Summary
Entamoeba 아메바에 의한 인체 감염은 아메바 증, 열대 국가에서 설사의 주요 원인으로 이어집니다. 감염은 세포 - 세포 연락처 개방 결과적으로 설사, 때때로 간 감염에 의해 다음 도발, 장 상피 세포와 병원체 상호 작용에 의해 시작됩니다. 이 문서는 아메바 증의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 개선하기 위해 초기 호스트 병원체 상호 작용을 평가하는 모델을 제공합니다.
Abstract
Entamoeba의 아메바는 인간의 아메바 증의 원인 물질, 열대 국가에서 설사와 간 농양의 주요 원인이다. 감염은 장 상피 세포와 병원체의 상호 작용에 의해 시작됩니다. 이러한 상호 작용은 꽉 접합 (TJ)로 세포 간 구조의 붕괴로 연결됩니다. TJ는 창자 루멘에서 호스트 조직을 분리하는 상피 층의 밀봉을 보장합니다. 최근의 연구에 기생 단백질 EhCPADH112으로 TJ의 중단이 E.의 전제 조건임을 증거를 제공 상피 장벽 기능 장애를 동반 아메바 침공. 따라서, E. 동안 TJ 분해에 관련된 분자 메커니즘의 분석 아메바 침공은 아메바 증의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 개선하기 위해 매우 중요합니다. 이 문서에서는 초기 호스트 병원체 상호 작용의 평가 및 기생충의 침입 가능성을 확인하기 쉬운 모델을 제시한다. 분석 할 매개 변수 T를 포함ransepithelial 전기 저항, 상피 세포 표면 수용체, 표현의 변화와 상피 접합부 마커 및 상피 세포 내 기생충 분자의 현지화 현지화와 EhCPADH112의 상호 작용.
Introduction
Entamoeba의 아메바는 염증과 설사. E.의 원인이 인간의 아메바 증, 장 감염의 책임있는 단일 셀의 원생 동물이다 아메바는 연간 5000 만 개인에게까지 감염 있지만, 감염된 사람의 약 10 %는 아메바 증 1에 관련된 증상을 개발할 수 있습니다. 감염 E를 포함하는 오염 된 음식이나 물을 섭취에 발생 아메바 포낭. 소장에서, 낭종은 결장 점액을 준수하고 2 증식 라이브 trophozoites을 생산하고 있습니다. Trophozoites은 일반적으로 대변을 통해 배설된다 낭종을 형성한다. 다른 경우 아직 알 수없는 이유로, trophozoites는 장 상피 층을 중단하고 기본 조직을 공격. 최악의 경우에, 그들은 혈류를 입력하고 3 간 등의 다른 장기에 영향을 미친다.
상피 장벽을 깨고 합류 세포를 유지 상피 transmembranal 구조의 중단을 요구합니다. 상피 세포연락처 타이트 (TJ)로 구성된 정점 접합부 복합체 형성 및 접합 (AJ)에있는 adherens, 4를 데즈 모섬 있습니다. 가장 꼭대기 접합 TJ 있으며, 따라서 이들은 E. 의해 상하게 제 베리어 호스트 침입 동안 아메바와 다른 병원균. TJ는 같은 인접 셀의 수용체와 호모 또는 heterophilic 상호 작용에 관여 claudins, occludin 및 접합부 접착 분자 (JAM)로 transmembranal 접착 수용체로 구성되어 있습니다. 그들은 세포 내 상피 세포에 더 기계적 강도를 제공하는 굴지의 골격에 부착 수용체를 연결 (ZO) 가족 zonula의 occludens의 발판 분자에 의해 바인딩됩니다. TJ는 과도한 물과 용질의 누설을 방지, 창자 루멘에서 장 조직을 밀봉 할 책임이 있습니다. TJ는 기생충에 의해 중단 된 후 따라서, 조직은 침략있다. E. (I) TARG에 아메바의 접착에 관련된 사람들 : 아메바 같은 다양한 분자를 분비등의 셀 (5); 세포 외 유출에 의해 숙주 세포의 살해에 참여하는 (ⅱ) 막 - 활성 인자, 예를 들어 칭했다 이온 채널 형성 펩티드 6,7 amoebapores; 그리고 (iii) 세포 외 매트릭스 단백질을 분해 및 조직 붕괴 5,8,9을 중재 단백.
함께 EhCPADH112 착체를 형성 시스테인 프로테아제 EhCP112 및 유착 분자 EhADH112 두 E. 아르 아메바 TJ (10)의 분해에 중요한 역할을하는 단백질을 독성. 라이브 trophozoites, 자신의 총 해물과 분비 제품은 상피 장벽의 TJ 복잡하고 기능 장애의 분자 변화를 유도한다. 이 연구에서, EhCP112 및 EhADH112 따라서 E.에게 용이 occludin 내면화하고 세포 단백질의 저하로 이어지는 claudin-1 단백질과 상호 작용하는 것을 알 수있다 세포층의 경로를 통해 아메바 입구.
