Summary
赤痢アメーバによるヒト感染はアメーバ、熱帯の国では下痢の主な原因につながる。感染は、細胞 - 細胞接触の開口部と、その結果、下痢、時には肝臓感染症が続くを刺激、腸上皮細胞による病原体の相互作用によって開始される。この記事では、アメーバ症の病因の理解を向上させるために初期の宿主 - 病原体相互作用を評価するためのモデルを提供します。
Abstract
赤痢アメーバは、人間のアメーバ症の原因物質、下痢や熱帯諸国における肝膿瘍の主要な原因である。感染は、腸上皮細胞と病原体との相互作用によって開始される。この相互作用は、このようなタイトジャンクション（TJ）のような細胞間構造の破壊につながる。 TJは、腸管内腔から宿主組織を分離する上皮層のシール性を確保。最近の研究では、寄生タンパク質EhCPADH112によるTJの破壊がEのための前提条件であるという証拠を提供上皮バリア機能障害を伴うアメーバ侵入 。このように、E.中にTJ分解に関与する分子メカニズムの解析アメーバの侵入はアメーバ症の病因の理解を向上させるために最も重要である。この記事では、最初の宿主 - 病原体相互作用の評価と寄生虫の侵入の可能性を可能にする簡単なモデルを提示。分析対象となるパラメータは、Tが含まれransepithelial電気抵抗、上皮表面受容体発現の変化および上皮接合マーカーおよび上皮細胞内寄生生物分子の局在化の局在化との相互作用EhCPADH112。
Introduction
赤痢アメーバは、人間のアメーバ、炎症や下痢を引き起こす腸の感染症の責任ある単細胞の原生動物である。E.アメーバは毎年5000万個人にまで感染するが、感染者の約10％がアメーバ1に関連した症状を起こす。感染はEを含む汚染された食物や水の摂取時に起こるアメーバ嚢胞 。腸内で、嚢胞は、大腸ムチンに付着し、2を増殖するライブ栄養型を生産する。栄養型は通常、便を経由して排泄される嚢胞を形成している。他のケースではまだ未知の理由のために、栄養型は腸管上皮層を破壊し、下層組織に侵入する。最悪のケースでは、それらは血流に入り、肝臓3など他の臓器に影響を与える。
上皮バリアを破ることは入社細胞を維持する上皮性膜貫通構造の破壊を必要とします。上皮細胞連絡先はタイト（TJ）からなる頂端接合部複合体により形成され、接合（AJ）を接着結合、および4をデスモソームている。ほとんどの頂端接合部は、TJであるため、彼らはEで侮辱し第一関門であるホスト侵入中にアメーバといくつかの他の病原体。 TJは、隣接セルの受容体とホモまたは異種相互作用に関与クローディン、オクルディンおよび接合部接着分子（JAM）のような膜貫通接着受容体で構成されている。それらは、細胞内で上皮にさらなる機械的強度を提供するために、アクチン細胞骨格に接着レセプターを接続する閉鎖帯（ZO）ファミリーの足場分子によって結合される。 TJは、過剰な水および溶質の漏れを防止する、腸管内腔から腸組織をシールするための責任がある。 TJは、寄生虫によって破壊された後にこのように、組織を侵略している。E. （I）TARGにアメーバの接着に関与するもの： アメーバのようないくつかの分子を分泌するらセル5; （ii）は、例えば、エキソサイトーシスによって宿主細胞の殺傷に関与する膜活性因子、6,7 amoebaporesと呼ばれるイオンチャネル形成ペプチドを;および（iii）細胞外マトリックスタンパク質を分解し、組織崩壊を媒介5,8,9プロテイナーゼ。
一緒にEhCPADH112複合体を形成するシステインプロテアーゼEhCP112及び接着分子EhADH112は、2つのE.あるTJ 10の分解に大きな役割を果たしているアメーバの病原性タンパク質。ライブ栄養型、それらの総溶解物および分泌された製品は、上皮バリアのTJ複雑で機能障害の分子の変化を誘導する。本研究では、EhCP112とEhADH112は、このようにEを容易に細胞タンパク質の内在化と分解をもたらすオクルディンとクローディン1タンパク質と相互作用することが示されている傍細胞経路を介したアメーバの入り口。
我々のデータは、これらのOF他のグループ11から17を強く寄生虫の侵入を可能にする特定宿主-病原体相互作用の必要性を示唆している。これらの相互作用の分子基盤を解明することはアメーバ症の病因のより良い理解のために最も重要である。傍細胞透過性の増大によって特徴付け栄養によるTJの選択的な外乱が、経上皮電気抵抗（TER）の減少によって測定することができる。宿主上皮に向かって寄生タンパク質の移動は、免疫蛍光染色および共焦点レーザー顕微鏡法も可能での直接的な相互作用を示す上皮接合部のマーカーとアメーバの病原性因子の共局在を明らかにすることができる方法によって決定することができる。この記事では、上皮細胞と栄養が、栽培収穫し、宿主 - 病原体相互作用とその結果を検討するために操作する方法を詳細に説明します。
