Summary
La infección humana por Entamoeba histolytica conduce a la amebiasis, una causa importante de diarrea en los países tropicales. La infección se inicia por la interacción de agentes patógenos con células epiteliales intestinales, provocando la apertura de los contactos célula-célula y en consecuencia la diarrea, a veces seguido por infección del hígado. Este artículo proporciona un modelo para evaluar las primeras interacciones huésped-patógeno para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la amibiasis.
Abstract
Entamoeba histolytica es el agente causante de la amebiasis humano, una causa importante de diarrea y absceso hepático en los países tropicales. La infección se inicia por la interacción del patógeno con las células epiteliales intestinales. Esta interacción da lugar a una alteración de las estructuras intracelulares tales como uniones estrechas (TJ). TJ asegurar el cierre de la capa epitelial para separar el tejido del huésped de luz intestinal. Estudios recientes demuestran que la interrupción de TJ por la EhCPADH112 proteína parasitaria es un requisito previo para E. invasión histolytica que se acompaña de disfunción de la barrera epitelial. Por lo tanto, el análisis de los mecanismos moleculares implicados en TJ desmontaje durante E. invasión histolytica es de suma importancia para mejorar nuestra comprensión de la patogénesis de la amibiasis. En este artículo se presenta un modelo sencillo que permite la evaluación de las interacciones huésped-patógeno iniciales y el potencial de la invasión del parásito. Parámetros que deben analizarse incluyen tresistencia eléctrica ransepithelial, la interacción de EhCPADH112 con receptores de la superficie epiteliales, cambios en la expresión y localización de marcadores epiteliales de unión y localización de moléculas de parásitos dentro de las células epiteliales.
Introduction
Entamoeba histolytica es un protozoo único responsable de la amibiasis humana, una infección intestinal de células causando inflamación y diarrea. E. histolytica infecta a 50 millones de personas al año, pero sólo alrededor del 10% de las personas infectadas desarrollan los síntomas asociados a la amibiasis 1. La infección se produce por ingestión de alimentos contaminados o agua que contiene E. quistes histolytica. En el intestino, quistes producen trofozoítos en vivo que se adhieren a la mucina de colon y proliferan 2. Los trofozoítos suelen formar quistes que se excretan a través de las heces. En otros casos y por razones aún desconocidas, trofozoítos rompen la capa del epitelio intestinal e invaden los tejidos subyacentes. En el peor de los casos, entran en el torrente sanguíneo y afectan a otros órganos como el hígado 3.
Rompiendo la barrera epitelial requiere la interrupción de las estructuras epiteliales transmembrana que mantienen las células unidas. Célula epitelialcontactos se forman por el complejo de unión apical que consiste de apretado (TJ) y uniones adherentes (AJ), y desmosomas 4. Las uniones más apical son TJ, y por lo tanto, que son la primera barrera afrentado por E. histolytica y algunos otros patógenos durante la invasión del huésped. TJ se componen de los receptores de adhesión transmembrana como claudins, occludin y moléculas de adhesión de unión (JAM) que se dedican a la homo-o interacciones heterófilos con receptores de la célula vecina. Están intracelularmente obligados por moléculas de andamio de los zonula occludens (ZO) de la familia que se conectan los receptores de adhesión a citoesqueleto de actina para proporcionar más resistencia mecánica al epitelio. TJ son responsables para el sellado de tejido intestinal desde el lumen intestinal, evitando que el agua excesivo y fugas de soluto. Así, después de TJ se interrumpen por el parásito, los tejidos son invadidos. E. histolytica segrega varias moléculas tales como: (i) los implicados en la adhesión de las amebas a Target células 5; (Ii) factores activos de membrana que participan en la destrucción de las células huésped por exocitosis, por ejemplo, los péptidos que forman canales iónicos denominados amoebapores 6,7; y (iii) las proteinasas que degradan las proteínas de la matriz extracelular y median tejido desintegración 5,8,9.
La proteasa cisteína EhCP112 y la molécula de adhesión EhADH112 que en conjunto forman el complejo EhCPADH112 son dos E. histolytica virulencia proteínas que desempeñan un papel importante en el desmontaje de TJ 10. Trofozoítos vivo, sus lisados totales y productos secretados inducen cambios moleculares en la perturbación compleja y funcional TJ de la barrera epitelial. En este estudio, se muestra que EhCP112 y EhADH112 interactúan con ocludina y claudina-1 proteínas que conducen a la internalización y la degradación de proteínas de la célula, facilitando de este modo E. entrada histolytica a través de la ruta paracelular.
