gedurende 2 uur op 5 ° gekanteld horizontale hoek.
- Voor het uitgescheiden produkten, centrifugebuizen halen bij 360 xg gedurende 10 minuten. Gebruik een wegwerp en steriele spuit en zorgvuldig verzamelen van de supernatant, om contaminatie van monsters met trofozoïeten van de pellet. Verwijder eventuele overgedragen cellen door het passeren van de supernatant over een 0,22 urn celluloseacetaatmembraan. Activeer proteasen met 0,02% β-mercaptoethanol.
- Naar vermeende ongewenste besmetting met moleculen vrijkomen uit dode cellen te verwijderen, opnieuw de trypanblauwexclusie test voor levensvatbaarheid van de cellen. Levende en totale aantal cellen moet hetzelfde zijn als verkregen in stap 4.2. Indien dit niet het geval is, kan het verzamelde supernatans niet alleen bevatten uitgescheiden eiwitten en moet worden weggegooid.
5. Interactie van MDCK Cellen met Trofozoïeten, trophozoite Lysaten of uitgescheiden producten
- Incubeer samenvloeiende MDCK celmonolagen met live trofozoïeten (een MDCK-to-amoebe verhouding van 1:1), trophozoite lysaten (een MDCK-to-amoebe verhouding van 1:2) of uitgescheiden producten (een MDCK-to-amoebe verhouding van 1 : 10) bij 37 ° C gedurende 2 min en 30 (Figuur 2A).
- Was epitheelcellen vijf maal met ijskoude PBS om ongebonden moleculen of trofozoiten elimineren.
6. Voorbereiding van monsters voor immunofluorescentie
- Cultuur MDCK cellen op steriele dekglaasjes geplaatst in een 24-multiwell celkweekschaal. Controleer de cellen op de omgekeerde microscoop totdat ze 100% van de samenvloeiing. Vervang vervolgens medium met 1 ml vers AANGEVULD DMEM medium en breng de plaat naar een 37 ° C incubator gedurende 24 uur verder.
- Verwijder het medium met een stofzuiger aspirator en een steriele glazen Pasteur pipet en voeg 1 ml warm PBS aan elk putje. Verwijder de PBS en herhaal het wassen met verse PBS. Let erop dat cellen schrapen van de bodem van de put met de glazen pipet.
- Voeg verschillende omstandigheden van trofozoïeten verdund in 1 ml warm PBS: leef trofozoiten (T), trophozoite totale lysaten (TL) en uitgescheiden producten (SP).
- Zet de cultuur plaat in de incubator voor 2 of 30 minuten.
- Bereid twee controle condities: een met name genoemde tijdstip 0 min, waar MDCK cellen niet mag worden geïncubeerd met E. histolytica maar alleen met 1 ml warm PBS; en een voorwaarde secundaire antilichamen controle, in dit geval incubeer MDCK met T, TL of SP 2 of 30 min en weglaten incubatie met primaire antilichamen.
- Was epitheelcellen vijf maal met koude PBS om ongebonden moleculen of trofozoiten elimineren.
- Bevestig en permeabel de cellen met 1 ml 96% ethanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C.
- Om ethanol te verwijderen, voert drie snelle wassingen met 1 ml PBS bij kamertemperatuur.
- Voer de volgende stappen in een vochtige kamer om uitdroging van de monsters te voorkomen:
- Gebruik alle beschikbare platte doos die kan worden afgesloten en gevuld met een natte papieren handdoek waar monsters veilig kan worden geplaatst. Bijvoorbeeld, een lege pipet tip box dient dit doel ook.
- Binnen de kamer, gelijkmatig plaats een Parafilm laag en pipet 25 ul van bloking oplossing (0,5% BSA) per dekglaasje.
- Neem dekglaasjes uit de putten met fijne tang, voorzichtig het overtollige water uit de rand te verwijderen met een filter papier en zet dekglaasje in de daling met het blokkeren van oplossing (0,5% BSA) met de cellen naar de blokkerende oplossing. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Maak een mengsel van primaire antilichamen in PBS: IgM muizen anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112, 1:10 verdunning) en IgG konijn anti-ZO-1 (pα-ZO-1, 1:100 verdunning).