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Protocol
Eの1。確立と維持アメーバ培養
- （他のすべての汚染の生物の完全無料）無菌的に成長する赤痢アメーバ株のHMLの1×10 5栄養型：InterScan MSSはテフロンライナースクリューキャップ（または使い捨てのT-1×10 6栄養型と18 125×16 mm培養チューブのクローンを作成するTYI-S-33培地、3％ダイヤモンドビタミン混合物を補充した（TYIブロス、10％熱不活化成体ウシ血清、0.5 IU / mlペニシリン、および35μgの25フラスコ）にし、15ml（又はT-25フラスコ中の50ml）中/ストレプトマイシン）19 37℃のインキュベーター内
- ガラス培養管に取り付けられた栄養を放出する氷水浴中で5〜10分間培養管を冷却することにより、通常、48〜96時間間隔（ 図1）での対数増殖期の間に収穫栄養。
- CELを分散させるための円錐チューブに文化を転送し、それを数回転倒LS。血球計算板（ノイバウアー室）を使用して、細胞数を決定し、新鮮なTYI-S-33培地を含む培養チューブに接種物を移す。
- 長い潜伏期間（〜5日間〜3×10 5細胞）と短い期間のためのより高い番号（〜1日の〜1×10 6細胞）のためにアメーバの低い数字を使用してください。カウント接種材料が望ましいが接種物の推定体積が実現可能であるように、確立された文化が予測可能になる。
- 各実験について、細胞数を最適化するために、栄養の量を滴定する。
- 不注意による汚染やチューブの破損の場合にはバックアップを持っているパラレル·重複の文化を維持している。
- キャップチューブしっかりと5°傾いた水平画角で、37℃でそれらをインキュベートする。
- 文化の過度の成長が多く、溶解した細胞が含まれている可能性があるので、定期的に目視での文化を確認してください。
MDCK培養2。確立と維持</ pの>
- （マディンダービーイヌ腎臓）細胞/ 0.08 U（インスリン、ペニシリン（100 IU / ml）を、ストレプトマイシン（100 mg / ml）を補充したDMEM培地10mlの使い捨てT-75フラスコ中でI（高抵抗）型MDCKを成長させるml）と37℃で5％CO 2、95％空気の加湿雰囲気中の10％新生児ウシ血清
- セルを分割するには、倒立顕微鏡でそれらを確認してください。彼らは〜百分の85から100までコンフルエントのときセルを分割。
- 無菌フードや文化からメディアを除去する滅菌ガラスパスツールピペットで真空吸引器を使用してください。スクレーピング細胞を回避するために、下の隅から逆さまにフラスコを回して吸引メディア。
- T-25フラスコの場合にT-75フラスコ（5mL中へ予め温めたPBS（140mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4、pH7.4）を10mlのを分与）、静かに細胞を洗浄するために、フラスコを揺する。真空吸引によって、PBSを除去します。血清はトリプシンを阻害するので徹底的な洗浄が必要です。
- （T-25フラスコに0.5mlのを使用）および穏やかにトリプシンで細胞層を覆うようにフラスコを揺するT-75フラスコ中に0.05％トリプシンを1.5mlの分注する。
- （正確な時間は、トリプシン活性に依存します）インキュベーター内で5〜10分間インキュベートします。
- 逆光フラスコを保持することによって細胞の剥離をチェックし、細胞を流すためにしています。 （細胞を四捨五入）細胞剥離はまた、顕微鏡を用いて確認することができる。多くの場合、細胞はフラスコの側への迅速な、優しい平手打ちで速い放出。
- T-75フラスコ（T-25フラスコのために5ミリリットル）に添加したDMEMの15ミリリットルを追加します。ピペッティング4または5倍に細胞を再懸濁。
- 細胞を増殖させる、新鮮な補充されたDMEMで細胞懸濁液を1:5に希釈する。セル番号は、血球計数器を用いて、この時点で決定することができるが、特定のアッセイのための特別な形式にセルを分割する場合、これは通常は必要である。
栄養型全溶解の3。準備