Nuestros datos y los Of otros grupos 11-17 sugieren fuertemente la necesidad de las interacciones huésped-patógeno específicos que permiten la invasión del parásito. Revelación de la base molecular de estas interacciones es de suma importancia para una mejor comprensión de la patogénesis de la amebiasis. Perturbación selectiva de TJ por trofozoitos, caracterizado por aumento de la permeabilidad paracelular, se puede medir por una disminución en la resistencia eléctrica transepitelial (TER). La transferencia de las proteínas parasitarias hacia epitelios huésped puede ser determinado por tinción de inmunofluorescencia y microscopía láser confocal, un método que también puede revelar co-localización de los factores de virulencia de ameba con marcadores epiteliales de unión que indican posibles interacciones directas. En este artículo, describimos en detalle cómo se cultivan, cosechan y se manipulan para examinar las interacciones huésped-patógeno y sus consecuencias células epiteliales y trofozoítos.
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Protocol
1. Establecimiento y mantenimiento de E. Culturas histolytica
- Crecer axénicamente (totalmente libre de todos los demás organismos contaminantes) 1 x 10 5 trofozoítos de Entamoeba HML cepa histolytica: IMSS clon A 18 en 16 x 125 mm tubos de cultivo con teflón tapones de rosca de línea regular (o 1 x 10 6 trofozoítos en una desechable T- matraz de 25) y 15 ml (o 50 ml en matraz T-25) de TYI-S-33 medio (caldo de TYI suplementado con 3% de mezcla de diamante vitamina, suero inactivado bovino adulto calor al 10%, 0,5 UI / ml de penicilina y 35 mg / ml de estreptomicina) 19 en una incubadora a 37 ° C.
- Trofozoítos de la cosecha durante la fase de crecimiento logarítmica por lo general a intervalos de 48-96 hr (Figura 1) mediante el enfriamiento de los tubos de cultivo durante 5-10 min en un baño de hielo-agua para liberar los trofozoítos unidos al tubo de cultivo de vidrio.
- Transfiera la cultura en un tubo cónico e invertir varias veces para dispersar el cells. Determinar el número de células utilizando un hemocitómetro (cámara de Neubauer), y la transferencia de un inóculo en un tubo de cultivo que contiene medio TYI-S-33 fresco.
- Utilice un bajo número de amebas por períodos de incubación más largo (~ 3 x 10 5 células de ~ 5 días) y un mayor número de períodos más cortos (~ 1 × 10 6 células para ~ 1 día). Mientras inóculos contados son deseables, culturas establecidas se vuelven predecibles por lo que los volúmenes estimados de inóculos son factibles.
- Valorar la cantidad de trofozoítos para optimizar el número de células para cada experimento.
- Mantener un cultivo duplicado en paralelo para tener una copia de seguridad en caso de contaminación accidental o rotura del tubo.
- Tubos de tapa y los incuban a 37 ° C en el 5 ° inclinado ángulo horizontal.
- Compruebe culturas por inspección visual con regularidad, ya que un crecimiento excesivo de la cultura puede contener muchas células lisadas.
2. Establecimiento y mantenimiento de MDCK Cultura </ P>
- Crecer células MDCK (Madin Darby de riñón canino) tipo I (de alta resistencia) en matraces desechables T-75 con 10 ml de medio DMEM suplementado con penicilina (100 UI / ml), estreptomicina (100 mg / ml), insulina (0,08 U / ml) y 10% de suero de ternero recién nacido en una atmósfera humidificada de 5% de CO 2 y 95% de aire a 37 ° C.
- Para dividir las células, comprobarlos en un microscopio invertido. Dividir las células cuando son ~ 85-100% confluentes.
- Utilice un aspirador de vacío en una campana estéril y una pipeta Pasteur de vidrio estéril para eliminar los medios de comunicación de la cultura. Para evitar raspar las células, gire el frasco boca abajo y los medios de comunicación aspirado desde la esquina inferior.
- Dispensar 10 ml de PBS precalentado (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) en un matraz T-75 (5 ml en el caso de un T-25 matraz ) y mueva suavemente el matraz para lavar las células. Retire PBS por aspiración al vacío. Se requiere un prolongado lavado desde el suero inhibe la tripsina.
- Dispensar 1,5 ml de 0,05% de tripsina en un matraz T-75 (T-25 para utilizar un matraz 0,5 ml) y el matraz suavemente roca para cubrir la capa de células con tripsina.
- Incubar durante 5-10 minutos en la incubadora (tiempo exacto depende de la actividad de la tripsina).
- Compruebe si hay desprendimiento de las células mediante la celebración de frasco contra la luz y verificar si hay células que fluye. Desprendimiento celular (células redondeadas), también se puede comprobar con un microscopio. A menudo, las células liberan más rápido con una rápida palmada suave en el lado del matraz.
- Añadir 15 ml de DMEM suplementado a un matraz T-75 (5 ml para un matraz T-25). Resuspender las células pipeteando arriba y abajo de 4 o 5 veces.
