Summary
A infecção humana por Entamoeba histolytica leva a amebíase, uma das principais causas de diarréia em países tropicais. A infecção é iniciada pelo agente patogénico com as células epiteliais do intestino, provocando a abertura dos contactos célula-célula e, consequentemente, a diarreia, por vezes, seguido por uma infecção do fígado. Este artigo fornece um modelo para avaliar as interações patógeno-hospedeiro iniciais para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese.
Abstract
Entamoeba histolytica é o agente causador da amebíase humana, uma das principais causas de diarréia e abscesso hepático em países tropicais. A infecção inicia-se por interacção do agente patogénico com células epiteliais intestinais. Essa interação leva à ruptura das estruturas intercelulares, como junções apertadas (TJ). TJ garantir a vedação da camada epitelial para separar tecido hospedeiro do lúmen intestinal. Estudos recentes fornecem evidências de que a interrupção do TJ pelo EhCPADH112 proteína parasitária é um pré-requisito para E. invasão histolytica que é acompanhada por disfunção da barreira epitelial. Assim, a análise dos mecanismos moleculares envolvidos na TJ desmontagem durante E. invasão histolytica é de suma importância para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese. Este artigo apresenta um modelo simples que permite a avaliação das interações iniciais patógeno-hospedeiro eo potencial de invasão do parasita. Os parâmetros a serem analisados incluem tresistência eléctrica ransepithelial, interacção de EhCPADH112 com receptores da superfície do epitélio, as alterações na expressão e localização de marcadores epiteliais juncionais e localização das moléculas do parasita no interior das células epiteliais.
Introduction
Entamoeba histolytica é um protozoário única célula responsável da amebíase humano, uma infecção intestinal causando inflamação e diarréia. E. histolytica infecta até 50 milhões de pessoas por ano, mas apenas cerca de 10% das pessoas infectadas desenvolvem os sintomas associados a amebíase 1. A infecção ocorre após a ingestão de alimentos contaminados ou água contendo E. cistos histolytica. No intestino, os cistos produzir trofozoítos vivos que aderem a mucina do cólon e proliferam 2. Trofozoítos geralmente formam cistos que são excretados via fezes. Em outros casos, e por razões ainda desconhecidas, trofozoítos quebrar a camada epitelial intestinal e invadir os tecidos subjacentes. No pior dos casos, eles entram na corrente sanguínea e afetar outros órgãos como o fígado 3.
Quebrando a barreira epitelial requer rompimento de estruturas epiteliais transmembranares que mantêm as células unidas. Célula epitelialos contactos são formados pelo complexo de junções de apicais consistindo apertado (TJ) e conexões aderentes (AJ), e 4 desmossomas. As junções mais apicais são TJ e, por isso, eles são a primeira barreira afrontado por E. histolytica e alguns outros agentes patogénicos durante a invasão de host. TJ são compostos de receptores de adesão transmembranares como claudinas, occludin e moléculas de adesão juncional (JAM) que se envolvem em interações heterofílicos homo ou com os receptores da célula vizinha. Eles são intracelularmente ligados por moléculas de andaime dos occludens zonula (ZO) da família de receptores de adesão que se ligam ao citoesqueleto de actina para proporcionar mais resistência mecânica ao epitélio. TJ são responsáveis pela vedação do tecido intestinal do lúmen intestinal, evitando excesso de água e vazamento de soluto. Assim, depois de TJ são interrompidos pelo parasita, os tecidos são invadidos. E. histolytica segrega várias moléculas, tais como: (i) aqueles que estão envolvidos na adesão de amebas para alvet células 5; (Ii) fatores de membrana ativa participação em morte de células hospedeiras por exocitose, por exemplo, os peptídeos que formam os canais de íon denominado amebaporos 6,7; e (iii) as proteinases que degradam as proteínas da matriz extracelular e tecido mediam desintegração 5,8,9.
A protease de cisteína EhCP112 e a molécula de adesão EhADH112 que em conjunto formam o complexo EhCPADH112 são dois E. histolytica virulência proteínas que desempenham um papel importante na desmontagem de TJ 10. Trofozoítos vivo, seus lisados totais e produtos secretados induzir alterações moleculares no TJ distúrbio complexo e funcional da barreira epitelial. Neste estudo, demonstra-se que EhCP112 e EhADH112 interagir com ocludina e claudina-1 de proteínas que conduzem à internalização e a degradação das proteínas celulares, facilitando, assim, E. entrada histolytica através da via paracelular.