- Leg een nieuw vel Parafilm in de vochtige doos en pipet 25 ul van antilichamen oplossing voor elke dekglaasje.
- Til de dekglaasjes van de blokkerende oplossing, drogen de overtollige vloeistof aan de randen een papieren filter, en plaats ze in de druppels met de cellen naar het antilichaam oplossing. Incubeer de monsters overnacht bij 4 ° C.
- Zet elk dekglaasje in een putje van een 24-multiwell (celkant boven) en voeg 1 ml PBS.
- Maak een mengsel van fluorescente secundaire antilichamen in PBS: geit anti-IgM muis gekoppeld aan FITC (1:100 verdunning) en geit anti-konijn IgG gekoppeld aan TRITC (1:50 verdunning).
- Leg een nieuw vel Parafilm in de vochtige doos en pipet 25 ul van de secundaire antilichamen oplossing voor elke dekglaasje.
- Breng de monsters in 6.10 en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker bleken van de fluorescerende kleurstoffen voorkomen. Herhaal stap 6.11.1.
- Voor nucleaire kleuring, incubeer gedurende 3 min met 200 ul 0,05 mM DAPI oplossing bij kamertemperatuur en bescherm tegen licht. Herhaal stap 6.11.1.
- Om de fluorescente kleurstoffen besparen, plaatst de dekglaasjes (cellen naar beneden) in 5 pi Vecta Shield Antifade montage oplossing op glas microscoop dia's. Dicht de dekglaasjes met behulp van nagellak tot monster voorkomen dat ze uitdrogen.
- Voor de lange termijn opslag, houden dia's in eenmicroscoopdia doos bij -20 ° C.
- Analyseer de voorbereidingen van confocale microscopie door Z-stack secties en xz-vliegtuigen (Figuur 2A).
7. Incubatie van Trofozoïeten met proteaseremmers of specifiek antilichaam
- Herhaal de stappen 3.1 en 3.2. Voor elke experimentele conditie, incubeer 1 x 10 5 trofozoïeten (geresuspendeerd in 50 gl PBS) met proteaseremmers (1 mM Volledige en 40 ug / ml E-64) of 30 ug monoklonaal antilichaam tegen EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 gedurende 20 minuten bij 4 ° C (Figuur 2B). Gebruik deze preparaten co-incubatie testen zoals beschreven in stap 8.5.
8. Meting van Transepitheliaal Elektrische weerstand (TER)
- Culture MDCK cellen op steriele transwell doorlaatbare dragers (0,4 um poriegrootte). In het bovenste compartiment plaats 100 ui celsuspensie en in het onderste compartimentBreng 600 pi DMEM medium aangevuld.
- Controleer het medium, op gezette tijden. Vers medium kan worden toegevoegd indien nodig.
- Inspecteer de cellen op een omgekeerde microscoop totdat ze 100% van de samenvloeiing. Wijzig medium om de 2-3 dagen.
- Celbinding (indien nodig) verbeteren evenwicht de transwell filters overnacht bij 37 ° C in DMEM vóór toevoegen van de celsuspensie.
- Steriliseren stx2 elektroden in de kap door onderdompeling in ethanol en daarna in steriele PBS gedurende 15 minuten elk, onder UV-licht. Sluit elektroden een EVOM epitheliale voltohmmeter en selecteer weerstand modus.
- Verzamel medium uit het bovenste compartiment van elk transwell en bundelen ze. Neem 50 pi van dit mengsel en media combineren met 50 ui trofozoïeten suspensie (1 x 10 5 trofozoïeten in PBS) of PBS alleen (controle). Gebruik een soortgelijk mengsel per Transwell.