- Para propagar células, diluir 1:05 suspensión de células con DMEM fresco suplementado. Número de células también se puede determinar en este punto usando un hemocitómetro pero esto es por lo general sólo es necesario si la división de células en formatos especiales para determinados ensayos.
3. Preparación de Trofozoíto total lisados
- Separe trofozoítos de cutubos lture enfriando el tubo durante 5 a 10 min en un baño de agua helada. Transferir la cultura asépticamente en un tubo cónico y se centrifuga a 360 xg durante 10 min a 4 ° C. Desechar con cuidado el sobrenadante por decantación, añadir helado de PBS al sedimento, invertir el tubo varias veces para dispersar las células y centrifugar de nuevo a 360 xg durante 10 min. Repita este paso dos veces para eliminar todos los restos de medio TYI-S-33.
- Determinar el número de trofozoítos utilizando un hemocitómetro.
- Lyse trofozoítos por los ciclos de congelación-descongelación. Snap-congelar un inóculo medida de trofozoítos (600.000 trofozoítos / ml) diluido en PBS helado, en nitrógeno líquido durante 1 min. Descongelar la muestra a 4 ° C y agitar vigorosamente. Repita de congelación y descongelación 3 veces para completar la lisis celular.
- Activar las proteasas presentes en los lisados con 0,02% β-mercaptoetanol.
4. Preparación de trophozoite secretadas Productos
- Realice los pasos 3.1 a 3.2.
- Determinarnúmero de células y la viabilidad en este punto utilizando un hemocitómetro y la aplicación de un test de exclusión con azul de tripano 20:
- Diluir 9 x 10 6 trofozoítos en 3 ml de helado de PBS y las células de transferencia en un tubo cónico de 50 ml. Tomar 10 l de esta suspensión y añadir 1 l de tripano al 0,4% solución de azul stock pH 7,2.
- Utilice una cámara de Neubauer para contar las células a bajo aumento.
- Contar todas las células y separar el número de células de color azul, ya que las células azules han tomado el colorante y deben ser considerados muertos.
- Calcular el porcentaje de células viables mediante la división del número de células viables por el número total de células y multiplicando por 100.
- Transferir el tubo cónico que contiene la suspensión de trofozoitos en la incubadora a 37 ° C durante 2 horas en un 5 ° inclinadas ángulo horizontal.
- Para recoger los productos secretados, tubos de centrífuga a 360 xg durante 10 min. Utilice una jeringa desechable y estéril y cuidadosamente recoger el dosobrenadante, evitando la contaminación de muestras con trofozoítos de la pastilla. Eliminar las células transferidas al pasar el sobrenadante a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras. Activar proteasas con 0,02% β-mercaptoetanol.
- Para descartar la contaminación no deseada putativa con moléculas liberadas por las células muertas, vuelva a aplicar la prueba de exclusión con azul de tripano para la viabilidad celular. Viable y número total de células debería ser la misma que la obtenida en la etapa 4.2. Si este no es el caso, el sobrenadante recogido puede no sólo contener las proteínas secretadas y debe desecharse.
5. La interacción de las células MDCK con trofozoítos, Trofozoíto lisados o secretadas Productos
- Incubar confluente monocapas de células MDCK con trofozoítos vivos (una relación de-MDCK a amebas de 1:01), trophozoite lisados (una relación-MDCK a la ameba de 1:2) o productos secretados (una relación de-MDCK a la ameba de 1 : 10) a 37 ° C durante 2 min y 30 (Figura 2A).
- Lavar las células epiteliales cinco veces con helado de PBS para eliminar las moléculas no unidas o trofozoítos.
6. Preparación de muestras para inmunofluorescencia
- Células MDCK Cultura sobre cubreobjetos de vidrio estériles colocados dentro de una placa de cultivo celular de 24 pocillos múltiples. Inspeccionar las células en el microscopio invertido hasta que alcanzan el 100% de confluencia. A continuación, sustituir medio con 1 ml de medio DMEM suplementado fresco y transferir la placa a una incubadora a 37 ° C durante 24 h más.
- Retire el medio utilizando un aspirador de vacío y una pipeta Pasteur de vidrio estéril y añadir 1 ml de PBS caliente a cada pocillo. Retire PBS y repetir el lavado con PBS fresco. Tener cuidado de no raspar las células de la parte inferior del pocillo con la pipeta de vidrio.
- Añadir diferentes condiciones de trofozoítos diluido en 1 ml de PBS caliente: trofozoítos vivos (T), lisados totales de trofozoitos (TL) y productos secretados (SP).
- Coloque la placa de cultivo en la incubadora durante 2 o 30 min.