우리의 데이터와 그 오F 다른 그룹 11-17 강력 기생충의 침입을 허용 특정 호스트 병원체 상호 작용의 필요성을 제안합니다. 이러한 상호 작용의 분자 기초를 이루는 것은 아메바 증의 발병 기전에 대한 이해를 위해 가장 중요합니다. 증가 된 세포층의 투과성을 특징 trophozoites 의해 TJ의 선택적 교란, transepithelial 전기 저항의 감소 (TER)에 의해 측정 될 수있다. 호스트 상피으로 기생 단백질의 전이는 면역 형광 염색과 공 초점 레이저 현미경도 가능 직접 상호 작용을 나타내는 상피 접합부 마커 아메바 독성 요인의 공동 현지화를 공개 할 수있는 방법으로 측정 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 상피 세포와 trophozoites가 재배 수확 및 호스트 병원체 상호 작용과 그 영향을 검토하기 위해 조작하는 방법을 자세히 설명합니다.
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Protocol
E. 1. 구축 및 유지 아메바 문화
- (다른 오염 생물의 전체 무료) axenically 성장 Entamoeba 아메바 균주 HML의 1 × 10 5 trophozoites : IMSS는 테프론 라이너 스크류 캡 (또는있는 일회용 T-1 × 10 6 trophozoites와 18 125 X 16 MM 문화 튜브를 복제 25 플라스크) 15 ㎖ (또는 TYI-S-33 매체의 T-25 플라스크에 50 ㎖) (TYI 국물이 3 % 다이아몬드 비타민 혼합물, 10 %의 열 불 활성화 성인 소 혈청, 0.5 IU / ㎖ 페니실린, 35 μg로 보충 / ㎖, 37 ℃에서 인큐베이터에 스트렙토 마이신) 19
- 48-96 시간 간격으로 통상 대수 증식기 유리 배양 관에 부착 trophozoites를 해제 빙수 욕에서 50-10 분 동안 배양 튜브 얌전 순서 (도 1) 동안 수확 trophozoites.
- 원뿔 튜브에 문화를 전송하고 CEL을 분산하도록 여러 번 반전LS. 혈구 (Neubauer의 챔버)를 사용하여 세포 수를 결정하고 신선한 TYI-S-33의 매체를 포함하는 문화 튜브에 접종을 전송합니다.
- 더 이상 부화 기간 (~ 5 일 동안 ~ 3 × 10 5 세포) 짧은 기간 동안 높은 숫자 (1 ~ 하루 ~ 1 × 10 6 세포)에 아메바의 낮은 숫자를 사용합니다. 계산 접종이 바람직하지만 접종의 예상 볼륨이 실현되도록 수립 문화가 예측된다.
- 각 실험에 대한 세포 수를 최적화하는 trophozoites의 양을 적정한다.
- 부주의로 오염이나 튜브 파손의 경우 백업을 가지고 병렬 중복 문화를 유지한다.
- 캡 튜브는 단단하고 수평 각도를 기울이면 5 °에서 37 ° C에서 그들을 품어.
- 문화의 과도한 성장이 많은 용해 세포를 포함 할 수 있기 때문에, 정기적으로 육안 검사에 의해 문화를 확인합니다.
MDCK 문화 2. 구축 및 유지 </ P>
- (Madin 다비 송곳니 신장) 세포 / 0.08 U (인슐린, 페니실린 (100 IU / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎎ / ㎖)와 보충 DMEM 매체 10 ㎖로 처분 할 수있는 T-75 플라스크에 I (고 저항)를 입력 MDCK 성장 37 ° C에서 5 % CO 2, 95 % 공기의 가습 분위기 ㎖)과 10 %의 신생아 혈청
- 셀을 분할하려면, 거꾸로 현미경에 그 (것)들을 검사한다. 그들은 ~ 85-100% 합류 할 때 셀을 분할합니다.
- 멸균 후드와 문화에서 미디어를 제거하는 멸균 유리 파스퇴르 피펫에 진공 흡입기를 사용합니다. 세포를 긁어 피하려면, 하단 모서리에서 거꾸로 플라스크 대기음 미디어를 켭니다.
- T-25 플라스크의 경우 (5 ㎖ T-75 플라스크에 데워진 PBS (140 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4, 산도 7.4) 10 ㎖를 분배 ) 부드럽게 세포를 씻어 플라스크 바위. 진공 흡인에 의해 PBS를 제거합니다. 혈청, 트립신을 억제하기 때문에 광범위한 세척이 필요합니다.
- (T-25 플라스크에 0.5 ㎖를 사용)과 부드럽게 트립신 전지 층을 덮도록 플라스크를 흔들 T-75 플라스크에 0.05 % 트립신 1.5ml의 디스펜스.
- 인큐베이터에서 5 ~ 10 분 (정확한 시간은 트립신의 활동에 따라 다름)에 품어.
- 빛에 술병을 들고으로 전지의 분리를 확인하고 세포를 흐르는 찾는다. 세포 분리 (반올림 세포)도 현미경을 사용하여 확인할 수 있습니다. 종종 세포가 플라스크의 측면에 빠르고 부드러운 때리고과 빠른 놓습니다.
- T-75 플라스크 (T-25 플라스크에 대한 5 ㎖)을 보충 DMEM 15 ML을 추가합니다. 로 pipetting 아래로 4 ~ 5 배 세포를 Resuspend.
- 세포를 전파하기 위해, 신선한 DMEM 배지와 세포 현탁액 1:5 희석. 세포 수는 혈구 계를 사용하여이 지점에서 결정될 수 있지만, 특정 분석을위한 특별한 형식으로 세포를 분리하는 경우이 보통 단지 필요하다.