Os dados e os óf outros grupos 11-17 sugerem fortemente a necessidade de interações patógeno-hospedeiro específicas que permitem a invasão do parasita. Desvendando as bases moleculares destas interações é de extrema importância para uma melhor compreensão da patogênese amebíase. Perturbação selectiva dos TJ por trofozoítos, caracterizado pelo aumento da permeabilidade paracelular, pode ser medido por uma diminuição da resistência eléctrica transepitelial (TER). A transferência de proteínas de parasitas no sentido epitélios host podem ser determinada por imunofluorescência e por microscopia confocal a laser, um método que também pode revelar a co-localização de factores de virulência ameba com marcadores juncionais epiteliais indicando possíveis interacções directas. Neste artigo, vamos descrever em detalhes como células epiteliais e trofozoítos são cultivadas, colhidas e manipuladas para examinar as interações patógeno-hospedeiro e suas consequências.
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Protocol
1. Estabelecimento e Manutenção de E. Culturas histolytica
- Crescer com culturas puras (totalmente livre de todos os outros organismos contaminantes) 1 x 10 5 trofozoítos de Entamoeba histolytica HML tensão: IMSS clonar um 18 em 16 x 125 mm tubos de cultura com tampas de rosca de teflon forro (ou 1 x 10 6 trofozoítos em um descartável T- 25 frascos) e 15 ml (ou 50 ml em frascos T-25) de TYI-S-33 médio (caldo de TYI, suplementado com 3% de vitamina mistura diamante, de soro de bovino adulto inactivado pelo calor 10%, a 0,5 UI / ml de penicilina e 35 ug / ml de estreptomicina) 19 dentro de uma incubadora a 37 ° C.
- Trofozoítos da colheita durante a fase de crescimento logarítmica, geralmente com intervalos de 48-96 hr (Figura 1) por arrefecimento dos tubos de cultura durante 5-10 min num banho de gelo-água para libertar trofozoítos ligados ao tubo de cultura de vidro.
- Transferir a cultura para um tubo cônico e invertê-lo várias vezes para dispersar o cells. Determinar o número de células usando um hemocitômetro (câmara de Neubauer), e transferir um inóculo em um tubo de cultura contendo meio TYI-S-33 fresco.
- Use baixo número de amebas por períodos mais longos de incubação (~ 3 x 10 5 células para ~ 5 dias) e um número maior de períodos mais curtos (~ 1 x 10 6 células para ~ 1 dia). Enquanto inóculos contados são desejáveis, culturas estabelecidas se torna previsível, de modo que os volumes estimados de inóculos são viáveis.
- Titular da quantidade de trofozoítos de otimizar o número de células para cada experimento.
- Manter uma cultura duplicado paralelo para ter um back-up em caso de contaminação acidental ou ruptura do tubo.
- Vedar bem os tubos e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5 ° inclinado ângulo horizontal.
- Verificar culturas por inspecção visual regular, uma vez que um excessivo crescimento da cultura pode conter muitas células lisadas.
2. Estabelecimento e Manutenção de MDCK Cultura </ P>
- Crescer MDCK (rim canino de Madin Darby), as células do tipo I (de alta resistência) no descartáveis frascos T-75 com 10 ml de meio DMEM suplementado com penicilina (100 UI / mL), estreptomicina (100 mg / ml), insulina (0,08 L / ml) e 10% de soro de bezerro recém-nascido, em uma atmosfera humidificada de 5% de CO 2 e 95% de ar a 37 ° C.
- Para dividir as células, vê-los em um microscópio invertido. Dividir células quando elas são ~ 85-100% confluentes.
- Use um aspirador a vácuo em uma capa estéril e uma pipeta de Pasteur de vidro estéril para remover a mídia da cultura. Para evitar raspar células, vire o frasco de cabeça para baixo e mídia aspirado a partir do canto inferior.
- Dispensar 10 ml de PBS pré-aquecido (140 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) num frasco T-75 (5 ml no caso de um frasco T-25 ) e balançar suavemente o frasco para lavar as células. Remover PBS por aspiração a vácuo. Extensa lavagem é necessária uma vez que o soro inibe tripsina.
- Dispensar 1,5 ml de tripsina a 0,05% para um frasco T-75 (para T-25 balão de utilizar 0,5 ml) e agitar suavemente o frasco para cobrir a camada de células com tripsina.
- Incubar por 5-10 minutos na incubadora (tempo exato depende da atividade de tripsina).
- Verifique se há desprendimento de células, mantendo frasco contra a luz e olhar para as células fluindo. Descolamento celular (células arredondadas) também pode ser verificada usando um microscópio. Muitas vezes, as células liberam mais rápido com uma rápida, suave tapa para o lado do balão.
- Adicionar 15 ml de DMEM suplementado com um T-75 frascos (5 mL para um frasco T-25). Volte a suspender as células por pipetagem cima e para baixo 4 ou 5 vezes.