- Prepare dos condiciones de control: uno llamado tiempo 0 min, donde las células MDCK no deben ser incubadas con E. histolytica pero sólo con 1 ml de PBS caliente; y otra condición de control como anticuerpos secundarios, en este caso incubar MDCK con T, TL o SP para 2 o 30 min y se omite la incubación con anticuerpos primarios.
- Lavar las células epiteliales cinco veces con PBS frío para eliminar moléculas no unidas o trofozoítos.
- Fijar y permeabilizar las células con 1 ml de etanol al 96% durante 30 min a -20 ° C.
- Para eliminar el etanol, realizar tres lavados rápidos con 1 ml de PBS a temperatura ambiente.
- Realice los siguientes pasos en una cámara húmeda para evitar el secado de las muestras:
- Utilice cualquier caja plana disponible que puede ser cerrada y llena de una toalla de papel húmeda en el que las muestras se pueden colocar de forma segura. Por ejemplo, una caja de puntas de pipeta vacía sirve para este propósito.
- Dentro de la cámara, coloque uniformemente una capa Parafilm y pipeta de 25 l de bloqueing solución (0,5% de BSA) para cada cubreobjetos.
- Tome cubreobjetos de los pozos con unas pinzas finas, retire con cuidado el exceso de líquido de la punta con un papel de filtro y poner cubreobjetos en la gota que contiene la solución de bloqueo (BSA al 0,5%) con las células frente a la solución de bloqueo. Se incuban las muestras durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Preparar una mezcla de anticuerpos primarios en PBS: IgM de ratón anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; dilución 1:10) y la IgG de conejo anti-ZO-1 (pα-ZO-1; dilución 1:100).
- Coloque una hoja de Parafilm en la caja húmeda y de pipeta 25 l de solución de anticuerpos para cada cubreobjetos.
- Levante los cubreobjetos de la solución de bloqueo, secar el exceso de líquido en los bordes con un papel de filtro, y colocarlos en las gotas con las células frente a la solución de anticuerpos. Se incuban las muestras durante la noche a 4 ° C.
- Ponga cada cubreobjetos en un pozo de un 24 pocillos múltiples (lado de células en la parte superior) y añadir 1 ml de PBS.
- Preparar una mezcla de anticuerpos secundarios fluorescentes en PBS: ratón anti-IgM de cabra acoplado a FITC (dilución 1:100) y anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo acoplado a TRITC (1:50 dilución).
- Coloque una hoja de Parafilm en la caja húmeda y de pipeta 25 l de la solución de anticuerpos secundaria para cada cubreobjetos.
- Transferir las muestras como en 6,10 y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad para evitar la decoloración de los colorantes fluorescentes. Repita el paso 6.11.1.
- Para la tinción nuclear, incubar durante 3 min con 200 l de solución 0,05 mM DAPI a temperatura ambiente y protegido de la luz. Repita el paso 6.11.1.
- Para conservar los tintes fluorescentes, colocar el cubreobjetos (células hacia abajo) en 5 l Vecta Shield Antifade solución de montaje en portaobjetos de vidrio para microscopio. Selle los cubreobjetos utilizando el esmalte de uñas para evitar la desecación de la muestra.
- Para el almacenamiento a largo plazo, mantener las diapositivas en unacaja de portaobjetos a -20 ° C.
- Analizar los preparativos de la microscopía confocal a través de secciones Z-stack y xz planos (Figura 2A).
7. La incubación de trofozoítos con inhibidores de la proteasa o de anticuerpos específicos
- Repita los pasos 3.1 a 3.2. Para cada condición experimental, se incuban 1 x 10 5 trofozoítos (resuspendidas en 50 l de PBS) con inhibidores de proteasa (1 mM completos y 40 mg / ml E-64) o 30 mg anticuerpo monoclonal contra EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 durante 20 min a 4 ° C (Figura 2B). Utilice estos preparativos para los ensayos de co-incubación, como se describe en el paso 8.5.
8. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TER)
- Cultura células MDCK en soportes permeables Transwell estériles (0,4 micras de tamaño de poro). En el compartimiento superior, colocar 100 l de suspensión celular y en el compartimiento inferiorcolocar 600 l de medio DMEM suplementado.
- Compruebe periódicamente el nivel medio. Medio fresco se puede añadir según sea necesario.
- Inspeccionar las células en un microscopio invertido hasta que alcanzan el 100% de confluencia. Cambie medio cada 2-3 días.
- Para mejorar la unión celular (si es necesario), equilibrar los filtros Transwell durante la noche a 37 ° C en DMEM antes de añadir la suspensión celular.
- Esterilizar electrodos Stx2 en la campana por inmersión en etanol y luego en PBS estéril durante 15 minutos cada uno, bajo luz UV. Conecte los electrodos a un epitelio voltohmmeter EVOM y seleccione el modo de resistencia.