- Mengsels toe te voegen aan de bovenste kamer van elk transwell containing de MDCK cellen. Experimentele omstandigheden omvatten MDCK cellen zonder trofozoïeten (controle), een co-kweek met trofozoiten of trofozoïeten gepreïncubeerd met proteaseremmers of mαEhCPADH112. Om de weerstand die door filters te elimineren, gebruiken transwells geïncubeerd met alleen medium. Voor elke experimentele conditie gebruik ten minste drie transwells.
- Onmiddellijk meten TER door dompelen de stx2 elektroden in elk transwell.
- Controleer of de langere elektrode raakt de bodem van de onderste kamer en de kortere elektrode onder medium in het bovenste compartiment (zie figuur 2B).
- Zorg ervoor dat de elektroden houden loodrecht elke keer. Dit zal verbeteren reproduceerbaarheid, aanzienlijk. Beweeg of kantelen van de elektrode tijdens de meting: dit zal leiden tot variatie van gegevens.
- Deze meting moet worden beschouwd als de eerste TEW-waarde. Daarna volgen de TER tijdens de volgende30 min..
- Om de uiteindelijke TEW-waarde te berekenen, trekt de TEW-waarde van slechts filters. Om de resultaten te vergelijken van verschillende experimenten normaliseren elk gegevenspunt naar de oorspronkelijke waarden, waarbij deze als 100% (Figuur 2B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor een succesvolle E. histolytica cultuur, moeten twee belangrijke voorwaarden worden voldaan: de groei in axenische voorwaarden en oogst in logaritmische fase. Voorheen, culturen van E. histolytica werden gemakkelijk opgericht in samenwerking met bepaalde soorten bacteriën of trypanosomatids 22. Echter, tegenwoordig is het gebruikelijk om axenic teelt van deze parasiet betekent onbepaalde subkweek van amoeben in een omgeving zonder metaboliseren bacteriën, schimmels, protozoa, of metazoan cellen. Bovendien, het oogsten van de trofozoïeten tijdens de late logaritmische tot vroege stationaire groeifase is cruciaal voor levensvatbare en prolifererende cellen 23. Daarom is het belangrijk om deze fase te onderscheiden door kwantificering van trofozoïeten langs verscheidene dagen, en ook door het onderzoeken van hun intacte morfologie en snelle voortbeweging (figuur 1).
Voor interactie studies, moeten epitheelcellen te zijnin een confluente monolaag om fysiologische omstandigheden die amoeben normaal zou tegenkomen in het lichaam vertegenwoordigen. Verschillende epitheliale cellijnen, eenvoudig te telen, zijn beschikbaar. Terwijl een meer fysiologisch cel modelsysteem zou ontlenen aan de darmen, zoals Caco-2 of T84, deze cellijnen groeien vrij langzaam. Een sneller groeiende cellijn die uitvoerig heeft bestudeerd zijn MDCK cellen 24. Deze epitheelcellen van de nier oorsprong en worden gekenmerkt door hoge TER, sterke TJ en gemakkelijke teelt. Deze cellijn is gebruikt voor de komende decennia celbiologie van kruispunten en TJ samenstelling alsook mechanismen van TJ montage en demontage te bestuderen. Daarom zijn MDCK-cellen vaak gekozen door onderzoekers bij het bestuderen TJ functies. MDCK-cellen zijn ook op grote schaal gebruikt als een model voor de studie van de mechanismen geïnduceerd tijdens amoebiasis 5,8,10,25-28. In een recente studie, hebben we gemeld dat de interactie van stam I MDCK cellen en intestinale epitheliale Caco-2 cellen met live amoebes, lysates en amoebe producten soortgelijke effecten op TJ samenstelling en TER 10 veroorzaakt. Zo MDCK cellen zijn een geschikt model om de mechanismen van amoebe-epitheel interacties te bestuderen. Bovendien is het gebruik van verschillende E. histolytica producten (intact trofozoiten, trophozoite totale lysaten of uitgescheiden producten geoogst als trofozoiten kweeksupernatans) is cruciaal voor aanvullende en relevante informatie over moleculen betrokken bij deze interacties, zoals beschikbaarheid, werkingsmechanisme, secretie, deelname van andere moleculen en triggering van bieden signaalwegen.