- 立方から栄養を切り離す氷水浴中で5〜10分間チューブを冷却することによりlture管。 4℃で10分間360×gでコニカルチューブと遠心分離機に無菌的に文化を転送慎重に、デカンテーションにより上澄み液を捨て、ペレットを氷冷PBSを追加し、10分間360×gで再び細胞や遠心分離機を分散させるために、チューブを数回転倒。 TYI-S-33培地を完全に除去するために二回、この手順を繰り返します。
- 血球計数器を使用した栄養型の数を決定します。
- 溶解は、凍結融解サイクルによって栄養型。 1分間、液体窒素中で氷冷PBSで希釈した栄養体の測定された接種材料（60万栄養個/ ml）を、スナップ凍結。 4℃、激しくボルテックスでサンプルをアンフリーズします。細胞溶解を完了するために、凍結融解を3回繰り返します。
- 0.02％β-メルカプトエタノールと溶解液中に存在するプロテアーゼをアクティブにします。
栄養型分泌生成物の4。準備
- ステップ3.2に3.1を実行してください。
- 決定する血球計数器を使用し、トリパンブルー排除試験20を適用し、この時点での細胞数及び生存率：
- 50ミリリットルコニカルチューブに9×10 6 3ミリリットルの氷冷PBS中栄養型と転送細胞を希釈する。この懸濁液10μlを取り、0.4％トリパンブルー原液のpH 7.2の1を添加する。
- 低倍率での細胞をカウントするためにノイバウアー室を使用してください。
- すべての細胞を計数し、細胞が青色色素を取り込んだとデッド考慮しなければならないので、青色細胞の数を分離する。
- 細胞の総数により生存細胞の数で割り、100を掛けることによって生存細胞の割合を計算する。
- 5°傾いた水平画角での2時間37℃でインキュベーターに栄養型懸濁液を含むコニカルチューブに移します。
- 10分間360×gで分泌される製品、遠心管を収集します。使い捨て無菌注射器を使用し、丁寧にSUを収集pernatant、ペレットからの栄養型とサンプルの汚染を避ける。 0.22μmの酢酸セルロース膜を通して上清を渡すことで、任意の転送細胞を排除する。 β-メルカプトエタノール、0.02％とプロテアーゼをアクティブにします。
- 死細胞から放出された分子と推定される不必要な汚染を破棄するには、細胞の生存率のために、トリパンブルー排除試験を再適用します。ステップ4.2で得られた細胞の生存と総数は同じである必要があります。そうでない場合には、回収した上清は、分泌タンパク質を含有することができるのみならず、破棄されるべきである。
栄養型、栄養型溶解物または分泌生成物とのMDCK細胞の5。相互作用
- ライブ栄養型（1:1のMDCK対アメーバ比）でコンフルエントのMDCK細胞単層をインキュベート、栄養型溶解物（MDCK·ツー·アメーバ1:2）または分泌生成物（1のMDCK対アメーバ比：2と30分（ 図2A）、37℃で10）。
- 非結合分子または栄養型を排除するために、氷冷PBSで上皮細胞を5回洗浄します。
免疫蛍光のためのサンプルの6。準備
- 24ウェル細胞培養皿の内側に配置滅菌ガラスカバースリップ上で培養MDCK細胞。彼らは合流点の100パーセントに達するまで倒立顕微鏡上の細胞を検査します。その後、新鮮なDMEM培地1mlで培地を交換し、より多くの24時間37℃のインキュベーターにプレートを転送する。
- 真空吸引器と滅菌ガラスパスツールピペットを用いて培地を除去し、各ウェルに暖かい1mlのPBSを加える。 PBSを削除し、新しいPBSでの洗浄を繰り返します。ガラスピペットで井戸の底から細胞を傷が付かないように注意してください。
- ライブ栄養型（T）、栄養型全溶解（TL）と分泌生成物（SP）：暖かい1mlのPBSで希釈した栄養体のさまざまな条件を追加します。
- 2または30分間インキュベーター内で培養プレートを置く。
- 1という時間0分、MDCK細胞を大腸菌とインキュベートしていないする必要があります。2の制御条件を準備アメーバだけ暖かい1mlのPBSで;この場合の二次抗体コントロールなどの他の条件は、2または30分間、T、TLやSPとMDCKインキュベートし、一次抗体とのインキュベーションを省略します。
- 非結合分子または栄養型を排除するために、冷PBSで上皮細胞を5回洗浄します。
- 修正して、-20℃で30分間、96％エタノール1mlで細胞を透過
- エタノールを除去し、室温で1mlのPBSで3回洗浄し、迅速に実行します。
- サンプルの乾燥を避けるために、湿潤チャンバー内の次の手順を実行します。