- Recoger medio del compartimiento superior de cada transwell y agruparlas. Tomar 50 l de esta mezcla de medios y combinarlo con 50 l de trofozoítos suspensión (1 x 10 5 trofozoítos en PBS) o sólo con PBS (control). Use una mezcla similar para cada transwell.
- Añadir las mezclas a la cámara superior de cada containin transwellg las células MDCK. Las condiciones experimentales incluyen células MDCK sin trofozoítos (control), un co-cultivo con trofozoítos o con trofozoítos pre-incubadas con inhibidores de la proteasa o mαEhCPADH112. Para eliminar la resistencia proporcionada por los filtros, utilizar cultivos polarizados se incubaron con medio solo. Para cada condición de uso experimental por lo menos tres cultivos polarizados.
- Inmediatamente, medir TER sumergiendo los electrodos en cada Stx2 transwell.
- Asegúrese de que el electrodo ya toca la parte inferior de la cámara inferior y que el electrodo más corto está cubierto por medio en el compartimiento superior (véase la figura 2B).
- Asegúrese de sujetar los electrodos perpendicularmente cada vez. Esto mejorará la reproducibilidad, de manera significativa. Evite mover o inclinar el electrodo durante las mediciones, ya que esto dará lugar a la variación de los datos.
- Esta medición se debe considerar el valor inicial TER. Entonces, supervisar la TER durante el siguiente30 min.
- Para calcular el valor final TER, restar el valor TER de sólo filtros. Para comparar los resultados de diferentes experimentos normalizar cada punto de datos a los valores iniciales, tomando éstos como 100% (Figura 2B).
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Representative Results
Para una E. éxito cultura histolytica, dos importantes condiciones debe cumplirse: el crecimiento en condiciones axénicas y cosecha en fase logarítmica. Anteriormente, cultivos de E. histolytica se establecieron fácilmente en asociación con ciertas especies de bacterias o tripanosomátidos 22. Sin embargo, hoy en día es común tener cultivos axénicos de este parásito es decir, un subcultivo indefinida de amebas en un ambiente libre de bacterias que metabolizan, hongos, protozoos, o células de metazoos. Además, la cosecha de los trofozoítos durante la tarde logarítmica a principios de la fase estacionaria de crecimiento es crucial disponer de células viables y proliferantes 23. Por lo tanto, es importante distinguir esta fase mediante la cuantificación de los trofozoítos a lo largo de varios días y también mediante el examen de su morfología intacta y la locomoción rápida (Figura 1).
Para estudios de interacción, las células epiteliales tienen que seren una monocapa confluente para representar las condiciones fisiológicas que amebas sería normal en el cuerpo. Varias líneas de células epiteliales, fácil de cultivar, están disponibles. Mientras que un sistema modelo de células más fisiológica derivaría de los intestinos, como Caco-2 o T84, estas líneas celulares crecen más lentamente. Un crecimiento más rápido línea celular que ha sido extensamente estudiados son células MDCK 24. Estas células epiteliales son de origen renal y se caracterizan por una alta TER, fuerte TJ y fácil cultivo. Esta línea celular se ha utilizado durante décadas para estudiar la biología celular de los cruces y la composición de TJ, así como los mecanismos de montaje y desmontaje TJ. Por estas razones, las células MDCK se eligen a menudo por los investigadores en el estudio de funciones TJ. Células MDCK también han sido ampliamente utilizado como un modelo para el estudio de mecanismos inducidos durante la amebiasis 5,8,10,25-28. En un estudio reciente, se informó de que la interacción de la cepa I MDCK células epiteliales y células intestinales Caco-2 con lamebas Ive, lisados y productos ameba causaron efectos similares en composición TJ y TER 10. Por lo tanto, las células MDCK son un modelo adecuado para estudiar los mecanismos de las interacciones ameba-epitelios. Además, el uso de varios E. productos histolytica (trofozoitos intactos, trophozoite lisados totales o productos secretados cosechados como cultura trofozoítos sobrenadante) es crucial para proporcionar información adicional y relevante sobre las moléculas que participan en estas interacciones, como la disponibilidad, modo de acción, la secreción, la participación de otras moléculas y activación de las vías de señalización.