- Para propagar células, diluir 1:5 com suspensão de células fresco suplementado DMEM. O número de células também pode ser determinada, neste ponto usando um hemocitómetro, mas este é geralmente apenas necessário se a divisão de células em formatos especiais para determinados ensaios.
3. Preparação de Trofozoíto total Lisados
- Retire trofozoítos de cutubos LTURE arrefecendo o tubo durante 5-10 min num banho de gelo-água. Transferir assepticamente a cultura para um tubo cónico e centrifugar a 360 xg durante 10 min a 4 ° C. Cuidadosamente descarte do sobrenadante por decantação, adicionar gelo-PBS frio ao sedimento, inverter o tubo várias vezes para dispersar as células e centrifugar novamente a 360 x g durante 10 min. Repita esta etapa duas vezes para remover todos os vestígios de médio TYI-S-33.
- Determinar o número trofozoítos usando um hemocitômetro.
- Lyse trofozoítos por ciclos de congelamento e descongelamento. Snap-congelar um inoculo medido de trofozoítos (600.000 trofozoítos / ml) diluído em PBS gelado, em azoto líquido durante 1 minuto. Descongelar a amostra a 4 ° C e vórtex vigorosamente. Repetir a congelação e descongelação de 3 vezes para completar a lise das células.
- Activar a proteases presentes nos lisados com 0,02% β-mercaptoetanol.
4. Preparação de Trofozoíto secretada produtos
- Realize os passos de 3,1-3,2.
- Determinarnúmero de células e viabilidade neste ponto usando um hemocitómetro e a aplicação de um teste de exclusão com azul de tripano 20:
- Diluir 9 x 10 6 em trofozóitos de 3 ml de PBS gelado e as células de transferência para um tubo de 50 ml. Tome 10 ml desta suspensão e adicionar 1 ml de 0,4% tripan solução estoque azul pH 7.2.
- Use uma câmara de Neubauer para contagem de células em baixa ampliação.
- Contagem de todas as células e separar o número de células azuis, uma vez que as células azuis tomaram-se o corante e devem ser consideradas mortas.
- Calcula-se a percentagem de células viáveis através da divisão do número de células viáveis pelo número total de células e multiplicando por 100.
- Transferir o tubo cónico contendo a suspensão trofozóito na incubadora a 37 ° C durante 2 horas numa atmosfera de 5 ° inclinado ângulo horizontal.
- Para a coleta de produtos secretados, tubos de centrifugação a 360 xg por 10 min. Use uma seringa descartável e estéril e cuidadosamente recolher o supernatant, evitando a contaminação de amostras com trofozoitos da pelota. Eliminar quaisquer células transferidas pela passagem do sobrenadante através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um. Activar proteases com 0,02% β-mercaptoetanol.
- Para descartar a contaminação indesejada putativo com moléculas liberadas a partir de células mortas, reaplicar o teste do azul de tripan para a viabilidade celular. Número viável e total de células deve ser o mesmo que o obtido no passo 4.2. Se este não for o caso, o sobrenadante foi recolhido pode conter não só proteínas secretadas e deve ser descartado.
5. Interação de células MDCK com Trofozoítos, Trofozoíto Lysates ou secretados produtos
- Incubar as monocamadas de células MDCK confluentes com trofozoítos vivas (uma relação de MDCK-a-amiba de 01:01), trofozóito lisados (um rácio de MDCK-a-amiba de 1:2) ou produtos de secreção (um rácio de MDCK-a-amiba de 1 : 10) a 37 ° C durante 2 e 30 minutos (Figura 2A).
- Lavar as células epiteliais cinco vezes com PBS gelado para eliminar as moléculas não ligadas ou trofozoítos.
6. Preparação de Amostras para Imunofluorescência
- Células MDCK Cultura em lamínulas estéreis colocados dentro de 24 com vários poços de cultura de células prato. Inspeccionar as células no microscópio invertido até atingirem 100% de confluência. Em seguida, substitui meio com 1 ml de meio DMEM suplementado fresco e transferir a placa para uma incubadora a 37 ° C durante 24 horas mais.
- Remover o meio utilizando um aspirador de vácuo e uma pipeta de Pasteur de vidro estéril e adicionar 1 ml de PBS quente a cada poço. Remover PBS e repita a lavagem com PBS fresco. Tomar cuidado para não raspar as células a partir do fundo do poço com a pipeta de vidro.
- Adicionar diferentes condições de trofozoítos diluído em 1 ml de PBS quente: trofozoítos vivos (t), lisados totais trofozoíto (LT) e produtos secretados (SP).
- Colocar a placa de cultura na incubadora durante 2 ou 30 minutos.