- 閉じられた試料を安全に載置可能なウェットペーパータオルで充填することができる任意の利用可能な箱を使用する。たとえば、空のピペットチップボックスは、この目的を果たす。
- 室内に、均等にブロックのパラフィルム層とピペット25μLを配置各カバースリップ用の溶液（0.5％BSA）をING。
- 微細鉗子でウェルからカバースリップを取り、注意深く濾紙で縁から過剰な液体を除去し、細胞をブロッキング溶液に対向してブロッキング溶液（0.5％BSA）を含有する液滴にカバースリップを置く。室温で1時間試料をインキュベートする。
- PBS中の一次抗体の混合物を準備したIgMマウス抗EhCPADH112（Mα-EhCPADH112、1:10希釈）およびIgGウサギ抗ZO-1（Pα-ZO-1、1:100希釈）。
- 湿度の高いボックスとピペット各カバースリップのための抗体溶液25μlにパラフィルムの新鮮なシートを置きます。
- ブロッキング溶液からカバースリップを持ち上げ、濾紙を用いてエッジで余分な液体を乾燥させ、そして抗体溶液に面する細胞と滴にそれらを配置する。 4℃で一晩サンプルをインキュベート
- 24マルチウェル（上部のセル側）のウェルに各カバースリップを入れて、1mlのPBSを加える。
- FITCと結合したヤギ抗IgMマウス（1:100希釈）とTRITC（1:50希釈）に結合されたヤギ抗IgGウサギ：PBS中に蛍光二次抗体の混合物を準備します。
- 湿度の高いボックスとピペット各カバースリップのための二次抗体溶液25μlにパラフィルムの新鮮なシートを置きます。
- 6.10のようにサンプルを転送し、蛍光色素の退色を避けるために、暗所で室温で1時間インキュベートする。ステップ6.11.1を繰り返します。
- 核染色のために、室温で0.05 mMのDAPI溶液200μlで3分間インキュベートし、光から保護します。ステップ6.11.1を繰り返します。
- 、蛍光色素を節約する5μLVECTAシールドにカバースリップ（細胞を下向き）を配置するために顕微鏡用スライドガラス上にマウントソリューションを退色防止。試料乾燥を避けるためにマニキュアを使用してカバーグラスをシール。
- 長期保存のために、スライドを保つ-20℃での顕微鏡用スライドボックス
- zスタックセクションとXZ-面（ 図2A）を介して共焦点顕微鏡による調剤を分析します。
プロテアーゼ阻害剤または特異的な抗体を用いて栄養型の7。インキュベーション
- 繰り返して3.2に3.1を繰り返します。各実験条件については、4でプロテアーゼ阻害剤（コンプリート1 mMおよび40μg/ mlのE-64）、または20分間EhCPADH112（mαEhCPADH112）21に対して、30μgのモノクローナル抗体（50μlのPBS中に再懸濁）1×10 5栄養型インキュベート℃（ 図2B）。ステップ8.5で説明したように同時インキュベーションアッセイのためにこれらの製剤を使用してください。
経上皮電気抵抗（TER）の8。測定
- 無菌トランスウェル透過性サポート（0.4μmの孔径）上で培養したMDCK細胞。上部コンパートメントには、細胞懸濁液を100μlを配置し、下部コンパートメント内DMEM培地を600μlを置く。
- 定期的に中レベルを確認してください。必要に応じて新鮮な培地を添加することができる。
- 彼らは合流点の100パーセントに達するまで倒立顕微鏡上の細胞を検査します。 2〜3日ごとに培地交換。
- 細胞接着（必要な場合）を改善するために、細胞懸濁液を添加する前にDMEMで37℃で一晩トランスウェルフィルターを平衡化。
- UV光下で、15分間ずつエタノールに浸漬することによりフード内STX2電極を殺菌した後、滅菌PBS中。 EVOM上皮voltohmmeterに電極を接続し、抵抗モードを選択します。
- 各トランスウェルの上部コンパートメントから培地を収集し、それらをプールする。このメディア混合液50μlを取り、栄養型懸濁液50μl（PBS中1×10 5栄養型）またはPBSのみ（対照）とそれを組み合わせる。各トランスウェルのために同じような混合物を使用してください。
- 各トランスウェルcontaininの上室に混合物を添加G MDCK細胞。実験条件は、栄養型（コントロール）することなく、栄養型またはプロテアーゼ阻害剤又はmαEhCPADH112と共にプレインキュベートした栄養体との共培養をMDCK細胞が挙げられる。フィルタによって提供される抵抗を排除するために、培地のみとインキュベートしたトランスウェルを使用しています。各実験条件について少なくとも3トランスウェルを使用しています。