Terwijl het bereiken van confluentie, epitheliale cellen vormen de contacten die worden gestabiliseerd door TJ en AJ. Deze structuren bestaan uit bepaalde moleculen die kunnen worden gevisualiseerd door specifieke antilichamen in immunofluorescentie kleuringen. Bijvoorbeeld, in figuur 3, celcontacten worden gevisualiseerd door een antilichaam tegen het merker TJ ZO-1 en een rode fluorescentie labeLED secundair antilichaam. Zoals blijkt cellen verzamelen in de nabijheid van een dichte monolaag vormen zonder gat. In deze figuur is de amoebe afgeleide complex EhCPADH112 is gekleurd met een monoklonaal antilichaam dat wordt gedetecteerd door een groen fluorescent gelabeld secundair antilichaam de interactie van dit complex studie met het epitheliale oppervlak. Drie verschillende bronnen van dit complex zijn toegepast op de epitheliale monolaag: levende trofozoïeten (T), trophozoite totale lysaten (TL) en uitgescheiden producten (SP). Opvallend in alle gevallen co-lokalisatie van EhCPADH112 met ZO-1 kan worden waargenomen (Figuur 3, pijlen), wat aangeeft dat dit complex konden worden om E. vergemakkelijken histolytica penetratie in de epitheliale monolaag.
Hoewel deze interactie reeds al vanaf 2 min na amoebe-epitheliale cel contact kan worden waargenomen, wordt de cellaag nog niet getroffen door deze interactie sinds de ZO-1 kleuring ziet er nog continue. Dit verandert volledig na langere incubatietijden zoals getoond in figuur 4. Hier werden beelden genomen na 30 minuten blootstelling aan de drie EhCPADH112 bronnen. Een duidelijke verstoring van TJ wordt gevisualiseerd door een discontinue ZO-1 kleuring aan celranden (figuur 4, pijlen), met het meest duidelijke effect optreedt in MDCK cellen in contact met T of TL. Daarentegen, ZO-1 wordt geïnternaliseerd en wordt gezien in intracellulaire blaasjes. Exact co-lokalisatie met ofwel TJ of AJ langs de laterale celmembranen kunnen niet worden onderscheiden door enkel bovenop de monolaag maar door het verkrijgen van een "kant"-aanzicht van celcontacten 29. Confocale laser microscopie kan dergelijk aanzicht langs de xz-as zoals getoond in figuren 3 en 4 onder elk xy weergeven. Deze beelden tonen een duidelijke verklaring of eiwitten co-lokaliseren met TJ op de meest apicale deel van de laterale membraan of als ze liever liggenonder of boven TJ TJ op het apicale membraan. In figuur 3 (pijlpunten), een exacte co-lokalisatie van de EhCPADH112 complex met ZO-1 kan worden waargenomen, duidelijk openbaren TJ als de plaats van handeling voor deze virulentie factor. Daarentegen E. histolytica invasie gevorderd (30 min interactie) in het epitheel, EhCPADH112 doorgedrongen naar de intercellulaire ruimte kleuring langs de laterale membraan toonde (Figuur 4, pijlpunten). In onze recente publicatie, deze methode konden we onderscheiden TJ en AJ omdat complex alleen co-gelokaliseerd met TJ markers occludin en claudine-1 maar niet met de AJ marker β-catenine op 2 min interactie 10.
