ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי Published: June 12, 2014 doi: 10.3791/51668

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Abigail Betanzos¹, Michael Schnoor², Rosario Javier-Reyna¹, Guillermina García-Rivera¹, Cecilia Bañuelos³, Jonnatan Pais-Morales¹, Esther Orozco¹

¹Department of Infectomics and Molecular Pathogenesis, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ²Department of Molecular Biomedicine, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute, ³Agency for Knowledge Commercialization, Center for Research and Advanced Studies of the National Polytechnic Institute

Summary

הדבקת בני אדם על ידי Entamoeba histolytica מובילה לamoebiasis, גורם עיקרי לשלשולים בארצות טרופיות. זיהום הוא ביוזמת אינטראקציות הפתוגן עם תאי אפיתל במעי, מעורר הפתיחה של אנשי קשר תאי תאים וכתוצאה מכך שלשולים, לפעמים אחריו דלקת בכבד. מאמר זה מספק מודל כדי להעריך את האינטראקציות בין המאכסן לפתוגן מוקדם כדי לשפר את ההבנה של הפתוגנזה amoebiasis שלנו.

Abstract

histolytica Entamoeba הוא סוכן סיבתי של amoebiasis האנושי, גורם עיקרי לשלשולים ומורסה בכבד בארצות טרופיות. זיהום הוא שיזם את האינטראקציה של הפתוגן עם תאי אפיתל במעי. אינטראקציה זו מובילה לשיבוש של מבנים אינטר כגון צמתים הדוקים (TJ). TJ להבטיח איטום של שכבת האפיתל להפריד רקמת מארח מלומן מעיים. מחקרים שנעשה לאחרונה מספקים ראיות לכך שהשיבוש של TJ ידי EhCPADH112 החלבון הטפילה הוא תנאי הכרחי לE. פלישת histolytica שמלווה בחוסר תפקוד מחסום האפיתל. לפיכך, הניתוח של מנגנונים מולקולריים מעורבים בפירוק TJ במהלך E. פלישת histolytica היא בעלת חשיבות עליונה לשיפור ההבנה של הפתוגנזה amoebiasis שלנו. מאמר זה מציג מודל קל המאפשר ההערכה של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן ראשוניים ופוטנציאל פלישת הטפיל. פרמטרים כדי להיות מנותחים כוללים tהתנגדות ransepithelial חשמל, אינטראקציה של EhCPADH112 עם רצפטורים אפיתל פני השטח, שינויים בביטוי ולוקליזציה של סמני junctional אפיתל ולוקליזציה של מולקולות טפיל בתוך תאי אפיתל.

Introduction

histolytica Entamoeba הוא protozoan תא בודד אחראי של amoebiasis האנושי, דלקת מעיים וגורם לדלקת ושלשולים. E. histolytica מדביק עד 50 מיליון אנשים מדי שנה, אך רק כ -10% מאנשים נגועים לפתח סימפטומים הקשורים לamoebiasis ^1. הדבקה מתרחשת על בליעה של מזון מזוהם או מים המכילים E. ציסטות histolytica. במעי, ציסטות לייצר trophozoites לחיות כי לדבוק mucin המעי הגס ולהתרבות ^2. Trophozoites בדרך כלל בצורת ציסטות שמופרשות דרך צואה. במקרים אחרים, ומסיבות שעדיין לא ידועות, trophozoites לשבור את שכבת האפיתל במעי ולפלוש לרקמות הבסיסיות. במקרים הגרועים ביותר, הם נכנסים לזרם הדם ומשפיעים על איברים אחרים כגון הכבד ^3.

שבירת מחסום אפיתל דורשת שיבוש של מבני transmembranal אפיתל, כי לשמור על תאים הצטרפו. תאי אפיתלקשרים נוצרים על ידי מורכב junctional פסגת המורכב ההדוק (TJ) וadherens צמתים (AJ), ודסמוזומים ^4. צמתים apical ביותר הם TJ, ולכן, הם המכשול הראשון עלב ידי א histolytica וכמה פתוגנים אחרים בזמן פלישה מארחת. TJ מורכב מקולטנים הידבקות transmembranal כגון claudins, occludin ומולקולות junctional הידבקות (JAM) העוסקים בהומו או אינטראקציות heterophilic עם הקולטנים של התא השכן. הם מחויבים intracellularly ידי מולקולות פיגום של occludens zonula משפחה (ההסתדרות הציונית) המתחברים לקולטנים הידבקות cytoskeleton אקטין לספק חוזק מכאני נוסף לאפיתל. TJ אחראי לאיטום רקמת מעי מלומן המעיים, מניעת מים מוגזמים וזליגה מומסת. כך, לאחר TJ הם שיבשו על ידי טפיל, רקמות פלשו. E. histolytica מפריש כמה מולקולות כגון: (i) המעורבים בהידבקות של אמבות לטארגתאי et ^5; (Ii) גורמי קרום פעיל משתתפים בהרג של תאי מארח ידי exocytosis, למשל פפטידים יוצרי ערוץ יון כינה amoebapores ^6,7; וכן (iii) proteinases שבזות חלבוני מטריצת חוץ תאיים ולתווך ^5,8,9 התפוררות רקמה.

פרוטאז ציסטאין EhCP112 ומולקולת הידבקות EhADH112 שיחד יוצר קומפלקס EhCPADH112 שני E. histolytica ארסיות חלבונים שממלאים תפקיד מרכזי בפירוק של TJ ^10. trophozoites בשידור חי, lysates הכולל שלהם ומוצרים מופרשים לגרום לשינויים מולקולריים בהפרעה המורכבת ופונקציונלית של TJ מחסום האפיתל. במחקר זה, הוא הראה כי EhCP112 וEhADH112 אינטראקציה עם occludin וחלבונים claudin-1 שמוביל להפנמה ופירוק של חלבוני תא, ובכך להקל E. כניסת histolytica דרך מסלול paracellular.