- すぐに、各トランスウェルにSTX2電極を浸漬することによりTERを測定します。
- 長い電極が下部チャンバーの底部に接触し、短い電極は（ 図2（b）参照 ）は、上部区画内の媒体によって覆われていることいることを確認してください。
- 毎回垂直に電極を保持するようにしてください。これは、有意に、再現性を改善する。これは、データの変化につながるように移動したり、測定中に電極を傾けることは避けてください。
- この測定は、初期のTER値を考慮する必要があります。すると、次の中にTERを監視30分。
- 最終のTER値を計算するために、唯一のフィルタのTER値を減算する。異なる実験からの結果を比較すると、100％（ 図2B）、これらを考慮して、初期値に各データポイントを正規化する。
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Representative Results
成功のためのE.アメーバ文化 、二つの重要な条件が満たされなければならない：対数期における無菌状態や収穫を増加します。 Eの以前に、文化アメーバは容易に細菌やtrypanosomatids 22の特定の種に関連して設立された。しかし、今では、細菌、真菌、原生動物、または後生動物の細胞を代謝しない環境にアメーバの無期限継代培養を意味するこの寄生虫の無菌栽培が一般的です。さらに、増殖の初期静止期まで後半対数の間に栄養型を収穫することは実行可能で増殖している細胞23を持っていることが重要です。したがって、数日沿っおよびそれらのインタクト形態および迅速な移動（ 図1）を検査することによって栄養の定量によって、このフェーズを区別することが重要である。
相互作用研究のために、上皮細胞は、である必要がアメーバは通常、体内で遭遇する生理的条件を表すために、コンフルエントな単層内。いくつかの上皮細胞系、栽培しやすい、ご利用いただけます。より生理学的な細胞モデル系、例えばのCaco-2又はT84などの腸から派生するであろうが、これらの細胞株は、かなりゆっくりと成長する。広く研究されているより速く成長している細胞株は、MDCK細胞24である。これらの上皮細胞は、腎臓起源のものであり、高いTER、強いTJで簡単に培養することによって特徴付けられる。この細胞株は、接合部の細胞生物学およびTJ組成物ならびにTJ組立分解のメカニズムを研究するために何十年も使用されている。 TJ機能を研究する際にこれらの理由のために、MDCK細胞は、しばしば研究者によって選択される。 MDCK細胞はまた、広くアメーバ5,8,10,25-28間に誘導メカニズムの研究のためのモデルとして使用されている。最近の研究では、株の相互作用が、私はLで細胞や腸上皮のCaco-2細胞をMDCKことを報告IVEアメーバ、溶解物およびアメーバ製品はTJ組成およびTER 10に対して同様の効果を引き起こした。このように、MDCK細胞は、アメーバ上皮相互作用のメカニズムを研究するのに適したモデルである。さらに、いくつかのEの使用このような利用可能性、作用機序、分泌、他の分子の参加とのトリガーとして、これらの相互作用に関与する分子、についての追加および関連情報を提供することが重要アメーバ製品 （完全な栄養、栄養型培養上清として収穫栄養全溶解または分泌製品）であるシグナル伝達経路。
コンフルエントに達したが、上皮細胞は、TJとAJによって安定化されるコンタクトを形成する。これらの構造は、免疫蛍光染色に特異的な抗体を用いて可視化することができる特定の分子で構成されている。例えば、 図3において、電池接点は、TJマーカーZO-1及び赤色蛍光ラボに対する抗体によって可視化される二次抗体をELED。それが分かるように、細胞は、任意の孔なしで緻密な単分子層を形成するために、近接して集まる。この図において、アメーバ由来の複合EhCPADH112は、上皮表面とこの複合体の相互作用を研究するために緑色の蛍光標識された二次抗体によって検出されるモノクローナル抗体を用いて染色された。ライブ栄養（T）、栄養全溶解（TL）と、分泌産物（SP）：この複合体の三つの異なる供給源は、上皮単層に適用されている。驚くべきことに、全ての場合において、ZO-1とEhCPADH112の共局在（ 図3、矢印）が観察され、この複合体がE.を容易にするために要求される可能性があることを示す上皮単層へのアメーバ浸透 。