- Prepare duas condições de controle: um time chamado 0 min, onde as células MDCK não devem ser incubados com E. histolytica, mas apenas com 1 ml de PBS quente; e uma outra condição como controlo anticorpos secundários, neste caso incubar MDCK com T, LT ou SP durante 2 ou 30 minutos e omitir a incubação com os anticorpos primários.
- Lave as células epiteliais cinco vezes com PBS frio para eliminar moléculas não ligadas ou trofozoítos.
- Fix e permeabilizar as células com 1 ml de etanol a 96% durante 30 min a -20 ° C.
- Para remover o etanol, executar três lavagens rápidas com 1 ml de PBS, à temperatura ambiente.
- Execute as seguintes etapas em câmara úmida para evitar a secagem de amostras:
- Use qualquer caixa plana disponível que pode ser fechado e cheio com uma toalha de papel húmido no qual as amostras podem ser colocadas com segurança. Por exemplo, uma caixa de ponteira vazio serve a esse propósito bem.
- Dentro da câmara, coloque uma camada uniforme Parafilm e pipeta de 25 mL de blocosolução (0,5% BSA) ing para cada lamela.
- Tome lamelas para fora dos poços com uma pinça fina, remover cuidadosamente o excesso de líquido a partir da ponta com um filtro de papel e colocar em lamela a gota com solução de bloqueio (BSA a 0,5%) com as células de frente para a solução de bloqueio. Incubar as amostras durante 1 h à temperatura ambiente.
- Prepara-se uma mistura de anticorpos primários em PBS: IgM de ratinho anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; diluição de 1:10) e IgG de coelho anti-ZO-1 (pα-ZO-1, diluição 1:100).
- Coloque uma folha nova de Parafilm na caixa úmido e pipeta de 25 ml de solução de anticorpos para cada lamela.
- Levantar as lamelas a partir da solução de bloqueio, secar o excesso de líquido nos bordos utilizando um papel de filtro, e colocá-las em gotas com as células de frente para a solução de anticorpo. Incubar as amostras durante a noite a 4 ° C.
- Coloque cada lamela em um poço de um 24 com vários poços (lado da célula na parte superior) e adicionar 1 ml de PBS.
- Prepara-se uma mistura de anticorpos secundários fluorescentes em PBS: rato de cabra anti-IgM acoplado a FITC (diluição 1:100) e de cabra anti-IgG de coelho acoplado a TRITC (diluição 1:50).
- Colocar uma nova folha de Parafilm na caixa húmido e pipeta 25 ul da solução de anticorpos secundários para cada lamela.
- Transferir as amostras como em 6.10 e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, no escuro, para evitar o branqueamento dos corantes fluorescentes. Repita o passo 6.11.1.
- Para coloração nuclear, incubar durante 3 minutos com 200 ul de uma solução 0,05 mM de DAPI a temperatura ambiente e protegido da luz. Repita o passo 6.11.1.
- Para conservar os corantes fluorescentes, coloque as lamelas (células virada para baixo) em 5 mL Vecta Escudo Antifade solução de montagem em lâminas de vidro. Vedar as lamínulas usando unha polonês para evitar a secagem da amostra.
- Para o armazenamento a longo prazo, manter os slides de umacaixa de lâmina de microscópio a -20 ° C.
- Analisar os preparativos por microscopia confocal através de seções Z-stack e XZ-aviões (Figura 2A).
7. Incubação de Trofozoítos com inibidores da protease ou um anticorpo específico
- Repita os passos 3.1 a 3.2. Para cada condição experimental, incubar 1 x 10 5 trofozoítos (ressuspensas em 50 ul de PBS) com inibidores de protease (1 mM completos e 40 ug / ml de E-64) ou 30 ug de anticorpos monoclonais contra EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 durante 20 min a 4 ° C (Figura 2B). Usar estas preparações para ensaios de co-incubação, tal como descrito na etapa 8.5.
8. Medição da resistência elétrica transepitelial (TER)
- Culturas de células MDCK em Transwell suportes permeáveis esterilizados (0,4 um de tamanho de poro). No compartimento superior, colocar 100 ul de suspensão celular e no compartimento inferiorcolocar 600 ul de meio DMEM suplementado.
- Verifique o nível médio periodicamente. Meio fresco pode ser adicionado como requerido.
- Inspecionar as células em um microscópio invertido até atingirem 100% de confluência. Mudança de meio cada 2-3 dias.
- Para melhorar a fixação das células (se necessário), os filtros Transwell equilibrar durante a noite a 37 ° C em DMEM antes da adição da suspensão de células.
- Esterilizar eléctrodos STX2 na capa por imersão em etanol e, em seguida, em PBS esterilizado durante 15 min cada, sob luz UV. Conecte os eletrodos a uma epitelial voltohmmeter EVOM e selecionar o modo de resistência.