נתונים אלה וo שלנוו קבוצות אחרות ^11-17 ממליץ בחום שיש הצורך באינטראקציות בין מאכסן לפתוגן ספציפיים המאפשרות פלישת הטפיל. להתיר את הבסיס המולקולרי של אינטראקציות אלה הוא בעל חשיבות עליונה להבנה טובה יותר של הפתוגנזה amoebiasis. הפרעה סלקטיבית של TJ ידי trophozoites, מאופיין בחדירות paracellular מוגברות, ניתן למדוד על ידי ירידה בהתנגדות חשמלית transepithelial (TER). ההעברה של חלבונים טפילים כלפי epithelia מארח יכולה להיקבע על ידי מכתים immunofluorescence ומיקרוסקופ לייזר confocal, שיטה שיכולה גם לחשוף את שיתוף הלוקליזציה של גורמים ארסי אמבה עם סמני junctional האפיתל המצביעים על יחסי גומלין ישירים אפשריים. במאמר זה, אנו מתארים בפירוט כיצד תאי אפיתל וtrophozoites מעובדות, שנקטפו ומניפולציות כדי לבחון אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן והשלכות שלהם.

Protocol

1. ההקמה ותחזוקה של א ' תרבויות histolytica

1. לגדול axenically (חופשי לחלוטין של כל האורגניזמים מזהמים האחרים) 1 x 10 ⁵ trophozoites של HML מתח histolytica Entamoeba: IMSS לשכפל ¹⁸ ב16 x 125 צינורות תרבות מ"מ עם כובעי טפלון בורג אניה (או 1 x 10 ⁶ trophozoites בחולצת חד פעמית 25 בקבוק) ו15 מיליליטר (או 50 מיליליטר בבקבוק T-25) של TYI-S-33 בינוניים (מרק TYI בתוספת 3% תערובת ויטמין יהלומים, בסרום שור בוגר מומת 10% חום, IU / ml פניצילין 0.5 ו35 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין) ¹⁹ בחממה ב 37 ° C.
2. trophozoites קציר בשלב לוגריתמי הצמיחה בדרך כלל ב48-96 מרווחי שעה (איור 1) על ידי מצמרר את צינורות התרבות ל5-10 דקות באמבט קרח מים כדי לשחרר trophozoites המחובר לצינור תרבות זכוכית.
3. העבר את התרבות לתוך צינור חרוטי ולהפוך אותו מספר פעמים כדי לפזר את cells. לקבוע את המספר הסלולרי באמצעות hemocytometer (קאמרי נויבאואר), ולהעביר את הבידוד לתוך צינור תרבות המכיל בינוני TYI-S-33 טריים.
   1. השתמש במספרים נמוכים של אמבות לתקופות ארוכות יותר דגירה (~ 3 x 10 ⁵ תאים ל~ 5 ימים) ומספר גבוה יותר לתקופות קצרות יותר (~ 1 x 10 ⁶ תאים ל~ יום 1). בעוד inocula נספר רצוי, תרבויות הוקמו להיות צפויות, כך שכמויות מוערכות של inocula הן ריאלי.
   2. לכיל את כמות trophozoites כדי לייעל את המספרים סלולריים עבור כל ניסוי.
   3. לשמור על תרבות כפולה במקביל ליש גיבוי במקרה של זיהום בשוגג או שבירת צינור.
4. צינורות כובע בחוזקה ודגירתם על 37 מעלות צלזיוס ב5 ° מוטים בזווית אופקית.
5. בדקו תרבויות על ידי בדיקה חזותית באופן קבוע, שכן צמיחה מוגזמת של התרבות עשויה להכיל תאי lysed רבים.

2. ההקמה ותחזוקה של MDCK תרבות </ P>

1. לגדול MDCK תאים (כליה מדין דארבי כלב) הקלד (עמידות גבוהה) בT-75 צלוחיות חד פעמיות עם 10 מיליליטר של תקשורת DMEM בתוספת פניצילין (100 IU / ml), סטרפטומיצין (100 מ"ג / מיליליטר), אינסולין (0.08 U / מיליליטר) ו10% נסיוב עגל הרך נולד באווירת humidified של 5% CO ₂ ו95% אוויר ב37 ° C.
2. כדי לפצל את התאים, בודק אותם במיקרוסקופ הפוכה. פיצול תאים כאשר הם ~ מחוברות 85-100%.
3. השתמש aspirator ואקום במנדף סטרילי והזכוכית פיפטה פסטר סטריליים כדי להסיר מדיה מהתרבות. כדי להימנע מגירוד תאים, להפוך את הבקבוק במהופך ותקשורת לשאוב מהפינה התחתונה.
4. לוותר 10 מיליליטר של PBS prewarmed (140 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na ₂ HPO _4, 1.8 מ"מ KH ₂ PO _4, pH 7.4) לתוך בקבוק T-75 (5 מיליליטר במקרה של בקבוק T-25 ) ונער בעדינות את הבקבוק כדי לשטוף את התאים. הסר PBS על ידי שאיפה ואקום. שטיפה נרחבת נדרש מאז סרום מעכב טריפסין.
5. לוותר 1.5 מיליליטר של טריפסין 0.05% לבקבוק T-75 (עבור בקבוק T-25 להשתמש 0.5 מיליליטר) ונער בעדינות את הבקבוק כדי לכסות את שכבת תאים עם טריפסין.
6. דגירה של 5-10 דק 'בחממה (זמן מדויק תלוי בפעילות טריפסין).
7. הגעה לניתוק תא על ידי החזקת בקבוק מול האור ולחפש זורמים תאים. ניתוק תא (תאים מעוגלים) גם ניתן לבדוק באמצעות מיקרוסקופ. לעתים קרובות, תאים לשחרר מהר יותר עם סטירה מהירה, עדינה לצד השני של הבקבוק.
8. הוסף 15 מיליליטר של DMEM בתוספת לבקבוק T-75 (5 מיליליטר לבקבוק T-25). Resuspend תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה 4 או 5 פעמים.
9. כדי להפיץ את התאים, לדלל השעיה תא 1:05 עם DMEM בתוספת טרי. מספר תאים יכול להיות גם נקבע בשלב זה באמצעות hemocytometer אבל זה בדרך כלל רק אם יש צורך פיצול תאים לתוך תבניות מיוחדות עבור מבחני מסוימים.