この相互作用はすでにアメーバ上皮細胞に接触した後、早ければ2分として観察することができますが、ZO-1染色は、まだCに見えることから、細胞層はまだこの相互作用の影響を受けませんontinuous。 図4に示すように、これは完全に長いインキュベーション時間の後に変更する。ここで、画像とは、3つの異なるEhCPADH112源への曝露の30分後に採取した。 TJの明確な破壊は、最も明白な効果はTまたはTLと接触してMDCK細胞で発生すると、セルの枠線で不連続ZO-1染色（ 図4、矢印）によって可視化される。対照的に、ZO-1は、内在化されますし、細胞内小胞に見られる。横細胞膜に沿って、TJやAJのいずれかとの正確な共局在はただ単層の上に見ることではなく、細胞接触29の「側」ビューを取得することによって区別することができない。共焦点レーザー顕微鏡は、各XYビューの下、図3と図4で示すようにXZ軸に沿ってこのようなビューを可能にします。これらの画像は、タンパク質は、横方向の膜のほとんどの頂端部に、またはそれらがむしろ配置されている場合、TJと共局在するかどうか明確な声明を表示頂端膜でのTJ未満またはTJ上。 図3（矢頭）に、ZO-1とEhCPADH112複合体の正確な共局在は明らかに、この毒性因子に対するアクションの場として、TJを明らかに観察することができる。対照的に、E.等アメーバの侵入が上皮に（相互作用の30分）進行横方向の膜に沿っ染色（ 図4、矢印）を示したように、EhCPADH112は細胞間隙に向けて貫通した。私たちの最近の論文では、このメソッドは、この複雑なだけTJと共局在しているため、私たちは、TJとAJを区別するために許可された相互作用10の2分でAJマーカーβ-カテニンとオクルディンとクローディン1マーカーではなく。
TJ成分の内在化は、 図4の免疫蛍光染色に見られるように、通常、経上皮電気抵抗（TER）を測定することができるバリア機能の喪失を伴う。 TER上皮単層を横切るイオンの流れを反映し、 図2Bに示すように、電極を用いて測定することができる。単層がまだ完全に起因する細胞外刺激に形成されるか、または破壊されていない場合には、細胞層を横切るイオンの自由な流れは、低TERによって示される。 TERは、アメーバ製品又は栄養単層と接触している（ 図5）と接触していない対照コンフルエントな単層を測定した。寄生虫コンタクトは、制御単層と比較して90％のTERの低下によって示される上皮のバリア機能を破壊した。栄養体は、バリア機能に影響を与えるメカニズムを調べるために、我々EhCPADH112に対する抗体とプレインキュベート栄養型は、この複合体またはプロテアーゼ阻害剤の付着を防止するために、この複合体のタンパク質分解活性を遮断すると標的細胞の損傷のために重要な他のプロテアーゼ。両方の治療が示唆され、TERの低下のほぼ完全な逆転につながったタンパク質分解の両方活動との接着性は、 大腸菌中にこの複合体の重要な毒性因子であるアメーバ侵入 。
図1。無菌的に栽培Eの典型的な成長曲線 Eの2×10 5栄養体のアメーバの栄養型。接種アメーバ HMI-IMSSクローンAはTYI-S-33培地で6ウェル皿中で増殖させ、それぞれの24時間後に細胞数hematocytomerを用いて決定した。細胞増殖は、光学顕微鏡でモニターし、増殖する細胞の形態は、上部パネルに示されている。栄養の量は、6日間（D）のためにモニターし、値を以下のグラフにプロットした。データは、平均および3つの独立した測定値の平均値の標準誤差を表す。バー=10μmである。/ www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。MDCK細胞およびEの異なる条件間の相互作用の模式図アメーバ Eの。A）の異なる条件アメーバが表示されます。ライブ栄養型（T）、総栄養型溶解物（TL）、中（SP）に栄養体から分泌される分子を。任意の実験条件を、コンフルエントMDCK細胞とのインキュベーションの2〜30分間アッセイした。インキュベーション後、MDCK細胞は、栄養豊富に又は結合していない寄生分子を除去するために洗浄した。その後、サンプルはmαEhCPADH112とpαZO-1不格好なやつを採用し、免疫蛍光アッセイのために処理したIESそれぞれ共局在寄生複雑EhCPADH112とTJマーカーZO-1へ。後で、異なる蛍光色素に結合された種特異的二次抗体を、共焦点顕微鏡により、両方のタンパク質を検出するために使用した。