Internalisering van TJ componenten, zoals te zien in de immunofluorescentie kleuringen in figuur 4, gaat meestal gepaard met een verlies van barrièrefunctie die kan worden gemeten door transepitheliale elektrische weerstand (TER). TERweerspiegelt de ionenstroom in de epitheliale monolaag en kan gemeten worden met elektroden zoals getoond in figuur 2B. Wanneer de monolaag is nog niet volledig gevormd of verstoord als gevolg van extracellulaire signalen, is een vrije stroom van ionen over de cellaag aangegeven door een lage TER. TER werd gemeten van een controle confluente monolaag die niet in contact met de amoebe producten of monolagen in contact met trofozoiten (figuur 5) is geweest. Parasite contact verstoorde epitheliale barrière aangegeven door een TER daling van 90% in vergelijking met de controle monolagen. Om de mechanismen waardoor trofozoïeten invloed barrièrefunctie onderzoeken we gepreïncubeerd de trofozoïeten met een antilichaam tegen EhCPADH112 hechting van dit complex of proteaseremmers voorkomen, de proteolytische activiteit van dit complex en andere proteasen belangrijk doel celbeschadiging blokkeren. Beide behandelingen leidden tot een bijna volledige omkering van TER druppel, wat suggereert dat beide proteolytische activiteit en hechtende eigenschappen zijn belangrijke virulentie factoren van dit complex tijdens E. histolytica invasie.
Figuur 1. Typische groeicurve van axenisch gecultiveerde E. histolytica trofozoiten. Inocula van 2 x 10 5 trofozoïeten van E. histolytica HMI-IMSS kloon A werden gekweekt in 6-putjes met TYI-S-33 medium en na elke 24 uur celaantallen werden bepaald met een hematocytomer. Cellulaire groei werd gevolgd door lichtmicroscopie en morfologie van groeiende cellen wordt weergegeven in het bovenste paneel. De hoeveelheid trofozoïeten werd gedurende 6 dagen (d) en waarden zijn in onderstaande tabel uitgezet. De gegevens stellen de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde van drie onafhankelijke metingen. Bar = 10 urn./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Schematische weergave van interacties tussen MDCK cellen en verschillende omstandigheden van E. histolytica. A) afwijkende voorwaarden van E. histolytica getoond: levende trofozoïeten (T), trofozoïeten totale lysaten (TL) en moleculen uitgescheiden door trofozoïeten in het medium (SP). Elke experimentele voorwaarde werd getest op 2 en 30 minuten incubatie met samenvloeiende MDCK-cellen. Na incubatie werden MDCK cellen overvloedig gewassen om trofozoiten of ongebonden parasitaire moleculen te verwijderen. Vervolgens werden monsters verwerkt voor immunofluorescentietesten, in dienst mαEhCPADH112 en pαZO-1 antistoffenies co-lokaliseren de parasitaire complex EhCPADH112 en de TJ marker ZO-1, respectievelijk. Later, species-specifieke secundaire antilichamen gekoppeld met verschillende fluorochromen werden gebruikt om beide eiwitten te detecteren door confocale microscopie. B) Toevoeging van trofozoïeten alleen of trofozoïeten gepreïncubeerd met mαEhCPADH112 of proteaseremmers gedurende 20 min bij 4 ° C in het bovenste compartiment van transwells met confluente MDCK cellen. TER van epitheelcellen werd gecontroleerd met behulp van een stx2 elektrode verbonden met een EVOM voltohmeter, gedurende 30 minuten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Lokalisatie van EhCPADH112 bij TJ van MDCK monolagen. MDCK cellen werden incuingehouden met live trofozoïeten (T), trofozoïeten totale lysaten (TL) en moleculen uitgescheiden door trofozoïeten in het medium (SP) gedurende 2 minuten. Bovenste paneel: fasecontrastbeelden van MDCK cellen. EhCPADH112 en ZO-1 eiwitten werden geïdentificeerd door mαEhCPADH112 en pαZO-1-antilichamen en vervolgens met FITC-en TRITC-secundaire