3. הכנת trophozoite סה"כ Lysates

1. ניתוק trophozoites ממ"קצינורות lture ידי מצמרר את הצינור ל5-10 דקות באמבט קרח מים. העבר את הסביבה הנקיה מחיידקי התרבות לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי ב360 XG 10 דקות ב 4 ° C. להשליך בזהירות את supernatant על ידי decantation, להוסיף PBS קר כקרח לגלולה, להפוך את הצינור מספר פעמים על מנת לפזר את התאים ו צנטריפוגות שוב ב360 XG 10 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים כדי להסיר את כל העקבות של מדיום TYI-S-33.
2. לקבוע מספר trophozoites באמצעות hemocytometer.
3. Lyse trophozoites ידי להקפיא להפשיר מחזורים. Snap-להקפיא הבידוד מדוד של trophozoites (600,000 trophozoites מיליליטר /) מדולל PBS קר כקרח, בחנקן נוזלי דקות 1. להפשיר את הדגימה ב 4 ° C ו המערבולת במרץ. חזור על פעולה פעמים הקפאה להפשרת 3 כדי להשלים תמוגה תא.
4. הפעל פרוטאזות המצויות בlysates עם 0.02% β-mercaptoethanol.

4. הכנת המוצרים מופרשים trophozoite

1. לבצע שלבי 3.1-3.2.
2. לקבועמספר תאים ואת כדאיות בשלב זה באמצעות hemocytometer והחלת מבחן הרחקת trypan הכחול ^20:
   1. לדלל 9 x 10 ⁶ trophozoites ב3 קר כקרח PBS מיליליטר ותאי העברה לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. קח 10 μl של השעיה זו ולהוסיף 1 μl של pH פתרון מניות trypan הכחולים 0.4% 7.2.
   2. השתמש בתא Neubauer לספור תאים בהגדלה נמוכה.
   3. לספור את כל התאים ולהפריד את מספר התאים הכחולים, שכן תאים הכחולים לקחו את הצבע ויש לקחת בחשבון מת.
   4. לחשב את אחוז תאי קיימא על ידי חלוקת מספר תאי קיימא על ידי המספר הכולל של תאים והכפלה ב -100.
3. העבר את צינור חרוטי המכיל את ההשעיה trophozoite לתוך החממה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 ב5 ° מוטים בזווית אופקית.
4. כדי לאסוף את המוצרים המופרשים, צינורות צנטריפוגות ב XG 360 10 דקות. השתמש במזרק חד פעמי וסטרילי ובזהירות לאסוף את supernatant, מניעת זיהום של דגימות עם trophozoites מהגלול. לחסל את כל תאים שהועברו על ידי העברת supernatant דרך קרום אצטט תאית 0.22 מיקרומטר. הפעל פרוטאזות עם 0.02% β-mercaptoethanol.
5. כדי לבטל את הזיהום לא רצוי המשוערת עם מולקולות משתחררות מהתאים מתים, החל מחדש את מבחן הרחקת trypan הכחול לכדאיויות תא. מספר קיימא והכולל של תאים צריך להיות זהה, כפי שהתקבל בשלב 4.2. אם זה לא המקרה, supernatant נאסף לא יכול להכיל רק חלבונים מופרשים וצריך להיות מושלך.

5. אינטראקציה של תאי MDCK עם trophozoites, trophozoite Lysates או מוצרים מופרשים

1. דגירה monolayers תא MDCK מחוברות עם trophozoites החי (יחס MDCK לאמבה של 1:1), trophozoite lysates (יחס MDCK לאמבה של 1:2) או מוצרים מופרשים (יחס MDCK לאמבה של 1 : 10) על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו30 (איור 2 א).
2. שטוף תאי אפיתל חמש פעמים עם PBS קר כקרח לחסל מולקולות או trophozoites מאוגדים.