B）のみの栄養型又は栄養の添加がmαEhCPADH112またはプロテアーゼ阻害剤と共にプレインキュベートし、20分間4℃でトランスウェルの上部区画においてコンフルエントのMDCK細胞を含む。上皮細胞のTERは、30分の間に、EVOMのvoltohmeterに接続STX2電極を用いてモニターした。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。MDCK単層のTJでEhCPADH112の局在 。 MDCK細胞をincuたライブ栄養（T）、2分間培地（SP）への栄養型によって分泌される総栄養溶解物（TL）と分子とひそめ。上パネル：MDCK細胞の位相コントラスト画像。 EhCPADH112とZO-1タンパク質は、それぞれ、mαEhCPADH112とpαZO-1抗体で識別した後、FITCおよびTRITC-二次抗体と一緒にいた。核はDAPIで染色した。矢印：セル境界でのタンパク質の局在。 XZプレーンでの矢頭：TJでのタンパク質の局在。バー=10μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。MDCK細胞へのEhCPADH112の内在化 。 MDCK細胞は、生きた栄養型（T）、総栄養溶解物（Tと共にインキュベートしたL）、30分間培地（SP）への栄養型によって分泌される分子である。上パネル：MDCK細胞の位相コントラスト画像。 EhCPADH112とZO-1タンパク質は、それぞれ、mαEhCPADH112とpαZO-1抗体で識別した後、FITCおよびTRITC-二次抗体と一緒にいた。核はDAPIで染色した。矢印：セル境界でのタンパク質の局在。 XZプレーンでの矢頭：横膜でのタンパク質局在（矢印）。バー=10μmである。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5。E. EhCPADH112経由アメーバは、上皮バリアの破壊を誘発する。MDCK単層を生きた栄養型とインキュベートした（T）又はT 30分およびTERのためのプロテアーゼ阻害剤（PI）またはmαEhCPADH112抗体（α）とプレインキュベートし、示された時点で評価した。 TERは、各トランスウェルの初期値に基づいて標準化した（〜3,200Ω·cm 2）を 。平均および平均の標準誤差を、各時点について示されている。統計分析は、一方向ANOVA検定を用いを、GraphPad Prism 5ソフトウエアを用いて実施した。 *** P <0.001。
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Discussion
E.により、上皮感染中インビトロ宿主-病原体相互作用を研究するためにアメーバは、上皮細胞と栄養の両方の老舗の文化と連携することが重要である。例えば、以前は、E.アメーバ培養は通常、細菌やtrypanosomatids 22,23の特定の種に関連して確立されていた。 Eのが、共培養アメーバ培養宿主細胞で観察された影響がはっきりとameobasに帰することができませんでしたではなく、共培養細胞の影響である可能性があるため、宿主-病原体相互作用の研究のための逆効果である。このように、Eのaxenical文化アメーバは、特定の宿主-病原体相互作用の検査のために望ましい。提供されたプロトコルでは、以下の方法について説明Eのような無菌栽培アメーバは、特に感染症研究のためのこのような培養物を利用するために達成することができます。さらに、タイミングEの収穫アメーバにも非常に重要です。E.アメーバの収穫は、高い生存と細胞の高い歩留まりを確保するために、指数関数的な成長の後期段階で推奨されます。
一方、上皮細胞の十分に確立された単層を再現性のある結果を得ることも必須である。生理学的にタイト上皮単層をエミュレートするために、培養細胞を正しいタイミングで使用することが必要である。単層は完全に任意の孔なしで形成されなければならない。さらに、TJとAJの正確な形成は、細胞接触が確立された後にいくつかの時間を必要とします。通常、上皮細胞は、細胞がそれが細胞の増殖の別の日を与えるために、通常、良好であるように、コンフルエントな単層に増殖して停止することを意味し、接触阻害される。この接触阻害が不定ではなく、細胞がいくつかの点で互いに過増殖し始めることができるので、これは、展開されるべきではない。これが観察された場合には、分割したり、ディスクすることが必要であるARDの細胞ではないがアッセイでそれらを使用しています。タイト上皮単層の形成は、最高のTERを測定することによって制御される。しかし、これはかなり高価であるトランスウェルフィルターの成長を必要とする。良好な単分子層のために眼を開発するために、様々な細胞数を頒布した後、同じ培養形式で細胞増殖を比較するための実験経験の浅い人があってもよい。