Mientras que alcanzar la confluencia, las células epiteliales forman contactos que se estabilizan por TJ y AJ. Estas estructuras se componen de ciertas moléculas que pueden ser visualizados mediante el uso de anticuerpos específicos en tinciones de inmunofluorescencia. Por ejemplo, en la Figura 3, los contactos de células se visualizaron mediante un anticuerpo contra el marcador TJ ZO-1 y un laboratorio con fluorescencia rojaELED anticuerpo secundario. Como se puede observar, las células se reúnen en estrecha proximidad para formar una monocapa densa sin ningún agujero. En esta figura, la EhCPADH112 complejo ameba derivados ha sido teñidas utilizando un anticuerpo monoclonal que es detectada por un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia verde para estudiar la interacción de este complejo con la superficie epitelial. Tres fuentes diferentes de este complejo se han aplicado a la monocapa epitelial: trofozoítos vivo (T), los lisados totales de trofozoitos (TL) y productos secretados (SP). Llama la atención que en todos los casos, la co-localización de EhCPADH112 con ZO-1 se puede observar (Figura 3, flechas), lo que indica que este complejo podría ser necesario para facilitar E. penetración histolytica en la monocapa epitelial.
Aunque esta interacción ya se puede observar tan temprano como 2 minutos después de la ameba epitelial contacto celular, la capa de células aún no se ve afectada por esta interacción desde la tinción ZO-1 todavía se ve Continuous. Esto cambia completamente después de tiempos de incubación más largos como se muestra en la Figura 4. Aquí, las imágenes fueron tomadas después de 30 minutos de exposición a las tres fuentes EhCPADH112 diferentes. Una interrupción clara de TJ se visualiza por un discontinua ZO-1 tinción en las fronteras de células (Figura 4, flechas), con el efecto más evidente se produce en células MDCK en contacto con T o TL. Por el contrario, ZO-1 se internaliza y se ve en vesículas intracelulares. Exacta co-localización, ya sea con o TJ AJ lo largo de las membranas celulares laterales no se puede distinguir con sólo mirar en la parte superior de la monocapa, sino más bien mediante la obtención de un "lado"-vista de contactos de células 29. Microscopía láser confocal permite una vista tales lo largo del eje xz como se demuestra en las Figuras 3 y 4 debajo de cada vista XY. Estas imágenes muestran una declaración clara si las proteínas co-localizar con TJ en la parte más apical de la membrana lateral o si están ubicados en lugarpor debajo o por encima de TJ TJ en la membrana apical. En la Figura 3 (puntas de flecha), una co-localización exacta del complejo EhCPADH112 con ZO-1 se pueden observar, revelando claramente TJ como el lugar de la acción para este factor de virulencia. En contraste, como E. invasión histolytica progresó (30 min de interacción) en los epitelios, EhCPADH112 penetrado hacia el espacio intercelular como la tinción a lo largo de la membrana lateral mostró (Figura 4, puntas de flecha). En nuestro reciente documento, este método nos permitió distinguir entre TJ y AJ porque este complejo sólo co-localizada con el TJ marcadores occludin y claudin-1, pero no con el AJ marcador β-catenina en el minuto 2 de la interacción 10.
Internalización de los componentes TJ, como se puede ver en las tinciones de inmunofluorescencia en la Figura 4, por lo general se acompaña de una pérdida de la función de barrera que puede ser medida por la resistencia eléctrica transepitelial (TER). TERrefleja el flujo de iones a través de la monocapa epitelial y se puede medir utilizando electrodos como se muestra en la Figura 2B. Cuando la monocapa no está aún completamente formado o interrumpido debido a señales extracelulares, el libre flujo de iones a través de la capa de células se indica con un TER baja. TER se midió de una monocapa confluente de control que no ha estado en contacto con productos de ameba o monocapas en contacto con trofozoítos (Figura 5). Parásito contacto interrumpe la función de barrera del epitelio se indica por una caída TER del 90% en comparación con las monocapas de control. Para investigar los mecanismos por los que los trofozoítos afectan a la función de barrera, que pre-incubaron los trofozoítos con un anticuerpo contra EhCPADH112 para evitar la adhesión de este complejo o con inhibidores de la proteasa, para bloquear la actividad proteolítica de este complejo y otras proteasas importantes para el daño de la célula diana. Ambos tratamientos condujeron a una reversión casi completa de la gota de TER, lo que sugiere que tanto proteolítica actividad y adhesivos propiedades son importantes factores de virulencia de este complejo durante E. invasión histolytica.