6. הכנת הדגימות לImmunofluorescence

1. תאי MDCK תרבות על coverslips זכוכית סטרילית ממוקם בתוך צלחת תרבית תאי 24 multiwell. בדוק את התאים במיקרוסקופ ההפוך עד שהם מגיעים לנקודת מפגש 100%. לאחר מכן, להחליף בינוני עם 1 מיליליטר של מדיום DMEM בתוספת טרי ולהעביר את הצלחת לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות נוספות.
2. הסר את המדיום באמצעות aspirator ואקום והזכוכית פיפטה פסטר סטרילי ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS החם היטב כל אחד. הסר PBS וחזור על לשטוף עם PBS הטרי. יש להיזהר שלא לגרד תאים מתחתית הבאר עם פיפטה הזכוכית.
3. להוסיף תנאים שונים של trophozoites המדולל ב 1 מיליליטר של PBS החם: trophozoites החי (T), lysates trophozoite הכולל (TL) ומוצרים מופרשים (SP).
   1. שים את צלחת התרבות בחממה במשך 2 או 30 דקות.
   2. הכן שני תנאי שליטה: פעם אחת בשם 0 דקות, שבו תאי MDCK צריכים להיות לא מודגרות עם א ' histolytica אבל רק עם 1 מיליליטר של PBS החם; ותנאי נוסף כמו בקרת נוגדנים משני, במקרה זה דגירה MDCK עם T, TL או SP 2 או 30 דקות ולהשמיט דגירה עם נוגדנים ראשוניים.
4. שטוף תאי אפיתל חמש פעמים עם PBS הקר לחסל מולקולות או trophozoites מאוגדים.
5. לתקן וpermeabilize התאים עם 1 מיליליטר של אתנול 96% למשך 30 דקות ב-20 ° C.
6. כדי להסיר אתנול, לבצע שלושה שוטף מהיר עם 1 מיליליטר של PBS בטמפרטורת חדר.
7. בצע את השלבים הבאים בתא לח, כדי למנוע ייבוש של דגימות:
   1. השתמש בכל תיבה שטוחה זמינה שיכול להיות סגורה ומלאות במגבת נייר רטובה שעליו ניתן למקם בדגימות בבטחה. לדוגמא, תיבת קצה פיפטה ריקה משרתת מטרה זו היטב.
   2. בתוך החדר, באופן שווה מקום שכבת Parafilm ופיפטה 25 μl של בלוקing פתרון (BSA 0.5%) לכל coverslip.
   3. קח את coverslips מתוך הבארות עם מלקחיים בסדר, להסיר בזהירות את נוזלי עודפים מהקצה עם נייר סינון ולשים את coverslip לירידה המכילה פתרון חסימה (BSA 0.5%) עם התאים בפני פתרון החסימה. דגירה הדגימות במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
8. הכן תערובת של נוגדנים עיקריים PBS: עכבר IgM נגד EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; 1:10 דילול) וארנב IgG נגד ההסתדרות הציונית-1 (pα-ההסתדרות הציונית-1; 1:100 דילול).
9. הנח גיליון טרי של Parafilm בתיבה הלחה ופיפטה 25 μl של פתרון נוגדנים לכל coverslip.
10. הרם את coverslips מפתרון החסימה, לייבש את נוזלי עודפים בקצוות באמצעות נייר סינון, ולהכניס אותם לתוך הטיפות עם התאים פונים לפתרון הנוגדן. דגירה דגימות הלילה בשעה 4 ° C.
11. שים את כל coverslip לתוך באר של 24 multiwell (צד תא על גבי) ולהוסיף 1 מיליליטר של PBS.
12. הכן תערובת של נוגדני ניאון משניים ב-PBS: עכבר אנטי IgM עז מצמידים את FITC (1:100 דילול) וארנב נגד IgG עז מצמידים את TRITC (1:50 דילול).
13. הנח גיליון טרי של Parafilm לתוך התיבה הלחה ופיפטה 25 μl של פתרון הנוגדנים משני לכל coverslip.
14. העברת הדגימות כמו ב6.10 דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר בחושך, כדי למנוע הלבנת של צבעי הניאון. חזור על שלב 6.11.1.
15. עבור מכתים גרעיני, דגירה במשך 3 דקות עם 200 μl של 0.05 פתרון מ"מ DAPI בטמפרטורת חדר ולהגן מפני אור. חזור על שלב 6.11.1.
16. כדי לחסוך בצבעי הניאון, הנח את coverslips (תאים כלפי מטה) ל5 μl Vecta חומת Antifade פתרון גובר על שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית. חותם את התלושים לכסות באמצעות לק כדי למנוע ייבוש מדגם.
17. עבור אחסון לטווח ארוך, לשמור על שקופיות בתיבת שקופיות מיקרוסקופ ב -20 ° C.
18. נתח את ההכנות על ידי מיקרוסקופיה confocal דרך חלקי Z-מחסנית וXZ-מטוסים (איור 2 א).

7. דגירה של trophozoites עם מעכבי פרוטאז או נוגדן ספציפי

1. חזור על שלבים 3.1-3.2. עבור כל תנאי ניסוי, דגירה 1 x 10 ⁵ trophozoites (מושעה ב50 μl PBS) עם מעכבי פרוטאז (1 מ"מ שלמים ו-E-64 40 מיקרוגרם / מיליליטר) או 30 נוגדן חד שבטי כנגד מיקרוגרם EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ ל20 דקות ב 4 ° C (איור 2). השתמש בתכשירים אלה למבחני שיתוף דגירה כמתואר בשלב 8.5.

8. מדידה של Transepithelial חשמל התנגדות (TER)