宿主 - 寄生体相互作用アッセイのタイミングは、別の重要な要因である。相互作用の2分後、まだ上皮損傷は観察されないことができるがTJ分子ZO-1とのEhCPADH112の相互作用は、既に明らかであった。 TJ分解及びTERの低下（10本研究）に示すようしかし、30分の相互作用の後、重度の上皮損傷が観察された。これらのデータは、頂端上皮側との初期の相互作用は、接着剤の接触を緩め、その後に貢献するプロテアーゼのような他の分子の浸透を可能にするために必要であることを示唆している他のTJ、AJおよびデスモソーム分子の分解。栄養型タンパク質の濃度も重要である。ライブ栄養型または単に溶解物またはEの分泌生成物を適用する場合、注目すべきは、異なる結果を観察することができたアメーバ 。上皮細胞への栄養型の相対的な割合は、以前に10を証明したし、アメーバによるMDCK·ツー·分泌される副産物の比率は（1:10）高かった場合にも、上皮損傷は、深刻ではないでした。これは、単一の病原性タンパク質の濃度が非常に重要ですが、それはまた、アメーバの迅速な侵入を可能にするのに有効な上皮損傷につながる様々な要因の相互作用であることができることということではないだけを示しています。たとえば、Chadeeのグループは、上皮損傷16を引き出すために、他のアメーバ由来プロテアーゼ、EhCP5の重要性を強調した。これは、毒性因子の相互作用をin vivoでアメーバを誘導するために必要とされている可能性が高いようで、inhibitioによる行方不明相互作用すること単一のタンパク質のnは、ほとんどの場合、感染が静止状態にあるという事実を説明することができる。この点において、このようなムチンなどの上皮製品は感染を防御するのに重要であることに言及することも重要である。具体的には、ノックアウトマウスはEhCP5誘発性TJの変化と感染16の影響を受けやすいmucin2。従って、上皮側の改変はまた、アメーバ侵襲性を評価するために考慮される必要がある。
共局在を検出するために記載された技術の一つの重要な制限は、明確に直接的な相互作用を証明しないことである。この場合、共局在又は相互作用はまた、単に視覚化されていない別のタンパク質によって媒介され得る。直接的な相互作用を検出するために、組換え（例えば、GST又は10xHisなど）タグ付きタンパク質を生産し、他方用のタグおよびウェスタンブロットのために免疫沈降を行うことが必要であろう。とにかく、免疫蛍光染色は、EXAを明らかにするという利点を持っているCT細胞タンパク質複合体の場所と実験者にそのような相互作用のin vitroアッセイにおいて試験されるべきタンパク質のアイデアを与える。別の欠点は、利用可能な少数アメーバ特異的抗体が存在することである。一つは、このような相互作用の研究に一定アメーバタンパク質を研究したい場合従って、それは最も可能性の高い抗体の生成を必要とする。抗体が利用可能である場合は、記載される方法は、宿主 - 病原体相互作用のための他のアメーバタンパク質（分泌または表面結合）の関連性を研究するために適用することができる。
本稿では、ホストと寄生虫の分子間の共局在や相互作用を検出するための簡単なモデルについて説明します。これらの細胞ベースの実験から得られた知識は、寄生虫によってホスト侵入のための生理学的な関連性を裏付けるためにハムスターやマウスを用いたin vivo感染モデルで適用することができる。これらのデータは、次いで、新たな治療STRAの開発のために使用することができるtegies。
要約すると、我々は、 大腸菌を培養するための詳細なプロトコルを提供アメーバ特に宿主-病原体相互作用の研究、共局在およびTJ分解の評価を可能アッセイに使用する上皮細胞。文化のタイミングだけでなく、各アッセイのそれは、得られた結果の再現性を確保することが重要です。培養のタイミングが播種セル数を変えることによって影響を受けることができるが、実験自体のタイミングは、アッセイの種類、調査のタンパク質のタイプに依存する。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
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