Figura 1. Curva de crecimiento típico de E. axénicamente cultivada trofozoítos histolytica. inóculos de 2 x 10 5 trofozoítos de E. histolytica HMI-IMSS clon A se cultivaron en placas de 6 pocillos con TYI-S-33 y después de cada 24 el número de células hr se determinaron utilizando un hematocytomer. El crecimiento celular se controló por microscopía de luz y la morfología de las células en crecimiento se representa en el panel superior. La cantidad de trofozoítos se controló durante 6 días (d) y los valores se trazan en el gráfico siguiente. Los datos representan la media y el error estándar de la media de tres mediciones independientes. Bar = 10 micras./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51668/51668fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Representación esquemática de las interacciones entre las células MDCK y diferentes condiciones de E. histolytica. A) Las diferentes condiciones de E. histolytica se muestran: trofozoítos vivos (T), el total de los lisados de trofozoítos (TL) y moléculas secretadas por trofozoitos en el medio (SP). Cualquier condición experimental se ensayó para 2 y 30 min de incubación con células MDCK confluentes. Después de la incubación, las células MDCK se lavaron abundantemente para eliminar los trofozoítos o moléculas parasitarias no consolidados. A continuación se procesaron muestras para ensayos de inmunofluorescencia, empleando mαEhCPADH112 y pαZO-1 AntibodIES co-localizar la EhCPADH112 complejo parasitaria y el marcador TJ ZO-1, respectivamente. Más tarde, se utilizaron anticuerpos secundarios específicos de especie acopladas a diferentes fluorocromos para detectar ambas proteínas por microscopía confocal. B) Adición de trofozoítos sólo o trofozoítos de pre-incubaron con mαEhCPADH112 o inhibidores de la proteasa durante 20 min a 4 ° C en el compartimiento superior de los cultivos polarizados que contiene células MDCK confluentes. TER de las células epiteliales se controlará mediante un electrodo STX2 conectado a un voltohmeter EVOM, durante 30 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Localización de EhCPADH112 a TJ de monocapas de MDCK. MDCK células fueron incurebajes con trofozoítos vivos (T), el total de los lisados de trofozoítos (TL) y moléculas secretadas por trofozoitos en el medio (SP) durante 2 min. Panel superior: imágenes de contraste de fase de células MDCK. EhCPADH112 y ZO-1 se identificaron las proteínas por mαEhCPADH112 y pαZO-1 anticuerpos y luego con anticuerpos FITC-y TRITC-secundaria, respectivamente. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Flechas: localización de la proteína en los bordes de celda. Las puntas de flecha en xz planos: localización de proteínas en TJ. Bar = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Internalización de EhCPADH112 en células MDCK. Células MDCK fueron incubadas con trofozoítos vivos (T), trofozoítos total de lisados (TL) y moléculas secretadas por trofozoitos en el medio (SP) durante 30 min. Panel superior: imágenes de contraste de fase de células MDCK. EhCPADH112 y ZO-1 se identificaron las proteínas por mαEhCPADH112 y pαZO-1 anticuerpos y luego con anticuerpos FITC-y TRITC-secundaria, respectivamente. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Flechas: localización de la proteína en los bordes de celda. Las puntas de flecha en xz planos: localización de proteínas en la membrana lateral (puntas de flecha). Bar = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. E. histolytica a través EhCPADH112 induce epitelial ruptura de la barrera. monocapas de MDCK fueron incubadas con trofozoítos vivos(T) o T pre-incubadas con inhibidores de la proteasa (PI) o anticuerpo mαEhCPADH112 (α) durante 30 min y TER se evaluó en los tiempos indicados. TER se normalizó de acuerdo con el valor inicial para cada Transwell (~ 3200 Ω · cm 2). Los medios y los errores estándar de los medios se representan para cada punto de tiempo. El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 5 mediante la prueba de ANOVA de una vía. *** P <0,001.
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Discussion
Con el fin de estudiar in vitro las interacciones huésped-patógeno durante la infección epitelial por E. histolytica, es fundamental trabajar con culturas bien establecidos de ambas células epiteliales y trofozoítos. Por ejemplo, anteriormente, E. culturas histolytica usualmente se habían establecido en asociación con ciertas especies de bacterias o tripanosomátidos 22,23. Sin embargo, el co-cultivo de E. culturas histolytica es contraproducente para el estudio de las interacciones huésped-patógeno ya que los efectos observados en células huésped no podían atribuirse inequívocamente a los ameobas sino más bien podría ser un efecto de las células co-cultivadas. Por lo tanto, una cultura axenical de E. histolytica es deseable que el examen de las interacciones específicas huésped-patógeno. El protocolo al que se describe como un cultivo tales axénicos de E. histolytica puede lograr explotar específicamente ese tipo de cultivos para estudios de infección. Además, el momentode la cosecha de E. histolytica es también crítico. E. Se recomienda la cosecha histolytica durante las últimas etapas de crecimiento exponencial para asegurar un alto rendimiento de células con alta viabilidad.
Por otro lado, una monocapa bien establecida de células epiteliales también es obligatoria para obtener resultados reproducibles. Para emular una monocapa epitelial fisiológicamente apretado, células cultivadas deben ser utilizados en el momento correcto. La monocapa tiene que ser completamente formado sin agujeros. Por otra parte, la correcta formación de TJ y AJ requiere un poco de tiempo después de que se establecieron contactos celulares. Por lo general, las células epiteliales son-contacto inhibido, lo que significa que las células dejan de proliferar en una monocapa confluente, de manera que por lo general es mejor dar las células otra días de crecimiento. Sin embargo, esto no debería ser ampliado ya que esta inhibición por contacto no es indefinida y células puede en algún momento comenzará a crecer demasiado entre sí. Si esto se observa que será necesario dividir o discocélulas ARD y no los utilizan en ensayos. La formación de monocapas epiteliales apretado se controla mejor mediante la medición de TER. Sin embargo, esto requiere el crecimiento en los filtros Transwell, que son bastante caros. Para desarrollar un buen ojo para una buena monocapa puede ser útil para el investigador inexperto para comparar el crecimiento de células en el mismo formato de cultivo después de la difusión de varios números celulares.
El momento del ensayo de la interacción huésped-parásito es otro factor crucial. Después de 2 min de interacción, no se pudo observar daño epitelial sino una interacción de EhCPADH112 con la molécula TJ ZO-1 ya era evidente. Sin embargo, después de 30 min de interacción, se observó daño epitelial grave como se indica por TJ desmontaje y una gota de TER (10 y este estudio). Estos datos sugieren que una interacción adhesiva temprano con el lado apical del epitelio es necesario aflojar los contactos y permitir la penetración de otras moléculas, tales como proteasas que contribuyen a continuacióndegradación de otro TJ, AJ y desmosoma moléculas. La concentración de las proteínas trofozoítos también es importante. Es de destacar que los diferentes resultados pueden ser observados en la aplicación de los trofozoítos en vivo o simplemente lisados o productos secretados de E. histolytica. La proporción relativa de los trofozoítos a células epiteliales fue probado previamente 10 e incluso cuando la relación de MDCK-a-secretada-productos por ameba fue alta (01:10), el daño epitelial no fue tan grave. Esto indica no sólo que la concentración de una única proteína de virulencia es crítica, pero que también podría ser la interacción de diversos factores que resultan en daño epitelial eficaz para permitir la rápida invasión de amebas. Por ejemplo, el grupo de Chadee destacó la importancia de otra proteasa ameba-derivada, EhCP5, para provocar daño epitelial 16. Parece probable que una interacción de factores de virulencia in vivo es necesaria para inducir la amebiasis y que las interacciones que faltan debido a inhibition de una sola proteína puede explicar el hecho de que en la mayoría de los casos las infecciones son de reposo. A este respecto, también es importante mencionar que los productos epiteliales tales como las mucinas son importantes para proteger contra la infección. En particular, mucin2 ronda los ratones son más susceptibles a las alteraciones inducidas por TJ EhCP5 e infección 16. Por lo tanto, también deben tenerse en cuenta para evaluar la invasividad ameba alteraciones en el lado epitelial.
Una limitación importante de las tecnologías descritas para detectar co-localización es que no se demuestra de forma inequívoca una interacción directa. En este caso, una interacción co-localización o podría ser también mediado por otra proteína que no se visualiza. Para detectar una interacción directa, será necesario para producir proteínas recombinantes etiquetadas (tales como GST o 10xHis) y llevar a cabo la inmunoprecipitación de una etiqueta y Western blot para el otro. De todas formas, tinciones de inmunofluorescencia tienen la ventaja de revelar el exalocalización celular ct del complejo de proteínas y dar al experimentador una idea de las proteínas que deben ser probadas en un ensayo de interacción como in vitro. Otro inconveniente es que hay muy pocos anticuerpos amebas específicos disponibles. Por lo tanto, si se quiere estudiar ciertas proteínas de amebas en tales estudios de interacción, lo más probable es que requieren la generación de un anticuerpo. Sin embargo, si los anticuerpos están disponibles, los métodos descritos se pueden aplicar para estudiar la relevancia de otras proteínas de ameba (secretada o unida a la superficie) para la interacción huésped-patógeno.
En este trabajo se describe un modelo fácil de detectar co-localización y de las interacciones entre las moléculas del huésped y el parásito. El conocimiento adquirido a partir de estos experimentos basados en células se puede aplicar in vivo en modelos de infección utilizando hámsteres o ratones para corroborar la relevancia fisiológica para la invasión del huésped por el parásito. Estos datos podrían ser utilizados para el desarrollo de estra tratamiento novedosogias.
En resumen, ofrecemos protocolos detallados para el cultivo de E. histolytica y las células epiteliales para el uso en estudios de interacción huésped-patógeno, en particular, los ensayos que permiten la evaluación de co-localización y TJ desmontaje. El momento de las culturas, así como la de cada ensayo es crucial para asegurar la reproducibilidad de los resultados obtenidos. Mientras que el calendario de las culturas puede ser influenciada por la variación del número de células diseminadas, la temporización de los propios experimentos depende del tipo de ensayo y el tipo de proteínas investigadas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/ml |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ml |
| Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6-Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/ml |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/ml |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75 cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24-well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
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