1. תאי MDCK תרבות על תומך סטרילי transwell החדיר (גודל נקבובית 0.4 מיקרומטר). בתא העליון, מקום של השעיה סלולרית 100 μl ובתא התחתוןמקום 600 μl של מדיום DMEM בתוספת.
   1. בדוק את הרמה בינונית מעת לעת. מדיום חדש ניתן להוסיף בהתאם לצורך.
   2. בדוק את התאים על מיקרוסקופ הפוכה עד שהם מגיעים לנקודת מפגש 100%. שנה בינונית כל 2-3 ימים.
   3. כדי לשפר מצורף תא (במידת צורך), לאזן את מסנני transwell לילה בשעה 37 מעלות צלזיוס בDMEM לפני הוספת ההשעיה התא.
2. לעקר אלקטרודות STX2 בשכונה על ידי טבילה באתנול ולאחר מכן בPBS סטרילי ל15 דקות כל אחד, תחת אור UV. חבר אלקטרודות לvoltohmmeter אפיתל EVOM ולבחור במצב התנגדות.
3. אסוף בינוני מהתא העליון של כל transwell וברכתם. קח 50 μl התערובת את המדיה הזו ולשלב את זה עם 50 μl של ההשעיה trophozoites (1 x 10 ⁵ trophozoites PBS) או רק עם PBS (שליטה). השתמש בתערובת דומה לכל transwell.
4. הוספת תערובות לחדר העליון של כל containin transwellגרם תאי MDCK. תנאי ניסוי כוללים תאי MDCK ללא trophozoites (שליטה), תרבות משותפת עם trophozoites או עם trophozoites מראש מודגרות-עם מעכבי פרוטאז או mαEhCPADH112. כדי לחסל את ההתנגדות הניתנת על ידי מסננים, השתמש transwells הודגרו עם בינוני בלבד. עבור כל שימוש תנאי ניסוי לפחות שלושה transwells.
5. באופן מיידי, למדוד טיר על ידי טבילת אלקטרודות STX2 לתוך כל transwell.
   1. להבטיח כי האלקטרודה כבר נוגעת בחלק התחתון של החדר התחתון ושהאלקטרודה הקצרה מכוסות על ידי בינוני בתא העליון (ראה איור 2).
   2. הקפד להחזיק את האלקטרודות בניצב בכל פעם. זה ישפר את שחזור, באופן משמעותי. הימנע מהעברה או הטיית אלקטרודה במהלך המדידות כמו זה יוביל לוריאציה של נתונים.
6. מדידה זו יש לשקול את ערך TER הראשוני. לאחר מכן, לפקח טיר במהלך הבא30 דקות.
7. כדי לחשב את ערך TER הסופי, לחסר ערך TER של מסננים בלבד. כדי להשוות את התוצאות מניסויים שונים לנרמל כל נקודת נתונים לערכים הראשוניים, לוקח את אלה כ100% (איור 2).

Representative Results

עבור א 'מוצלחת תרבות histolytica, שני תנאים חשובים חייבים להתממש: צמיחה בתנאי axenic וקציר בשלב לוגריתמים. בעבר, תרבויות של E. histolytica הוקמו בקלות בשיתוף עם מינים מסוימים של חיידקים או trypanosomatids ^22. עם זאת, כיום מקובל שיש לי טיפוח axenic של טפיל זה כלומר subcultivation בלתי מוגבל של אמבות בסביבה נקיה מחיידקי חילוף חומרים, פטריות, פרוטוזואה, או תאים מטזואניים. בנוסף, קצירת trophozoites במהלך לוגריתמים מאוחר שלב נייח הראשון של צמיחה היא קריטית לתאים קיימא ומתרבים ^23. לכן, חשוב להבחין בשלב זה על ידי כימות של trophozoites לאורך כמה ימים וגם על ידי בחינת המורפולוגיה שלהם ללא פגע ותנועה מהירה (איור 1).

ללימודי אינטראקציה, תאי האפיתל צריכים להיותבשכבת מחוברות לייצג מצבים פיסיולוגיים שאמבות בדרך כלל נתקלות בגוף. כמה שורות תאי אפיתל, קלים לטפח, זמינות. בעוד מערכת מודל של תאים פיסיולוגיים יותר תנבע מהמעיים כגון קאקו-2 או T84, שורות תאים אלה גדלים די לאט. שורת תאים גדל מהר יותר שנחקרה בהרחבה הן תאי MDCK ^24. תאי אפיתל אלה הם ממוצא כליות ומאופיינים גבוה TER, TJ החזק וטיפוח קל. שורת תא זו שימשה במשך עשרות שנים כדי ללמוד ביולוגיה של תא של צמתים והרכב TJ כמו גם מנגנונים של הרכבה ופירוק TJ. מסיבות אלה, תאי MDCK לעתים קרובות נבחרו על ידי חוקרים כאשר לומדים פונקציות TJ. תאי MDCK גם היו בשימוש נרחב כמודל לחקר המנגנונים המושרה במהלך amoebiasis ^{5,8,10,25-28.} במחקר שנערך לאחרונה, דיווחנו כי אינטראקציה של מתח אני MDCK תאים וקאקו-2 תאי אפיתל במעי עם lאמבות אייב, lysates ומוצרי אמבה גרמו לתופעות דומות בהרכב TJ וTER ^10. לכן, תאי MDCK הם מודל מתאים ללמוד מנגנונים של אינטראקציות האמבה-epithelia. יתר על כן, השימוש במספר E. מוצרי histolytica (trophozoites שלם, lysates הכולל trophozoite או מוצרים מופרשים נקטפו כsupernatant תרבות trophozoites) הוא חיוניים כדי לספק מידע נוסף ורלוונטי על מולקולות מעורבות באינטראקציות אלה, כגון זמינות, מצב של פעולה, הפרשה, השתתפות של מולקולות אחרות ומפעילה של איתות מסלולים.