- Recolhe meio do compartimento superior de cada transwell e reuni-los. Tome 50 ul desta mistura mídia e combiná-lo com 50 ul de trofozoítos suspensão (1 x 10 5 trofozoítos em PBS) ou com apenas PBS (controle). Use uma mistura semelhante para cada transwell.
- Adicionar misturas à câmara superior de cada containin transwellg as células MDCK. As condições experimentais incluem células MDCK sem trofozoítos (controlo), um co-cultura com trofozoítos ou com trofozoítos pré-incubadas com inibidores da protease ou mαEhCPADH112. Para eliminar a resistência proporcionada pelos filtros, usar transwells incubadas apenas com meio. Para cada condição experimental uso de pelo menos três transwells.
- Imediatamente, medir TER mergulhando os eletrodos Stx2 em cada transwell.
- Certifique-se de que o eléctrodo mais toca no fundo da câmara inferior e que o eléctrodo mais curto é coberto por meio do compartimento superior (ver Figura 2B).
- Certifique-se de manter os eletrodos perpendicularmente a cada vez. Isto irá melhorar a reprodutibilidade, de forma significativa. Evite mover ou inclinar o eletrodo durante as medições, pois isso levará a variação dos dados.
- Esta medida deve ser considerado o valor inicial TER. Em seguida, monitorar o TER durante a seguinte30 min.
- Para calcular o valor final TER, subtrair o valor de TER apenas filtros. Para comparar os resultados das diferentes experiências de normalizar cada ponto de dados para os valores iniciais, tendo estes como 100% (Figura 2B).
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Representative Results
Para uma E. sucedida cultura histolytica, duas condições importantes devem ser cumpridas: o crescimento em condições axênicas e colheita em fase logarítmica. Anteriormente, culturas de E. histolytica foram prontamente estabelecido em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos 22. No entanto, hoje em dia é comum ter cultivo axênico deste parasita que significa uma subcultura indefinido de amebas em um ambiente livre de bactérias que metabolizam, fungos, protozoários, ou células de metazoários. Além disso, a colheita dos trofozoítos durante a logarítmica tarde para fase estacionária inicial de crescimento é crucial ter células viáveis e proliferação 23. Portanto, é importante distinguir esta fase de quantificação de trofozoítos ao longo de vários dias e também por análise da sua morfologia intacta e locomoção rápida (Figura 1).
Para estudos de interacção, as células epiteliais precisa serem uma monocamada confluente para representar as condições fisiológicas que amebas normalmente encontrar no corpo. Várias linhas de células epiteliais, fácil de cultivar, estão disponíveis. Enquanto um sistema modelo de celular mais fisiológico que derivam dos intestinos, como Caco-2 ou T84, estas linhas de células crescem muito lentamente. Uma linha de células crescendo mais rápido que tem sido extensivamente estudada são células MDCK 24. Estas células epiteliais são de origem renal e são caracterizados por uma elevada TER, TJ forte e fácil cultivo. Esta linha celular tem sido usado por décadas para estudar biologia celular de cruzamentos e composição TJ, bem como mecanismos de montagem e desmontagem TJ. Por estas razões, as células MDCK muitas vezes são escolhidos pelos pesquisadores ao estudar funções TJ. As células MDCK também têm sido amplamente utilizados como um modelo para o estudo dos mecanismos induzidos durante a amebíase 5,8,10,25-28. Em um estudo recente, informamos que a interação de tensão I MDCK células epiteliais intestinais e células Caco-2 com lamebas Ive, lisados e produtos ameba causado efeitos similares em composição e TJ TER 10. Assim, as células MDCK são um modelo adequado para estudar os mecanismos de interações ameba-epiteliais. Além disso, o uso de vários E. produtos histolytica (trofozoítos intactos, lisados totais trofozoíto ou produtos secretados colhidas como trofozoítos cultura sobrenadante) é crucial para fornecer informações adicionais e relevantes sobre moléculas envolvidas nestas interações, tais como disponibilidade, modo de ação, a secreção, a participação de outras moléculas e desencadeamento de vias de sinalização.