Trophozoite 총 해물 3. 준비
- CU에서 trophozoites를 분리빙수 욕에서 5-10 분 동안 튜브를 얌전 의해 LTURE 튜브. 4 ℃에서 10 분 동안 360 XG에서 원뿔 튜브와 원심 분리기로 문화 무균 이동 조심스럽게, 경사 분리하여 상층 액을 버린다 펠릿에 얼음처럼 차가운 PBS를 추가, 10 분 동안 360 XG에서 다시 세포와 원심 분리기를 분산하기 위해 튜브를 여러 번 반전. TYI-S-33 매체의 모든 흔적을 제거하기 위해 두 번이 단계를 반복합니다.
- 혈구를 사용하여 trophozoites 번호를 확인합니다.
- 를 Lyse 동결 해동 사이클에 의해 trophozoites. 1 분 동안 액체 질소에, 얼음처럼 차가운 PBS에 희석 trophozoites의 측정 접종 (60 trophozoites / ㎖)를 스냅 동결. 적극적으로 4 ° C와 소용돌이에서 샘플을 녹여. 세포 용해를 완료하기 위해 동결 융해 3 번 반복합니다.
- 0.02 %의 β-머 캅토 에탄올로 용해 액에 존재하는 단백질 분해 효소를 활성화합니다.
Trophozoite 분비 제품 4. 준비
- 단계 3.2에 3.1를 수행합니다.
- 결정혈구를 사용하고 트리 판 블루 배제 테스트 (20)를 적용하는 시점에서 세포 수 및 생존력 :
- 50 ML 원뿔 관에 9 × 10 6 3 ML 얼음처럼 차가운 PBS에 trophozoites 및 전송 세포를 희석. 현탁액의 10 μl를 타고 0.4 % 트리 판 블루 stock 용액의 pH 7.2의 1 μl를 추가합니다.
- 낮은 배율로 세포를 계산하는 Neubauer의 챔버를 사용합니다.
- 모든 셀을 계산하고 푸른 세포가 색소를 촬영하고 죽은 것으로 간주해야하기 때문에, 파란색 셀의 수를 구분합니다.
- 셀의 전체 개수에 의해 생존 세포의 수를 나누어 100을 곱함으로써 생존 세포의 백분율을 계산한다.
- 수평 각도를 기울이면 5 °에서 2 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 trophozoite 서스펜션을 포함하는 원뿔 튜브를 전송합니다.
- 10 분 360 XG에서 분비 된 제품, 원심 분리기 튜브를 수집합니다. 일회용 멸균 주사기를 사용하여 조심스럽게 SU에게 수집맑은 상등, 펠릿으로부터 trophozoites과 시료의 오염을 방지. 0.22 μm의 셀룰로오스 아세테이트 막을 통해 뜨는을 전달하여 어떤 전송 세포를 제거합니다. 0.02 %의 β-머 캅토 에탄올과 단백질 분해 효소를 활성화합니다.
- 죽은 세포에서 방출 분자와 추정 원하지 않는 오염을 버리고, 세포 생존 능력의 트리 판 블루 배제 시험을 다시 적용합니다. 4.2 단계에서 얻어진 세포의 생존과 총 수는 동일해야합니다. 이 경우가 아니라면, 수집 된 상등액을 포함하는 단백질을 분비 할 수뿐만 아니라 폐기되어야한다.
Trophozoites, Trophozoite 해물 또는 분비 제품과 MDCK 세포의 5. 상호 작용
- 라이브 trophozoites (1:1의 MDCK - 투 - 아메바 비율)에 합류 MDCK 세포 단일 층을 품어, trophozoite 해물 (MDCK - 투 - 아메바 1:2 비율) 또는 분비 제품 (1 MDCK - 투 - 아메바 비율 : 10) 2 30 분 (그림 2A) 37 ° C에서.
- 언 바운드 분자 또는 trophozoites을 제거하기 위해 얼음처럼 차가운 PBS와 상피 세포 다섯 번 씻으십시오.
면역 형광 검사를위한 샘플 6. 준비
- 24 멀티 웰 세포 배양 접시 안에 배치 멸균 유리 커버 슬립에 문화 MDCK 세포. 그들이 합류의 100 %에 도달 할 때까지 거꾸로 현미경의 세포를 검사합니다. 그런 다음, 신선한 보충 DMEM 배지 1 ml의 매체를 대체하고 더 24 시간 동안 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다.
- 진공 흡입기 및 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체를 제거하고 각 웰에 따뜻한 PBS 1 ㎖를 추가합니다. PBS를 제거하고 신선한 PBS로 세척을 반복합니다. 유리 피펫 우물의 바닥에서 세포가 긁히지 않도록주의하십시오.
- 라이브 trophozoites (T), trophozoite 총 해물 (TL)과 분비 제품 (SP) : 따뜻한 PBS 1 ㎖에 희석 trophozoites의 다른 조건을 추가합니다.
- 2 또는 30 분 동안 인큐베이터에서 배양 플레이트를 넣습니다.
- MDCK 세포가 E.와 함께 배양해야하는지 하나라는 시간 0 분, 두 개의 제어 조건을 준비 아메바하지만 따뜻한 PBS 1 ㎖와; 이 경우 이차 항체 제어와 같은 다른 조건은 2 또는 30 분 동안 T, TL 또는 SP와 MDCK을 배양하고 기본 항체와 부화를 생략합니다.