בעוד להגיע confluency, תאי אפיתל יוצרים אנשי קשר שהם התייצבו על ידי TJ ו AJ. מבנים אלה מורכבים ממולקולות מסוימות שיכול להיות דמיינו באמצעות נוגדנים ספציפיים בstainings immunofluorescence. לדוגמא, באיור 3, אנשי קשר סלולריים הם דמיינו ידי נוגדנים נגד סמן TJ ההסתדרות הציונית-1 ומעבדה fluorescently אדומההעירומות נוגדנים משני. כפי שניתן לראות אותו, תאים לאסוף בסמיכות ליצירת monolayer צפוף ללא כל חור. בנתון זה, EhCPADH112 המורכב המופקת מהאמבה כבר מוכתם באמצעות נוגדן חד שבטי שהוא זוהה על ידי נוגדנים משני שכותרתו fluorescently ירוקה כדי לחקור את האינטראקציה מורכבת זה עם משטח אפיתל. שלושה מקורות מורכבים זה שונים יושמו לmonolayer אפיתל: trophozoites החי (T), lysates trophozoite הכולל (TL) ומוצרים מופרשים (SP). באופן מפתיע, בכל המקרים, שיתוף לוקליזציה של EhCPADH112 עם ההסתדרות הציונית-1 ניתן לראות (איור 3, חיצים), מצביע על כך שיכול להיות נדרש מורכב זו כדי להקל על E. חדירת histolytica לmonolayer אפיתל.

למרות שהאינטראקציה הזו יכולה להיות כבר נצפתה כבר 2 דקות לאחר מגע תא אמבה-אפיתל, שכבת התאים עדיין לא מושפעת מאינטראקציה זו מאז מכתים ההסתדרות הציונית-1 עדיין נראה גontinuous. זה משנה לחלוטין לאחר פעמים דגירה ארוכות יותר כפי שמוצג באיור 4. הנה, תמונות צולמו לאחר 30 דקות של חשיפה לשלושת מקורות EhCPADH112 השונים. שיבוש ברור של TJ הוא דמיינו ידי מכתים ההסתדרות ציוני 1 רציף בגבולות תא (איור 4, חיצים), עם ההשפעה הבולטת ביותר המתרחשת בתא MDCK במגע עם T או TL. לעומת זאת, הסתדרות ציונית 1 מקבל הפנים והוא ראה בשלפוחית ​​תאית. שיתוף לוקליזציה מדויקת עם או TJ או AJ לאורך קרום תא לרוחב לא יכולה להיות מכובדת על ידי פשוט מסתכל על החלק העליון של monolayer אלא על ידי קבלת וצפה "בצד" של אנשי קשר של תא ^29. מיקרוסקופ לייזר confocal מאפשר מבט כזה לאורך XZ-הציר כפי שמודגם באיורים 3 ו 4 להלן כל תצוגת XY. תמונות אלו מראות הצהרה ברורה אם חלבוני שיתוף למקם עם TJ בחלק apical ביותר של הקרום לרוחב או אם הם לא נמצאיםמתחת או מעל TJ TJ בקרום הפסגה. באיור 3 (ראשי חץ), שיתוף לוקליזציה מדויקת של מתחם EhCPADH112 עם ההסתדרות הציונית-1 ניתן להבחין, באופן ברור חושפים TJ כמקום פעולה לגורם ארסיות זה. בניגוד לכך, כפי שE. פלישת histolytica התקדמה (30 דקות של אינטראקציה) להאפיטל, EhCPADH112 חדר למרחב אינטר כמכתים לאורך הקרום לרוחב הראה (איור 4, ראשי חץ). במאמר האחרון שלנו, שיטה זו אפשרה לנו להבחין בין TJ וAJ משום מורכב זה שיתוף מקומי רק עם TJ סמני occludin וclaudin-1, אבל לא עם הסמן β-catenin AJ ב -2 דקות של אינטראקציה ^10.

הפנמה של מרכיבי TJ, כפי שניתן לראות בstainings immunofluorescence באיור 4, בדרך כלל מלווה באובדן של תפקוד מחסום שניתן למדוד על ידי התנגדות חשמלית transepithelial (TER). TERמשקף את זרימת יונים על פני monolayer אפיתל וניתן למדוד באמצעות אלקטרודות כפי שמוצג באיור 2. כאשר monolayer עדיין לא נוצר או שובש בשל רמזים תאיים לגמרי, זרימה חופשית של יונים על פני שכבת התאים מצויינים על ידי TER נמוך. TER נמדד של monolayer מחוברות שליטה שלא היה במגע עם מוצרי אמבה או monolayers במגע עם trophozoites (איור 5). קשר טפיל שיבש תפקוד מחסום אפיתל שצוין על ידי ירידת TER של 90% בהשוואה לmonolayers השליטה. כדי לחקור את המנגנונים שבאמצעותם trophozoites להשפיע על תפקוד מחסום, אנחנו מראש מודגרות-trophozoites עם נוגדן נגד EhCPADH112 כדי למנוע הידבקות של זה מורכב או עם מעכבי פרוטאז, כדי לחסום את פעילות מפרקי החלבונים של קומפלקס ואחר פרוטאזות זו חשובה לנזק לתאי המטרה. שני הטיפולים הובילו להיפוך של ירידת TER כמעט מלא, מה שמראה ששני מפרקי חלבונים מאפייני פעילות ודבק הם גורמים ארסי חשובים של מורכבות זו בE. פלישת histolytica.