Embora alcançando a confluência, as células epiteliais formam contactos que são estabilizados por TJ e AJ. Estas estruturas são compostas de certas moléculas que podem ser visualizados por utilização de anticorpos específicos em colorações de imunofluorescência. Por exemplo, na Figura 3, os contactos de células são visualizados por um anticorpo contra o marcador TJ ZO-1 e um laboratório de fluorescência vermelhaELED anticorpo secundário. Como pode ser visto, as células reunir em estreita proximidade, para formar uma monocamada densa, sem qualquer orifício. Nesta figura, o EhCPADH112 complexo derivado de ameba foi corado usando um anticorpo monoclonal que é detectado por um anticorpo secundário marcado por fluorescência verde para estudar a interacção do complexo com a superfície epitelial. Três fontes diferentes de este complexo tem sido aplicado para a monocamada epitelial: trofozoítos vivos (T), os lisados totais Trofozoíto (TL) e os produtos de secreção (SP). Surpreendentemente, em todos os casos, a co-localização de EhCPADH112 com ZO-1 pode ser observado (Figura 3, setas), indicando que este complexo pode ser necessário para facilitar a E. penetração histolytica em monocamada epitelial.
Embora esta interação já pode ser observada já em 2 min após o contato célula ameba-epitelial, a camada de células ainda não está afetado por esta interação desde o ZO-1 coloração ainda parece continuous. Isto muda completamente depois de tempos de incubação mais longos, como mostrado na Figura 4. Aqui, as imagens foram tiradas após 30 minutos de exposição aos três fontes EhCPADH112 diferentes. Uma ruptura clara TJ é visualizado por um descontínua ZO-1 de coloração nas fronteiras das células (Figura 4, setas), com o efeito mais evidente que ocorre em células MDCK em contacto com T ou TL. Por contraste, ZO-1 fica internalizado e é visto nas vesículas intracelulares. Co-localização exacta com qualquer TJ ou AJ ao longo das membranas celulares laterais não podem ser distinguidos por olhando apenas no topo da monocamada, mas sim através da obtenção de um "lado", vista de contactos de células 29. A microscopia confocal a laser permite a tal ponto de vista ao longo do eixo xz como demonstrado nas Figuras 3 e 4 a seguir cada um xy. Estas imagens mostram uma declaração clara se as proteínas co-localizar com TJ na porção mais apical da membrana lateral ou se eles são bastante localizadosTJ abaixo ou acima TJ na membrana apical. Na Figura 3 (pontas de seta), uma co-localização exata do complexo EhCPADH112 com ZO-1 pode ser observado, revelando claramente TJ como o lugar da ação para este fator de virulência. Em contraste, como E. invasão histolytica progrediu (30 min de interação) em epitélio, EhCPADH112 penetrado para o espaço intercelular, como a coloração ao longo da membrana lateral mostrou (Figura 4, setas). Em nosso artigo recente, este método permitiu-nos distinguir entre TJ e AJ porque este complexo só co-localizado com o TJ marcadores occludin e claudin-1, mas não com o marcador β-catenina AJ em 2 min de interação 10.
Internalização de componentes de TJ, como pode ser visto nas colorações de imunofluorescência na Figura 4, é geralmente acompanhado por uma perda da função de barreira que pode ser medida pela resistência eléctrica transepitelial (TER). TERreflecte o fluxo de iões através da monocamada de células epiteliais e pode ser medido utilizando eléctrodos conforme mostrado na Figura 2B. Quando a monocamada ainda não está completamente formada ou interrompido devido a sinais extracelulares, um fluxo livre de iões através da camada de células é indicado por um TER baixo. TER foi medido de uma monocamada confluente de controle que não tem estado em contacto com produtos de ameba ou monocamadas em contato com trofozoítos (Figura 5). Parasita contacto interrompido função de barreira epitelial indicado por uma queda TER de 90% em comparação com as monocamadas de controlo. Para investigar os mecanismos pelos quais os trofozoítos podem afectar a função de barreira, que pré-incubadas com os trofozoítos um anticorpo contra EhCPADH112 para evitar a aderência desse complexo ou com inibidores de protease, para bloquear a actividade proteolítica deste complexo e outras proteases importantes para os danos celulares alvo. Ambos os tratamentos conduziu a uma inversão quase total de queda TER, sugerindo que ambos proteolítica atividade e adesivas propriedades são importantes fatores de virulência deste complexo durante E. invasão histolytica.