- 언 바운드 분자 또는 trophozoites을 제거하기 위해 차가운 PBS와 상피 세포 다섯 번 씻으십시오.
- 수정 및 C. -20 °에서 30 분 동안 96 % 에탄올 1 ㎖로 세포를 투과
- 에탄올을 제거하려면, 실온에서 1 ㎖의 PBS로 3 빠른 세척을 수행합니다.
- 시료의 건조를 방지하기 위해 습한 챔버에서 다음 단계를 수행
- 폐쇄 및 샘플을 안전하게 배치 할 수있는 젖은 종이 타월로 가득 수 있습니다 가능한 평면 상자를 사용합니다. 예를 들어, 빈 피펫 팁 상자가 아니라이 목적을 제공합니다.
- 챔버 내부에 균일하게 파라 필름 층과 피펫 블록의 25 μl를 배치각 coverslip에 대한 솔루션 (0.5 % BSA)을 주입.
- 미세 집게와 우물 밖으로 커버 슬립을 조심스럽게 여과지 가장자리에서 물기를 제거하고 세포가 차단 솔루션을 향 차단 솔루션 (0.5 % BSA)을 포함하는 드롭에 커버 슬립을 넣어. 실온에서 1 시간 동안 샘플을 배양한다.
- PBS의 기본 항체의 혼합물을 준비 IgM 항체 마우스 방지 EhCPADH112 (mα-EhCPADH112 1:10 희석)와 IgG의 토끼 반 ZO-1 (Pα-ZO-1, 1:100 희석).
- 습기 상자와 펫 각 coverslip에 대한 항체 용액 25 μL에서 파라 필름의 신선한 시트를 놓습니다.
- 블로킹 용액으로부터 커버 슬립을 올리고 여과지를 이용하여 에지에서 과도한 액체를 건조하고, 세포가 항체 용액을 향하게 알갱이에 넣지. 4 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어
- (상단에 셀 측) 24 멀티 웰의 우물에 각 coverslip에 넣어 1 ㎖의 PBS를 추가합니다.
- FITC 결합 염소 항 - 마우스 IgM 항체 (1:100 희석) 및 TRITC (1시 50분 희석)에 결합 된 염소 항 - IgG의 토끼 : PBS의 형광 차 항체의 혼합물을 준비합니다.
- 습기 상자와 펫 각 coverslip에 대한 이차 항체 용액 25 μL로 파라 필름의 신선한 시트를 놓습니다.
- 6.10에서와 같이 샘플을 전송하고 형광 염료의 탈색을 방지하기 위해 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 6.11.1 단계를 반복합니다.
- 핵 염색의 경우, 상온에서 0.05 ㎜ DAPI 용액 200 ㎕를 3 분 동안 부화와 빛으로부터 보호합니다. 6.11.1 단계를 반복합니다.
- 형광 염료를 절약 Vecta 방패 유리 현미경 슬라이드에 장착 솔루션을 antifade 5 μL로 커버 슬립 (세포가 아래로 향하게)을 배치합니다. 샘플 건조를 방지하기 위해 매니큐어를 사용하는 커버 전표를 밀봉.
- 장기 기억,에 슬라이드를 계속-20 ° C에서 현미경 슬라이드 상자
- Z-스택 섹션과 XZ-평면 (그림 2A)를 통해 공 초점 현미경으로 준비를 분석합니다.
프로테아제 억제제 또는 특정 항체와 Trophozoites 7. 보육
- 반복 3.2 3.1 단계를 반복합니다. 각 실험 조건의 경우, 4에서 20 분 동안 단백질 분해 효소 (전체 1 ㎜ 및 40 ㎍ / ㎖의 E-64) 억제제 또는 EhCPADH112 (mαEhCPADH112)에 30 μg의 단일 클론 항체 (21) (50 ㎕의 PBS에 재현 탁) 1 × 10 5 trophozoites을 품어 ° C (그림 2B). 단계 8.5에서 설명한대로 공동 배양 분석을 위해 이러한 준비를 사용합니다.
8. Transepithelial 전기 저항의 측정 (TER)
- 멸균 트랜스 웰 투과 지원 (0.4 μm의 기공 크기)에 문화 MDCK 세포. 상부 구획에서, 100 ㎕의 세포 현탁액 및 하부 구획에 배치보충 DMEM 배지 600 μl를 놓습니다.
- 주기적으로 중간 수준을 확인합니다. 필요에 따라 새로운 매체를 추가 할 수 있습니다.
- 그들이 합류의 100 %에 도달 할 때까지 거꾸로 현미경의 세포를 검사합니다. 2-3 일마다 중간 변경합니다.
- 세포 부착 (필요한 경우)을 개선하기 위해, 세포 현탁액을 추가하기 전에 DMEM에서 37 ° C에서 하룻밤 트랜스 웰 필터를 평형.
- 에탄올에 침지 후드 STX2 전극을 소독하고 멸균 PBS에서 UV 빛 아래 15 분 각각에 대한. EVOM 상피 voltohmmeter에 전극을 연결하고 저항 모드를 선택합니다.
- 각 트랜스 웰의 상부 구획에서 매체를 수집하고이를 풀. 이 미디어 혼합물의 50 μl를 타고 trophozoites 현탁액 50 μL (PBS에 1 × 10 5 trophozoites) 또는 만 PBS (대조군)와 결합. 각 트랜스 웰의 유사한 혼합물을 사용합니다.
- 각 트랜스 웰의 containin의 상부 챔버에 혼합물을 추가G MDCK 세포. 실험 조건은 trophozoites (제어)없이 trophozoites 또는 단백 분해 효소 억제제 또는 mαEhCPADH112 사전 배양 trophozoites와 공동 문화를 MDCK 세포를 포함한다. 필터에 의해 제공되는 저항을 제거하기 위해, 단지 배지로 배양 트랜스 웰을 사용한다. 각 실험 조건은 적어도 세 개의 트랜스 웰하십시오.
- 즉시, 각 트랜스 웰에 STX2 전극을 찍기 TER을 측정합니다.
- 긴 전극이 하부 챔버의 바닥을 만지고 짧은 전극 (그림 2B 참조) 상부 구획 중간에 포함되어 있는지 확인합니다.
- 마다 수직으로 전극을 보유해야합니다. 이것은 크게, 재현성을 향상시킬 것입니다. 이 데이터의 변화로 이어질 것으로 이동하거나 측정하는 동안 전극을 기울 마십시오.
- 이 측정은 초기 TER 값으로 간주해야한다. 그 후, 다음 과정을 모니터링 TER30 분.
- TER 최종 값을 계산하기 위해, 전용 필터의 TER 값을 뺀다. 다른 실험에서 결과를 비교하려면 100 % (그림 2B)로 다음을 고려하여 초기 값으로 각 데이터 포인트를 정상화.
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Representative Results
성공적인 E.에 대한 아메바의 문화는 중요한 두 가지 조건이 충족되어야합니다 로그 단계에서 무균 조건과 수확의 성장. E.의 이전, 문화 아메바는 쉽게 세균이나 trypanosomatids 22의 특정 종과 공동으로 설립되었다. 그러나, 요즘은 대사 박테리아, 곰팡이, 원생 동물, 또는 후생 동물 세포없는 환경에있는 아메바의 무기한 subcultivation을 의미하는이 기생충의 무균 재배를하는 것이 일반적입니다. 또한, 성장의 초기 고정 단계 후반 대수 동안 trophozoites를 수확하는 것은 생존과 증식 세포의 23을 가지고 매우 중요합니다. 따라서, 몇 일을 따라 또한 그들의 본래 형태와 급속한 운동 (도 1)을 검사하여 trophozoites 정량화하여이 단계를 구분하는 것이 중요하다.
상호 작용 연구의 경우, 상피 세포는해야아메바는 일반적으로 체내에서 발생하는 것 생리적 조건을 나타내는 합류 단층에. 재배하기 쉽고 여러 상피 세포 라인은, 사용할 수 있습니다. 더 생리적 셀 모델 시스템은 그러한 된 Caco-2 또는 T84 같은 장내에서 파생 것이지만, 이러한 세포주보다는 느리게 성장한다. 광범위하게 연구 된 빠른 성장 세포주 MDCK 세포 (24)이다. 이 상피 세포는 신장 기원하고 높은 TER, 강한 TJ 쉽게 재배 특징으로하고 있습니다. 이 세포주는 세포 접합 및 TJ 조성 생물학뿐만 아니라 TJ의 조립 및 분해의 메커니즘을 연구하기 위해 수십 년 동안 사용되어왔다. TJ 기능을 연구 할 때 이러한 이유로, MDCK 세포는 종종 연구자에 의해 선택된다. MDCK 세포는 또한 널리 아메바 증 5,8,10,25-28 동안 유도 메커니즘의 연구를위한 모델로 사용되어왔다. 최근 연구에 따르면, 우리는 긴장의 상호 작용 내가 L로 세포와 장 상피 된 Caco-2 세포를 MDCK보고필자의 아메바, 해물과 아메바 제품은 TJ 조성과 TER 10 유사한 효과를 발생. 따라서, MDCK 세포는 아메바 상피 상호 작용의 메커니즘을 연구하기에 적합한 모델이다. 또한, 몇개의 E. 사용 아메바 제품 (그대로 trophozoites, trophozoite 총 해물 또는 trophozoites 배양액으로 수확 분비 제품) 등의 가용성, 액션, 분비, 다른 분자의 참여 모드의 트리거로 이러한 상호 작용에 관련된 분자에 대한 추가 및 관련 정보를 제공하는 데있어 매우 중요합니다 신호 전달 경로를.
포화 상태에 도달하는 동안, 상피 세포는 TJ와 AJ가 안정화 연락처를 형성한다. 이러한 구조는 면역 형광 염색에 특정 항체를 사용하여 시각화 할 수있는 특정 분자로 구성되어 있습니다. 예를 들어,도 3에서, 셀 접점은 TJ 마커 ZO-1 및 적색 형광 랩에 대한 항체로 시각화이차 항체를 eled. 이 알 수있는 바와 같이, 셀은 어떤 구멍이없는 치밀한 단분자막을 형성하는 근접 모인다. 이 그림에서, 아메바 파생 된 복합 EhCPADH112는 상피 표면이 복잡한의 상호 작용을 연구하기 위해 녹색 형광 표지 된 이차 항체에 의해 검출되는 단일 클론 항체를 사용하여 염색하고 있습니다. 이 단지의 세 가지 다른 소스는 상피 세포 단일 층에 적용된 : 라이브 trophozoites (T), trophozoite 총 해물 (TL)과 분비 제품 (SP). 놀랍게도, 모든 경우에, ZO-1 EhCPADH112의 공동 현지화이 복잡한 E.에게 용이하게하기 위해 요구 될 수 있음을 나타냅니다 (그림 3, 화살표)을 관찰 할 수있다 상피 세포 단일 층에 아메바 침투.
이 상호 작용이 이미 조기 아메바 상피 세포 접촉 후 2 분으로 관찰 할 수 있지만, ZO-1 염색은 여전히 C를 보인다 이후, 셀 층은 아직이 상호 작용에 의해 영향을받지 않는다연속 형. 도 4에 도시 된 바와 같이이 완전히 긴 배양 시간 후에 변경한다. 여기서, 이미지는 세 가지 EhCPADH112 소스에 노출 30 분 후 촬영 하였다. TJ의 명확한 중단은 가장 분명 효과가 T 또는 TL과 접촉 MDCK 세포에서 발생과 함께, 셀 경계에서 불연속 ZO-1 염색 (그림 4, 화살표)에 의해 가시화된다. 대조적으로, ZO-1 내면화되는 세포 내 소포를 볼 수 있습니다. 측면 세포막을 따라 TJ 또는 AJ 하나와 정확한 공동 현지화은 단일 층의 상부에보고 오히려 세포 연락처 (29)의 "면"뷰를 획득하여 구별 할 수 없습니다. 공 초점 레이저 현미경은 그림 3과 각 XY보기 아래 4에서와 같이 XZ-축을 따라 같은보기를 할 수 있습니다. 이러한 이미지들은 오히려있는 경우 단백질이 횡 막의 가장 꼭대기 부에서 TJ와 공동 지역화 여부를 명확 문을 보여TJ 아래 또는 TJ 위의 정점 막에서. 그림 3 (화살촉), ZO-1 EhCPADH112 단지의 정확한 공동 지역화 명확 독성 인자를위한 활동의 장소로 TJ를 공개, 관찰 할 수있다. 대조적으로, E. 등보기 가로 막 따라 염색 (그림 4, 화살촉)를 켰을 때, 아메바의 침공이 상피에 (상호 작용 30 분) 진행, EhCPADH112는 세포 간 공간을 향해 침투. 이 단지는 TJ가 아니라 상호 작용 (10)의 2 분의 AJ 마커 β-catenin의와 occludin 및 claudin-1 마커와 공동 지역화하기 때문에 우리의 최근 논문에서,이 방법은 우리가 TJ와 AJ 구별 할 수있었습니다.
TJ 성분의 내재화는,도 4의 면역 형광 염색에에서 알 수있는 바와 같이, 보통 transepithelial 전기 저항 (TER)에 의해 측정 될 수있는 보호막 기능의 손실을 수반한다. TER상피 단층 걸쳐 이온의 흐름을 반영하는도 2b에 도시 된 바와 같이 전극을 사용하여 측정 할 수있다. 단층이 아직 완전하게 형성되거나 의한 세포 외 신호에 방해되지 않을 때, 셀 층에 걸쳐 이온의 자유 유동은 낮은 TER에 의해 지시된다. TER은 아메바 제품 또는 단층 trophozoites 접촉 (그림 5)와 접촉되지 않은 제어 합류 단층으로 측정 하였다. 기생충 접촉 제어 단층에 비해 90 %의 TER 드롭으로 표시 상피 장벽 기능을 방해. trophozoites이 장벽 기능에 영향을하는 메카니즘을 조사하기 위해, 우리는 표적 세포 손상에 대한 중요한이 복잡하고 다른 프로테아제의 단백질 가수 분해 활성을 차단하는,이 복합 또는 프로테아제 억제제와의 접착을 방지하기 EhCPADH112 대한 항체 trophozoites 사전 인큐베이션. 두 치료는 제안, TER 드롭의 거의 완전한 반전을 주도하는 단백질 분해 모두 활동 및 접착 특성은 E. 동안이 단지의 중요한 독성 요인 아메바 침공.
그림 1. axenically 재배 E.의 전형적인 성장 곡선 E.의 2 × 10 5 trophozoites의 아메바의 trophozoites. 접종 아메바 HMI-IMSS 클론은 TYI-S-33 배지로 6 - 잘 접시에 성장하고, 각 24 시간의 세포 수를 후 hematocytomer를 사용하여 측정 하였다. 세포 성장은 상단 패널에 묘사되어 성장하는 세포의 광학 현미경과 형태에 의해 감시되었다. trophozoites의 양은 6 일 (D)에 대해 모니터링하고, 값은 아래 차트에 그려진했다. 데이터는 평균과 세 개의 독립적 인 측정의 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 바 = 10 μm의./ www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MDCK 세포와 E.의 다른 조건들 사이의 상호 작용 그림 2. 도식 표현 E.의 아메바.) 다른 조건 아메바가 표시됩니다 : 라이브 trophozoites (T), 총 trophozoites 용 해물 (TL)과 매체 (SP)에 trophozoites 분비 분자를. 어떤 실험 조건은 합류 MDCK 세포와 배양이 30 분 동안 측정 하였다. 배양 후, MDCK 세포가 풍부하게 trophozoites 또는 언 바운드 기생 분자를 제거하는 세척 하였다. 다음 샘플은 mαEhCPADH112 및 pαZO-1 antibod을 사용, 면역 형광 분석을 위해 처리 된이거 각각 공동 지역화 기생 복잡한 EhCPADH112와 TJ 마커 ZO-1에. trophozoites 이후, 다른 형광 색소에 결합 종 특이 차 항체는 공 초점 현미경으로 두 단백질을 감지하는 데 사용되었다. B) 추가 전용 또는 trophozoites 트랜스 웰의 상부 구획에 4 ° C에서 mαEhCPADH112 20 분 단백 분해 효소 억제제와 미리 배양 융합 성 MDCK 세포를 함유. 상피 세포의 TER는 30 분 동안 EVOM의 voltohmeter에 연결 STX2 전극을 사용하여 모니터링 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MDCK 단일 층의 TJ에서 EhCPADH112의 그림 3. 현지화. MDCK 세포를 인큐되었습니다라이브 trophozoites (T), 총 trophozoites 용 해물 (TL)과 2 분의 매체 (SP)에 trophozoites에 의해 분비되는 분자와 괴롭게 하는군. 상단 패널 : MDCK 세포의 위상 콘트라스트 이미지. EhCPADH112과 ZO-1 단백질은 mαEhCPADH112 및 pαZO-1 항체에 의해 식별 된 후 각각 FITC와 TRITC 이차 항체와. 핵은 DAPI로 염색 하였다. 화살표 : 셀 테두리에서 단백질 지방화. XZ-평면에서 화살촉 : TJ의 단백질 지방화. 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MDCK 세포로 EhCPADH112의 그림 4. 국제화. MDCK 세포는 라이브 trophozoites (T), 총 trophozoites 용 해물 (T와 함께 배양 하였다L) 및 30 분 동안 배지 (SP)에 의해 분비 trophozoites 분자. 상단 패널 : MDCK 세포의 위상 콘트라스트 이미지. EhCPADH112과 ZO-1 단백질은 mαEhCPADH112 및 pαZO-1 항체에 의해 식별 된 후 각각 FITC와 TRITC 이차 항체와. 핵은 DAPI로 염색 하였다. 화살표 : 셀 테두리에서 단백질 지방화. XZ-평면에서 화살촉 : 측면 막 (화살촉)에서 단백질 지방화. 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. E. EhCPADH112를 통해 아메바는 상피 장벽의 붕괴를 유도한다. MDCK 단층이 라이브 trophozoites으로 배양 하였다(T) 또는 T는 30 분, TER가 지정된 시간에 평가 하였다 위해 단백질 분해 효소 억제제 (PI) 또는 mαEhCPADH112 항체 (α)를 미리 배양 하였다. TER 각 트랜스 웰의 초기 값에 따라 표준화 하였다 (~ 3200 Ω · cm 2). 수단의 수단 및 표준 오차를 각 시점에 대해 표현된다. 통계 학적 분석은 일방향 ANOVA test로 그래프 패드 프리즘 5 소프트웨어로 수행 하였다. *** P <0.001.
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Discussion
E.에 의해 상피 감염 동안 체외 호스트 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 아메바, 그것은 상피 세포와 trophozoites 모두의 잘 확립 된 문화와 함께 작동하는 데있어 매우 중요합니다. 예를 들어, 이전의, E. 아메바의 문화는 일반적으로 세균이나 trypanosomatids (22, 23)의 특정 종과 공동으로 설립했다. E.의 그러나 공동 재배 숙주 세포에서 관찰 된 효과가 명백하게 ameobas에 기인 할 수없는 것이 아니라 공동 배양 세포의 효과가 될 수 있기 때문에 아메바 문화 호스트 병원체 상호 작용의 연구에 대한 역효과. 따라서, E.의 axenical 문화 아메바는 특정 호스트 병원체 상호 작용의 조사를 위해 바람직하다. 제공되는 프로토콜은 방법을 설명 E. 같은 무균 재배 아메바는 특히 감염 연구에 대한 이러한 문화를 악용 달성 할 수있다. 또한, 타이밍E.의 수확 아메바도 중요합니다. E. 아메바 수확 높은 생존 능력을 가진 세포의 높은 수율을 보장하기 위해 기하 급수적 인 성장의 후반 단계에서하는 것이 좋습니다.
한편, 상피 세포의 노포 단분자층 재현 가능한 결과를 구하는 것이 또한 필수적이다. 생리 학적으로 꽉 상피 단층을 모방하기 위해, 배양 된 세포는 정확한 타이밍에 사용할 수 있어야합니다. 단일 층은 완전히 어떤 구멍없이 형성 할 수있다. 또한, TJ와 AJ의 올바른 형성은 세포 연락처가 설립 된 후 약간의 시간이 필요합니다. 보통, 상피 세포는 세포가 세포에게 성장의 또 다른 하루를 제공하는 것이 더 좋습니다 있도록 합류 단층의 확산을 중지 즉, 접촉 금지합니다. 그러나,이 접촉 억제가 부정되지 않고 세포가 어떤 점에서 서로 자라다하기 시작할 수 있기 때문에 팽창되어서는 안된다. 이 관찰되는 경우에는 분할하거나 디스크에 필요한 것ARD 세포되지는 분석에서 사용. 타이트 상피 단층의 형성은 유용한 정보 TER을 측정함으로써 제어된다. 그러나, 이것은 다소 비싸다 트랜스 웰 필터의 성장을 필요로한다. 좋은 단층에 대한 눈을 개발하기 위해 각종 세포 수를 전파 한 후 동일한 재배 형식으로 세포 성장을 비교하는 경험이 실험을 위해 도움이 될 수 있습니다.