איור 1. עקומת צמיחה אופיינית של א 'טיפחה axenically trophozoites histolytica. inocula של 2 x 10 ⁵ trophozoites של E. histolytica HMI-IMSS שיבוט גדלו במנות 6 גם עם TYI-S-33 בינוניים ואחרי כל מספרים סלולריים hr 24 נקבעו באמצעות hematocytomer. צמיחה הסלולר הייתה פיקוח על ידי מיקרוסקופ אור ומורפולוגיה של תאים גדל מתוארת בפנל העליון. כמות trophozoites הייתה פיקוח במשך 6 ימים (ד) וערכים היו זממו בתרשים להלן. הנתונים מייצגים את הממוצע וסטיית התקן של הממוצע של שלוש מדידות בלתי תלויות. בר = 10 מיקרומטר./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. ייצוג סכמטי של אינטראקציות בין תאי MDCK ותנאים שונים של א ' histolytica.) תנאים שונים של א ' histolytica מוצג: trophozoites חי (T), lysates הכולל trophozoites (TL) ומולקולות מופרשים על ידי trophozoites לתוך המדיום (SP). כל תנאי ניסוי היה assayed עבור 2 ו30 דקות של דגירה עם תאי MDCK מחוברות. לאחר דגירה, תאי MDCK נשטפו בשפע כדי להסיר trophozoites או מולקולות טפילות מאוגדים. לאחר מכן דגימות עובדו עבור מבחני immunofluorescence, העסקת mαEhCPADH112 וantibod pαZO-1ies לשתף למקם EhCPADH112 הטפילה המורכב וסמן TJ ההסתדרות הציונית-1, בהתאמה. תוספת מאוחרת, נוגדנים משני מינים ספציפיים מצמידים fluorochromes שונה שימשו כדי לזהות שני החלבונים על ידי מיקרוסקופיה confocal. ב) trophozoites מראש מודגרות בלבד או trophozoites עם mαEhCPADH112 או מעכבי פרוטאז עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס בתא העליון של transwells המכיל תאי MDCK מחוברות. TER של תאי אפיתל היה פיקוח באמצעות אלקטרודה STX2 מחוברת לvoltohmeter EVOM, במהלך 30 דקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. לוקליזציה של EhCPADH112 בTJ של monolayers MDCK. תאי MDCK היו incuעצורה עם trophozoites החי (T), lysates הכולל trophozoites (TL) ומולקולות המופרשים על ידי trophozoites לתוך המדיום (SP) למשך 2 דקות. פנל עליון: ניגוד שלב תמונות של תאי MDCK. EhCPADH112 וההסתדרות ציוני 1 חלבונים זוהו על ידי mαEhCPADH112 וpαZO-1 נוגדנים ולאחר מכן עם נוגדני FITC וTRITC-משניים, בהתאמה. הגרעינים הוכתמו DAPI. חיצים: לוקליזציה חלבון בגבולות תא. ראשי החץ בXZ-מטוסים: לוקליזציה חלבון בTJ. בר = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. הפנמה של EhCPADH112 לתוך תאי MDCK. תאי MDCK הודגרו עם trophozoites החי (T), lysates trophozoites הכולל (TL) ומולקולות מופרשים על ידי trophozoites לתוך המדיום (SP) ל30 דקות. פנל עליון: ניגוד שלב תמונות של תאי MDCK. EhCPADH112 וההסתדרות ציוני 1 חלבונים זוהו על ידי mαEhCPADH112 וpαZO-1 נוגדנים ולאחר מכן עם נוגדני FITC וTRITC-משניים, בהתאמה. הגרעינים הוכתמו DAPI. חיצים: לוקליזציה חלבון בגבולות תא. ראשי החץ בXZ-מטוסים: לוקליזציה חלבון בקרום לרוחב (ראשי חץ). בר = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. E. histolytica באמצעות EhCPADH112 גורם שיבוש מחסום האפיתל. monolayers MDCK הודגרו עם trophozoites החי(T) או T מודגרות מראש עם מעכבי פרוטאז (PI) או נוגדן mαEhCPADH112 (α) ל30 דקות וTER הוערך בזמנים מצויין. TER היה מנורמל לפי הערך הראשוני עבור כל transwell (~ 3,200 Ω · ² סנטימטר). אמצעים וסטיות התקן של האמצעי מיוצגים עבור כל נקודת זמן. ניתוח סטטיסטי בוצע עם תוכנת GraphPad פריזמה 5 באמצעות בדיקת ANOVA בכיוון אחד. *** P <0.001.

Discussion

על מנת ללמוד באינטראקציות בין המאכסן לפתוגן מבחנה במהלך זיהום האפיתל על ידי א histolytica, חשוב לעבוד עם תרבויות מבוססות היטב של שני תאים וtrophozoites אפיתל. לדוגמא, בעבר, א תרבויות histolytica היו בדרך כלל הוקמו בשיתוף עם מינים מסוימים של חיידקים או trypanosomatids ^22,23. עם זאת, שיתוף טיפוחו של ע ' תרבויות histolytica אינן מועילות לחקר אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן כי השפעות שנצפו בתאי מארח לא יכולה באופן חד משמעי לייחס לameobas אלא יכולה להיות השפעה של התאים טיפחו במשותף. לפיכך, תרבות axenical של E. histolytica רצוי לבחינת אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן ספציפיים. הפרוטוקול סיפק מתאר כיצד טיפוח axenic כזה של E. histolytica ניתן להשיג לנצל במיוחד תרבויות כזה ללימודי זיהום. בנוסף, העיתויקצירו של ע ' histolytica הוא גם קריטי. E. קציר histolytica מומלץ במהלך שלבים מאוחרים של גידול מעריכי כדי להבטיח תשואה גבוהה של תאים עם כדאיות גבוהה.

מצד השני, monolayer מבוסס היטב של תאי אפיתל הוא גם חובה כדי להשיג תוצאות לשחזור. לחקות monolayer אפיתל פיזיולוגי הדוק, תאים בתרבית צריכים לשמש בעיתוי הנכון. Monolayer צריך להיווצר לחלוטין ללא כל חורים. יתר על כן, היווצרות הנכונה של TJ וAJ דורשת קצת זמן לאחר מגעים סלולריים מבוססים. בדרך כלל, תאי אפיתל הם קשר-עכבות, כלומר תאים להפסיק מתרבים בשכבה ומחוברות, כך שזה בדרך כלל טוב יותר כדי לתת תאי יום נוסף של צמיחה. עם זאת, זה לא צריך להיות מורחב מאז עיכוב הקשר הזה הוא לא בלתי מוגבל ותאים עלולים בשלב מסוים מתחילים לגדול יותר אחד את השני. אם זה הוא ציין יהיה צורך לפצל או דיסקתאי ארד ולא להשתמש בם במבחנים. היווצרות של monolayers אפיתל חזק נשלטת על ידי מיטב מדידת TER. עם זאת, זה דורש צמיחה במסנני transwell, שהם יקרים למדי. לפתח את העין לmonolayer טוב זה עשוי להיות מועיל עבור הנסיין חסר הניסיון להשוות את צמיחת תאים באותה מתכונת טיפוח לאחר הפצת מספרים סלולריים שונים.