Figura 1. Curva de crescimento típicas de culturas puras cultivada E. trofozoítos histolytica. inóculos de 2 x 10 5 trofozoítos de E. histolytica HMI-IMSS Um clone foram cultivadas em placas de 6 poços com TYI-S-33 médio e depois a cada 24 número de células hr foram determinadas usando um hematocytomer. O crescimento celular foi monitorizada por microscopia de luz e a morfologia das células cultivadas é representado no painel superior. A quantidade de trofozoítos foi monitorada durante 6 dias (d) e os valores foram plotados no gráfico abaixo. Os dados representam a média e o erro padrão da média de três medidas independentes. Barra = 10 m./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Representação Figura 2. Esquema das interações entre células MDCK e diferentes condições de E. histolytica. A) As diferentes condições de E. histolytica são mostrados: trofozoítos vivos (T), o total de trofozoítos lisados (LT) e as moléculas segregadas por trofozoítos para o meio (SP). Qualquer condição experimental foi avaliada em 2 e 30 min de incubação com as células MDCK confluentes. Após a incubação, as células MDCK foram abundantemente lavado para remover as moléculas de trofozoítos ou parasitas não ligados. Em seguida, as amostras foram processadas para imunofluorescência, empregando mαEhCPADH112 e pαZO-1 Antibods para co-localizar o EhCPADH112 complexo parasita e o marcador TJ ZO-1, respectivamente. Posteriormente, os anticorpos secundários específicos de espécies acoplados a diferentes fluorocromos foram usadas para detectar ambas as proteínas por meio de microscopia confocal. B) Adição de trofozoítos só ou trofozoítos pré-incubadas com mαEhCPADH112 ou inibidores de protease de 20 min a 4 ° C no compartimento superior da transwells contendo células MDCK confluentes. TER de células epiteliais foi monitorada através de um eletrodo conectado a um STX2 voltohmeter EVOM, durante 30 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Localização de EhCPADH112 no TJ de monocamadas MDCK. As células MDCK foram incubated com trofozoítos vivos (T), o total de trofozoítos lisados (LT) e as moléculas segregadas por trofozoítos para o meio (SP) durante 2 min. Painel superior: imagens de contraste de fase de células MDCK. EhCPADH112 e ZO-1 de proteínas foram identificadas por mαEhCPADH112 e anticorpos pαZO-1 e, em seguida, com anticorpos de FITC e TRITC-secundário, respectivamente. Núcleos foram coradas com DAPI. Setas: localização de proteínas nas fronteiras celulares. Setas em XZ-aviões: localização de proteínas no TJ. Bar = 10 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Internalização de EhCPADH112 em células MDCK. As células MDCK foram incubadas com trofozoítos vivos (T), o total de trofozoítos lisados (TL) e as moléculas segregadas por trofozoítos para o meio (SP), durante 30 min. Painel superior: imagens de contraste de fase de células MDCK. EhCPADH112 e ZO-1 de proteínas foram identificadas por mαEhCPADH112 e anticorpos pαZO-1 e, em seguida, com anticorpos de FITC e TRITC-secundário, respectivamente. Núcleos foram coradas com DAPI. Setas: localização de proteínas nas fronteiras celulares. Setas em XZ-aviões: localização de proteínas na membrana lateral (setas). Bar = 10 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. E. histolytica via EhCPADH112 induz rompimento da barreira epitelial. monocamadas MDCK foram incubadas com trofozoítos ao vivo(T) ou T pré-incubadas com inibidores de protease (IP) ou anticorpo mαEhCPADH112 (α) durante 30 min e TER foi avaliada nos tempos indicados. TER foi normalizado de acordo com o valor inicial para cada transwell (~ 3,200 Ω · cm 2). Médias e erros-padrão das médias são representados para cada ponto de tempo. A análise estatística foi realizada com o software GraphPad Prism 5 utilizando o teste ANOVA one-way. *** P <0,001.
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Discussion
Para o estudo in vitro interações patógeno-hospedeiro durante a infecção epitelial pelo E. histolytica, é fundamental para trabalhar com culturas bem estabelecidas de ambas as células epiteliais e trofozoítos. Por exemplo, antigamente, E. culturas histolytica geralmente tinha sido estabelecida em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos 22,23. No entanto, a co-cultura de E. culturas histolytica é contraproducente para o estudo das interações patógeno-hospedeiro, pois os efeitos observados em células hospedeiras não poderia ser inequivocamente atribuída aos ameobas mas poderia sim ser um efeito das células co-cultivadas. Assim, uma cultura de E. axenical histolytica é desejável para o exame de interações patógeno-hospedeiro específicas. O protocolo fornecido descreve como um cultivo, tais axênica de E. histolytica pode ser conseguido explorar especificamente tais culturas para estudos de infecção. Além disso, a temporizaçãoda colheita de E. histolytica é também crítica. E. histolytica colheita é recomendado durante a fase final do crescimento exponencial para garantir um alto rendimento de células com alta viabilidade.