호스트 기생충 상호 작용 분석의 타이밍은 또 다른 중요한 인자이다. 상호 작용의 2 분 후에, 더 상피 손상이 관찰 될 수 있지만, TJ 분자 ZO-1 EhCPADH112의 상호 작용은 이미 분명했다. TJ 분해 TER의 방울 (도 10 및 본 연구)로 나타낸 바와 그러나, 30 분 후에 작용 심한 상피 손상이 관찰되었다. 이 데이터는 혀끝 상피면 초기 접착 상호 작용이 연락처를 느슨하게 한 다음에 기여하는 등의 단백질 분해 효소와 같은 다른 분자의 침투를 허용 할 필요가 있다고 제안다른 TJ, AJ와 desmosome 분자의 분해. trophozoites 단백질의 농도는 중요하다. 라이브 trophozoites하거나 해물 또는 E의 분비 제품을 적용 할 때 참고로, 다른 결과가 관찰 될 수있다 아메바. 상피 세포 trophozoites의 상대적 비율은 이전에 10을 입증하고 아메바 의해 MDCK 투 분비 생성물의 비율 (1시 10분) 높았다 때에도 상피 손상은 심각하지 않았다. 이는 단일 독성 단백질의 농도가 중요하지만, 또한 아메바의 급속한 침입을 허용하는 효과적인 상피 손상 다양한 인자의 상호 작용이 될 수 있다는 것이 아니라 나타낸다. 예를 들어, Chadee의 그룹은 상피의 손상 (16)을 유도하기 위해, 다른 아메바 유래 단백질 분해 효소, EhCP5의 중요성을 강조했다. 그것은 독성 요인의 상호 작용이 아메바 증을 유발하는 데 필요한 생체 내에서하고 있다는 것을 보인다 inhibitio로 인해 누락 된 상호 작용단일 단백질의 N은 대부분의 경우에 감염이 무부하라는 사실을 고려있다. 이러한 관점에서, 이러한 상피 뮤신 같은 제품이 감염으로부터 보호하기 위해서 중요한 것은 말할 것도 또한 중요하다. 특히, 녹아웃 mucin2 마우스 EhCP5 유도 TJ의 변경 및 감염 (16)에 더 취약합니다. 따라서, 상피 측의 변경은 또한 아메바 침입 성을 평가하기 위해 고려되어야 할 필요가있다.
공동 지역화를 감지하는 기술 기술의 하나의 중요한 한계는 명확 직접적인 상호 작용을 증명하지 않습니다. 이 경우, 공동 지역화 또는 상호 작용은 단지 가시화되지 않는 또 다른 단백질에 의해 매개 될 수있다. 직접적인 상호 작용을 검출하기 위해, 재조합 (예컨대 GST 또는 10xHis 같이) 태그로 단백질을 생산하고 다른 하나의 태그 및 웨스턴 블롯에 대한 면역을 수행 할 필요가있을 것이다. 어쨌든, 면역 형광 염색에는 엑사을 드러내는 장점이있다CT 세포 단백질 복합체의 위치와 실험자에게 이러한 체외 상호 작용 분석에서 테스트해야합니다 단백질의 아이디어를 제공합니다. 또 다른 단점은 가능한 단 몇 아메바 특정 항체가 있다는 것입니다. 하나의 이러한 상호 작용의 연구에서 특정 아메바 단백질을 연구하기 원한다면 따라서, 그것이 가장 가능성이 항체의 생성을 필요로 할 것이다. 항체를 사용할 수있는 경우에는, 기술 된 방법은 호스트 병원체 상호 작용을위한 다른 아메바 단백질의 관련성 (분비 또는 표면 바인딩)을 연구하기 위해 적용될 수있다.
이 논문은 호스트와 기생충의 분자 사이의 공동 현지화 및 상호 작용을 쉽게 감지하는 모델을 설명합니다. 이러한 세포 기반 실험에서 얻은 지식은 기생충에 의해 호스트 침입에 대한 생리 학적 관련성을 확증하기 위해 햄스터 또는 마우스를 사용하여 생체 내 감염 모델에서 적용 할 수 있습니다. 이러한 데이터는 새로운 치료 스트라의 개발에 사용될 수tegies.
요약하면, 우리는 E. 양성을위한 상세한 프로토콜을 제공 아메바 특히 호스트 병원체 상호 작용 연구, 공동 현지화 및 TJ 분해의 평가를 허용 분석에 사용하기 위해 상피 세포. 문화의 타이밍뿐만 아니라 각 분석의 경우와는 얻어진 결과의 재현성을 보장하기 위해 매우 중요합니다. 배양의 타이밍이 전파 셀의 개수를 변화시킴으로써 영향을받을 수 있지만, 실험 그 자체의 타이밍 분석의 유형 및 조사 단백질의 종류에 따라 다르다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