antilichamen, respectievelijk. Kernen werden gekleurd met DAPI. Pijlen: eiwit lokalisatie in cel grenzen. Pijlpunten in xz-vliegtuigen: eiwit lokalisatie bij TJ. Bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Internalisatie van EhCPADH112 in MDCK-cellen. MDCK-cellen werden geïncubeerd met levende trofozoïeten (T), trofozoïeten totale lysaten (TL) en moleculen uitgescheiden door trofozoïeten in het medium (SP) gedurende 30 minuten. Bovenste paneel: fasecontrastbeelden van MDCK cellen. EhCPADH112 en ZO-1 eiwitten werden geïdentificeerd door mαEhCPADH112 en pαZO-1-antilichamen en vervolgens met FITC-en TRITC-secundaire antilichamen, respectievelijk. Kernen werden gekleurd met DAPI. Pijlen: eiwit lokalisatie in cel grenzen. Pijlpunten in xz-vliegtuigen: eiwit lokalisatie bij laterale membraan (pijlpunten). Bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. E. histolytica via EhCPADH112 induceert epitheelbarrière verstoring. MDCK monolagen werden geïncubeerd met live trofozoïeten(T) of T gepreïncubeerd met proteaseremmers (PI) of mαEhCPADH112 antilichaam (α) gedurende 30 min en TER werd geëvalueerd op aangegeven tijdstippen. TER werd genormaliseerd volgens de beginwaarde voor elke transwell (~ 3200 Ω · cm 2). Gemiddelden en standaardfouten van de middelen zijn weergegeven voor elk tijdstip. Statistische analyse werd uitgevoerd met GraphPad Prism software 5 via een ANOVA test. *** P <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om in vitro gastheer-pathogeen interacties tijdens epitheliale infectie te bestuderen door E. histolytica, is het cruciaal om te werken met gevestigde culturen van zowel epitheelcellen en trofozoiten. Bijvoorbeeld, vroeger, E. histolytica culturen had meestal in combinatie met bepaalde soorten bacteriën of trypanosomatids 22,23 vastgesteld. Echter, co-kweken van E. histolytica culturen contraproductief voor de studie van gastheer-pathogeen interacties omdat waargenomen effecten op gastheercellen kan niet eenduidig worden toegeschreven aan de ameobas maar zou eerder een gevolg van de co-gekweekte cellen. Zo, een axenical cultuur van E. histolytica is wenselijk voor het onderzoek van specifieke gastheer-pathogeen interacties. De verstrekte protocol beschrijft hoe zo'n axenische teelt van E. histolytica kunnen worden bereikt specifiek dergelijke culturen geïnfecteerd studies benutten. Bovendien, de timingvan de oogst van E. histolytica is ook kritisch. E. histolytica oogst wordt aanbevolen tijdens de late stadia van exponentiële groei naar een hoge opbrengst van cellen met een hoge levensvatbaarheid te garanderen.
Anderzijds, een gevestigde monolaag van epitheelcellen is verplicht om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Een fysiologisch strakke epitheliale monolaag emuleren, moet gekweekte cellen worden gebruikt met de juiste timing. De monolaag moet volledig worden gevormd zonder gaten. Bovendien is de juiste vorming van TJ en AJ vergt enige tijd na cel contacten gelegd. Meestal epitheelcellen contact-geremd, waardoor cellen stoppen prolifererende in een confluente monolaag, zodat het meestal beter om de cellen een dag groei geven. Dit mag echter niet worden uitgebreid omdat dit contact remming is niet onbeperkt en cellen kunnen op een gegeven moment beginnen ze elkaar overwoekeren. Indien dit zich voordoet is het noodzakelijk te splitsen of discard cellen en niet gebruiken in testen. De vorming van strakke epitheelmonolagen wordt best gecontroleerd door het meten van TER. Dit vereist echter groei Transwell filters, die zijn vrij duur. Om een oog voor een goede monolaag ontwikkelen nuttig voor de onervaren experimentator om de celgroei te vergelijken in dezelfde teelt formaat na verspreiden diverse mobiele nummers kan zijn.
De timing van de gastheer-parasiet interactie assay is een andere cruciale factor. Na 2 min van interactie, kon er geen beschadiging van het epitheel worden waargenomen, maar een interactie van EhCPADH112 met de TJ molecuul ZO-1 was al duidelijk. Na 30 min interactie, werd ernstige epitheliale schade waargenomen zoals aangegeven door TJ demontage en een druppel TER (10 en deze studie). Deze gegevens suggereren dat een vroege hechtmiddel interactie met de apicale epitheelzijde moeten de contacten los en laat penetratie van andere moleculen zoals proteasen die vervolgens aanafbraak van andere TJ, AJ en desmosome moleculen. De concentratie van de trofozoïeten eiwitten is belangrijk. Van de nota, kunnen verschillende resultaten bij de toepassing van live-trofozoiten of gewoon lysaten of uitgescheiden producten van E. worden waargenomen histolytica. Het relatieve trofozoïeten epitheelcellen is eerder aangetoond 10 en zelfs wanneer de verhouding van MDCK-naar-uitgescheiden producten van amoebe was hoog (1:10), de epitheliale schade niet zo ernstig. Dit geeft niet alleen aan dat de concentratie van een virulentie-eiwit is kritisch maar het kan ook het samenspel van verschillende factoren die leiden tot effectieve epitheliale beschadiging snelle invasie van amoeben mogelijk te maken. Bijvoorbeeld, de groep Chadee's gewezen op het belang van een ander-amoebe afgeleide protease, EhCP5, om beschadiging van het epitheel 16 ontlokken. Het lijkt waarschijnlijk dat een samenspel van virulentiefactoren in vivo moeten amoebiasis kan hebben en ontbrekende interacties door inhibition van een eiwit kan verantwoordelijk zijn voor het feit dat in de meeste gevallen infecties rust. In dit verband is het ook belangrijk te vermelden dat epitheliale zoals mucinen zijn belangrijk voor bescherming tegen infecties. Vooral mucin2 knock-out muizen zijn vatbaarder voor EhCP5 geïnduceerde TJ veranderingen en infectie 16. Zo moeten ook wijzigingen aan de epitheliale zijde die moet worden beschouwd als amoebe invasiveness beoordelen.
Een belangrijke beperking van de beschreven technologieën om co-localisatie te detecteren is dat het niet eenduidig blijkt een directe interactie. In dit geval kan een interactie co-lokalisatie of worden gemedieerd door een ander eiwit dat juist niet zichtbaar. Een directe interactie detecteren, is het nodig om recombinant gelabeld (zoals GST of 10xHis) eiwitten en immunoprecipitatie uitvoeren van een label en Western blot voor de andere. Anyways, immunofluorescentie kleuringen hebben het voordeel van het openbaren van de EXAct cellulaire locatie van het eiwitcomplex en geeft de onderzoeker een idee van de eiwitten die moeten worden getest in een dergelijke interactie in vitro assay. Een ander nadeel is dat er maar weinig amoebe-specifieke antilichamen beschikbaar. Dus, als men wil amoebe bepaalde proteïnen in dergelijke interactie studies, zal waarschijnlijk de vorming van een antilichaam vereisen. Indien antilichamen beschikbaar zijn, de beschreven werkwijzen kunnen worden toegepast op de relevantie andere amoebe eiwitten (uitgescheiden of aan het oppervlak gebonden) studeren gastheer-pathogeen interacties.
Dit document beschrijft een eenvoudig model om co-localisatie en interacties tussen moleculen van de gastheer en parasiet detecteren. De opgedane kennis uit deze cel-gebaseerde experimenten kunnen worden toegepast in in vivo infectie modellen met behulp van hamsters of muizen aan de fysiologische relevantie voor host invasie bevestigen door de parasiet. Deze gegevens kunnen vervolgens worden gebruikt voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën stragieën.
Samengevat hebben we gedetailleerde protocollen voor de teelt van E. histolytica en epitheliale cellen voor het gebruik in gastheer-pathogeen interactie studies, in het bijzonder, testen die evaluatie van de co-lokalisatie en TJ demontage mogelijk te maken. De timing van de kweken en die van elke assay is cruciaal voor de reproduceerbaarheid van de verkregen resultaten. Terwijl timing van de kweken kan worden beïnvloed door het variëren van het aantal verspreide cellen, de timing van de experimenten zich afhankelijk van het type assay en de aard van eiwitten onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