Por outro lado, uma monocamada bem estabelecido de células epiteliais é também obrigatória para obter resultados reprodutíveis. Para emular uma monocamada epitelial fisiologicamente apertado, as células cultivadas precisa ser usado, no tempo certo. A monocamada tem de ser completamente formado sem quaisquer buracos. Além disso, a formação correcta de TJ e AJ requer algum tempo depois de contactos celulares são estabelecidas. Normalmente, as células epiteliais são inibidas por contato, o que significa que as células param de proliferar em uma monocamada confluente, de modo que é geralmente melhor para se obter as células de um outro dia de crescimento. No entanto, isso não deve ser expandida uma vez que esta inibição de contato não é indefinido e células podem, em algum momento começar a cobrir o outro. Se este for observado que será necessário dividir ou discocélulas Arde e não usá-los em ensaios. A formação de monocamadas epiteliais apertadas é melhor controlada medindo TER. No entanto, isto requer o crescimento em filtros Transwell, que são bastante caros. Para desenvolver um olho para uma boa monocamada pode ser útil para o experimentador inexperiente para comparar o crescimento de células no mesmo formato cultivo após divulgar vários números de celular.
O momento do ensaio interação parasito-hospedeiro é outro fator crucial. Depois de 2 min de interação, nenhum dano epitelial pode ser observada, mas uma interação de EhCPADH112 com a molécula TJ ZO-1 já era aparente. No entanto, após 30 min de interacção, dano epitelial grave foi observada, tal como indicado por TJ desmontagem e uma gota de TER (10 e este estudo). Estes dados sugerem que uma interacção adesiva inicial com o lado epitelial apical é necessária para soltar os contactos e permitir a penetração de outras moléculas, tais como as proteases que contribuem com adegradação de outros TJ, AJ e desmosome moléculas. A concentração das proteínas de trofozoítos, também é importante. De notar que resultados diferentes podem ser observados quando da aplicação trofozoítos ao vivo ou apenas lisados ou produtos secretados de E. histolytica. A proporção relativa dos trofozoitos às células epiteliais foi anteriormente provado 10 e, mesmo quando a proporção de células MDCK-a-secretada subprodutos ameba foi alta (1:10), o dano epitelial não era tão grave. Isto indica que não só a concentração de uma única proteína de virulência é crítica, mas que poderia ser também a interacção de vários factores que resultam em danos epiteliais eficaz para permitir a invasão rápida de amebas. Por exemplo, o grupo de Chadee destacou a importância de uma outra protease derivada de ameba, EhCP5, para provocar danos epiteliais 16. Parece provável que uma interação de fatores de virulência in vivo é necessária para induzir amebíase e que as interações desaparecidas devido a inhibition de uma única proteína pode ser responsável pelo facto de, na maioria dos casos, as infecções são quiescentes. A este respeito, é também importante referir que os produtos epiteliais, tais como as mucinas são importantes para protecção contra a infecção. Em particular, mucin2 knock-out ratos são mais suscetíveis a alterações induzidas TJ-EhCP5 e infecção 16. Assim, alterações no lado epitelial também precisam ser considerados para avaliar a capacidade de invasão ameba.
Uma importante limitação das tecnologias descritas para detectar a co-localização é que ele não forma inequívoca provar uma interacção directa. Neste caso, a interacção co-localização ou pode também ser mediada por uma outra proteína, que simplesmente não é visualizada. Para detectar uma interacção directa, que será necessária para a produção de proteínas recombinantes marcados (tais como GST ou 10xHis) e realizar a imunoprecipitação de uma etiqueta e Western Blot para o outro. De qualquer forma, colorações de imunofluorescência têm a vantagem de revelar o exact localização celular do complexo de proteína e dar o experimentador uma ideia de que as proteínas devem ser testados em tal ensaio interacção in vitro. Outra desvantagem é que há apenas alguns anticorpos específicos de ameba disponíveis. Assim, se alguém quer estudar determinadas proteínas ameba em tais estudos de interacção, é mais provável que exigem a geração de um anticorpo. No entanto, se os anticorpos estão disponíveis, os métodos descritos podem ser aplicados para o estudo da relevância das outras proteínas de ameba (secretada ou ligada à superfície) de agentes patogénicos transmissíveis.
Este artigo descreve um modelo fácil de detectar co-localização e as interações entre as moléculas do hospedeiro e parasita. Os conhecimentos obtidos a partir destes ensaios baseados em células pode ser aplicado em modelos in vivo de infecção utilizando hamsters ou ratinhos para corroborar a relevância fisiológica para invasão hospedeira pelo parasita. Estes dados podem então ser usados para o desenvolvimento de novos tratamentos stragias.
Em resumo, nós fornecemos protocolos detalhados para o cultivo de E. histolytica e células epiteliais para o uso em estudos de interação patógeno-hospedeiro, em particular, ensaios que permitem a avaliação de co-localização e TJ desmontagem. O calendário das culturas, bem como a de cada ensaio é crucial para garantir a reprodutibilidade dos resultados obtidos. Enquanto temporização das culturas pode ser influenciada pela variação do número de células disseminadas, a temporização das próprias experiências depende do tipo de ensaio e o tipo de proteínas investigados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
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