העיתוי של assay האינטראקציה המארח טפיל הוא עוד גורם מכריע. לאחר 2 דקות של אינטראקציה, לא נגרם נזק אפיתל יכול להיבחן אך אינטראקציה של EhCPADH112 עם מולקולת TJ ההסתדרות הציונית-1 כבר הייתה נראית לעין. עם זאת, לאחר 30 אינטראקציה דקות, נזק חמור אפיתל נצפה כפי שצוין על ידי פירוק TJ וירידה של TER ⁽¹⁰ ומחקר זה). נתונים אלה מראים כי אינטראקציה דבק מוקדמת עם צד אפיתל הפסגה יש צורך לשחרר את הקשר ולאפשר חדירה של מולקולות אחרות, כגון פרוטאזות שלאחר מכן לתרוםהשפלה של TJ האחר, AJ וdesmosome מולקולות. הריכוז של חלבוני trophozoites הוא גם חשוב. ראוי לציין, תוצאות שונות יכולה להיבחן בעת החלת trophozoites החי או פשוט lysates או מוצרים מופרשים של E. histolytica. חלקם היחסי של trophozoites לתאי האפיתל שהוכח בעבר ¹⁰ וגם כאשר יחס MDCK-מופרש למוצרים על ידי אמבה היה גבוה (1:10), נזק אפיתל לא היה חמור באותה מידה. זה מעיד לא רק שהריכוז של חלבון ארסי יחיד הוא קריטי אבל זה יכול להיות גם את משחק הגומלין של גורמים שונים שיגרמו לניזק אפיתל האפקטיבי כדי לאפשר לפלישה מהירה של אמבות. לדוגמא, הקבוצה של Chadee הדגישה את החשיבות של פרוטאז אחר שמקורם באמבה, EhCP5, כדי לעורר נזק אפיתל ^16. סביר להניח שיחסי גומלין בין הגורמים ארסי הוא in vivo נדרש כדי לגרום amoebiasis וכי אינטראקציות חסרות בשל inhibition של חלבון בודד עשוי להסביר את העובדה שברוב המקרים זיהומים הם שקטים. מבחינה זו, זה גם חשוב לציין כי מוצרי האפיתל כגון mucins חשובים להגנה מפני זיהום. בפרט, mucin2 עקום החוצה עכברים רגישים יותר לשינויים TJ-Induced EhCP5 וזיהום ^16. לפיכך, שינויים בצד אפיתל גם צריכים להילקח בחשבון כדי להעריך את הפולשנות אמבה.

מגבלה חשובה אחת מהטכנולוגיות שתוארו כדי לזהות שיתוף לוקליזציה היא שזה לא חד משמעי להוכיח אינטראקציה ישירה. במקרה זה, אינטראקציה שיתוף לוקליזציה או יכולה להיות גם מתווכת על ידי חלבון אחר שהוא פשוט לא דמיינו. כדי לזהות אינטראקציה ישירה, יהיה צורך לייצר חלבונים רקומביננטיים מתויג (כגון GST או 10xHis) ולבצע immunoprecipitation לתג אחד וכתם מערבי לאחרים. בכל אופן, יש לי stainings immunofluorescence היתרון של חושף את exaמיקום ct הסלולרי של החלבון המורכב ולתת הנסיין רעיון של החלבונים שצריכים להיבדק בassay אינטראקציה במבחנה כזו. חסרון נוסף הוא שיש מעט נוגדני אמבה ספציפית היחידים זמינים. לכן, אם אחד לא רוצה ללמוד חלבוני אמבה מסוימים במחקרי אינטראקציה כזו, זה יהיה ככל הנראה דורש הדור של נוגדן. עם זאת, אם נוגדנים זמינים, ניתן ליישם השיטות שתוארו ללמוד את הרלוונטיות של חלבוני אמבה אחרים (מופרש או הנכנס פני השטח) לאינטראקציות בין מאכסן לפתוגן.

מאמר זה מתאר מודל קל לזהות שיתוף לוקליזציה ואינטראקציות בין המולקולות של המארח וטפיל. הידע שנרכשו בניסויים מבוססי תאים אלה יכולים להיות מיושמים בin vivo מודלים זיהום באמצעות אוגרים או עכברים כדי לאשש את הרלוונטיות הפיזיולוגיות לפלישת מארח על ידי טפיל. נתונים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש בו לפיתוח stra טיפול החדשניtegies.

לסיכום, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לטיפוח E. histolytica ותאי האפיתל לשימוש במחקרי מאכסן לפתוגן אינטראקציה, בפרט, מבחני המאפשרים הערכה של שיתוף לוקליזציה והפירוק TJ. העיתוי של התרבויות, כמו גם זה של כל assay הוא חיוני כדי להבטיח שחזור של תוצאות שהתקבלו. אמנם תזמון של התרבויות יכול להיות מושפע על ידי שינוי מספר התאים להפיץ, העיתוי של הניסויים עצמם תלוי בסוג של assay והסוג של חלבונים נחקרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution