Summary
Combinatorie 5 proteine fluorescenti marcatura di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche consente il monitoraggio in vivo clonale tramite confocale e microscopia a due fotoni, fornendo approfondimenti midollo osseo emopoietico architettura durante la rigenerazione. Questo metodo permette di mappatura destino non invasiva di cellule HSPCs derivate spettralmente-codificati nei tessuti intatti per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto.
Abstract
Abbiamo sviluppato e convalidato un marchio metodologia per il monitoraggio clonale di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) con alta risoluzione spaziale e temporale per studiare in vivo ematopoiesi con il trapianto di midollo osseo modello sperimentale murino fluorescente. Marcatura utilizzando vettori lentivirali codificanti per proteine fluorescenti (PQ) combinatoria genetica ha permesso la mappatura destino cellulare attraverso avanzate di imaging microscopia. Vettori codificano cinque diversi PQ: Cerulean, EGFP, Venere, tdTomato, e mCherry sono stati usati per trasdurre HSPCs contemporaneamente, creando una tavolozza variegata di cellule di colore marcato. Imaging utilizzando confocale / microscopia a due fotoni ibrido consente la valutazione simultanea alta risoluzione delle cellule marcate in modo univoco e la loro progenie in combinazione con componenti strutturali dei tessuti. Volumetrica analisi su grandi aree rivelano che le cellule HSPC-derivate spettralmente codificati possono essere rilevati in modo non invasivo in vari tessuti intatti, tra cui il midollo osseo (BM), Per lunghi periodi di tempo dopo il trapianto. Studi in diretta conciliano multiphoton di video-rate e confocale time-lapse imaging in 4D dimostrano la possibilità di tracciamento cellulare e clonale dinamica in maniera quantitativa.
Introduction
La produzione di cellule del sangue, ematopoiesi definito, è gestito da una piccola popolazione di staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs). Queste cellule risiedono nel midollo osseo (BM) in una nicchia microambientali complesso costituito da osteoblasti, cellule stromali, tessuto adiposo, e le strutture vascolari, tutti implicati nel controllo di auto-rinnovamento e differenziazione 1,2. Come intatto BM è tradizionalmente inaccessibile alle osservazioni dirette, le interazioni tra HSPC e il loro microambiente rimane in gran parte indefinita in vivo. In precedenza, abbiamo stabilito una metodologia per visualizzare l'architettura 3D della BM intatta utilizzando confocale a fluorescenza e riflessione microscopia a 3. Abbiamo caratterizzato l'espansione di EGFP-marcati HSPCs nel BM, ma l'uso di una sola FP escludessimo analisi di rigenerazione a livello clonale. Molto di recente abbiamo approfittato della lentivirali Gene Ontology (Lego) i vettori che esprimono costitutivamente flproteine uorescenti (FPS) per contrassegnare in modo efficiente le cellule 4,5. Co-trasduzione del HSPC con 3 o 5 vettori genera una tavolozza variegata di colori combinatorie, consentendo il monitoraggio di molteplici singoli cloni HSPC.
Contrassegnato HSPC combinato con nuova tecnologia di imaging permesso di tracciare individuale homing HSPC e attecchimento nel BM di topi irradiati. Vettori lego sono stati usati per marcare HSPC con 3 o 5 diversi fps (da Cerulean, eGFP, Venere, tdTomato, e mCherry) e seguire il loro attecchimento nel tempo nel BM mediante microscopia confocale e 2-fotone, consentendo la visualizzazione chiara delle ossa e di altri strutture a matrice, e la relazione di cloni HSPC ai componenti del loro microambiente. HSPC sono stati purificati come le cellule negative lignaggio da C57Bl / 6 topi BM, trasdotte con vettori lego, e reinfuse tramite iniezione vena della coda in topi congenici mielo-ablato. Monitorando grandi volumi del tessuto sterno BM abbiamo visualizzato attecchimento endostale si verificano primaRigenerazione BM. Gruppi di cellule con spettri di colore diversi apparso inizialmente in prossimità all'osso e progredito a livello centrale nel corso del tempo. È interessante notare che, dopo più di 3 settimane il midollo costituito da ammassi clonali macroscopici, suggerendo diffusione della emopoiesi derivati dalle singole HSPCs contiguo nel midollo, invece di ampia diffusione HSPCs attraverso il flusso sanguigno. C'era meno diversità di colore in momenti in ritardo, suggerendo difficoltà di trasduzione a lungo termine ripopolare le cellule con più vettori.
Inoltre, HSPCs formata cluster nella milza, un organo responsabile anche per emopoiesi nei topi. Singole celle HPSC-derivati potrebbero essere risolti nel timo, linfonodi, milza, fegato, polmoni, cuore, pelle, muscolo scheletrico, tessuto adiposo, e reni pure. Le immagini 3D possono essere valutati qualitativamente e quantitativamente per apprezzare la distribuzione di cellule con perturbazioni minime dei tessuti. Infine, illustriamod la fattibilità di studi dinamici live in 4D, combinando multifotonica scansione di risonanza e confocale time-lapse imaging. Questa metodologia consente non invasiva alta risoluzione, multidimensionale cellula-destino tracciato di spettralmente contrassegnati cellule popolazioni nella loro architettura 3D intatta, fornendo un potente strumento per lo studio della rigenerazione dei tessuti e della patologia.
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Protocol
Tutti i topi sono stati alloggiati e trattati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health, e iscritti in un protocollo di cura e uso degli animali NHLBI Comitato approvato. Femmina B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) e C57BL / 6 topi, 6-12 settimane di vita, sono stati utilizzati come donatore e del ricevente, rispettivamente.
Un elenco di materiali, reagenti e attrezzature sono fornite nella tabella 1.
1 Lego trasduzione del mouse HSPCs e Trapianto di Midollo Osseo
Eseguire le procedure descritte di seguito in un livello di biosicurezza certificata 2 (BSL-2) Armadio (cappa di coltura di tessuti).
- Produzione di lego vettori di codifica 5 fps
- Utilizzare il lentivirali "Gene Ontology" (Lego) plasmidi vettori, ognuno che codifica per una diversa FP di un forte promotore SFFV costitutivo, tra cui lego-CER2 (Cerulean), lego-G2 (EGFP), lego-V2 (Venere), lego-T2 (tdTomato), e lego-C2 (mCherry) gentilmente fornito dal Dr. Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Amburgo, Germania); ora disponibili anche da Addgene 5-7.
- Per produrre vettori LEGO, semi di 5 x 10 6 cellule 293T in 10 piatti cm (utilizzare 12 piatti per ogni vettore) 24 ore prima della trasfezione in 8 ml di I10 supporti (IMDM supplementato con 10% FCS e glutammina / penicillina / streptomicina).
- Trasfezione le cellule con fosfato di calcio con le raccomandazioni del kit CAPHOS leggermente modificati:
- Per ogni mix piatto 15 mg Lego vettore, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT, e 1 mg plasmidi pMD2.G-VSV-G in presenza di 50 microlitri 2,5 M CaCl 2, e aggiungere acqua per produrre un volume totale di 500 microlitri.
- Plasmidi di DNA precipitato con 500 ml di 2x HeBS (HEPES-Buffered Saline) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente prima di aggiungere ad ogni piatto di cellule 293T.
- Incubare le cellule per6 ore a 37 ° C 5% di CO 2 incubatore; rimuovere il supporto e aggiungere fresco cultura mediatica 6 ore dopo la trasfezione.
- Raccogliere surnatanti di coltura contenente particelle lentivirali da ogni piatto, ogni giorno, per 3 giorni. Ogni collezione surnatante giorno successivo aggiungere media I10 fresco a ogni piatto.
- Filtrare 0,22 micron pori, piscina e concentrarsi surnatanti di ultracentrifugazione su un rotore SW28 per 2 ore a 71.900 xg e 4 ° C.
- Risospendere il surnatante in 1 ml di StemSpan media. Aliquota le scorte lentivirali in 200 ml e conservare a -80 ° C.
- Titolazione di particelle lentivirali
Determinare il titolo di particelle vettoriali Lego in surnatanti raccolti attraverso la quantificazione di trasduzione unità / ml utilizzando cellule NIH3T3. I titoli permettono di calcolare il volume di ciascun supernatante vettoriale necessaria per provocare la molteplicità relativa desiderata di infezione (MOI) per porta sperimentalecellule.- Tavola 5 x 10 4 NIH3T3 cellule per pozzetto (12-pozzetti) in 2 ml di mezzi I10 un giorno prima della titolazione.
- Preparare diluizioni seriali 5-fold di surnatanti vettoriali in mezzi I10 integrato con solfato di protamina (4 mg / ml è 1,000x).
- Rimuovere il supporto dalle cellule, e sostituirlo con 500 ml di diluizioni surnatante contenente l'equivalente di 2, 0,8, 0,32 e 0,128 ml di virus concentrati.
- Determinare il numero (n) di cellule per pozzetto presenti al momento della trasduzione, contando pure un controllo.
- 6 ore dopo la trasduzione, aggiungere 2 ml di media I10 e incubare per 3 giorni a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Raccogliere le cellule da ogni pozzetto usando tripsina-EDTA, e determinare la percentuale di cellule fluorescenti (% FP) mediante citometria a flusso.
- Calcolare il titolo come segue, la media dei titoli ottenuti per ciascun bene (diluizione) con una conseguente FP% tra il 1 e il 50%: titolo (particelle vettore / ml) = nx% FP / volume di surnatante vettore (ml). Calcolare la media dei titoli ottenuti per ciascuna diluizione se la FP% è compreso tra 1 e 50%.
- Raccolta delle cellule del mouse, Purificazione, trasduzione, e Trapianti (schematicamente illustrato in Figura 1A adattato da Malide et al. 4).
- Sacrifica topi donatori da una procedura approvata. Raccolta di midollo osseo da anteriore e posteriore degli arti: sezionare omeri, trovarsi femori e tibie, rimuovere completamente tutto muscoli, legamenti e tessuto in eccesso da ossa, tagliare tutta la fine di ogni osso il più vicino possibile al giunto, e lavare il midollo osseo di l'osso utilizzando un ago G 27-0 su una siringa contenente supporti I10.
- Agglomerare le intere cellule di midollo osseo per 10 min a 500 xg, a 4 ° C e lisare i globuli rossi due volte con 50 ml di tampone ACK. Risospendere le cellule in 10 ml di mezzi I10.
- Purificare (Lin-) cellule progenitrici lignaggio negativi con il kit di lignaggio esaurimento MACS secondo un kit Protoco modificatol:
- Utilizzare 30 ml di microsfere anti-biotina invece di 10 ml / 10 7 cellule; completare le fasi di lavaggio con i media I2 (IMDM integrato con il 2% FCS) al posto del tampone.
- Inserire una fase di lavaggio tra l'incubazione con Cocktail biotina-anticorpo e l'incubazione con anti-biotina microsfere; ed equilibrare la colonna con I10 posto del tampone.
- Culture cellule LIN- per 48 ore ad una densità iniziale di 5 x 10 5 cellule / ml in mezzi StemSpan supplementato con 10 ng / ml di IL-3 murino, 100 ng / ml di IL-11 murina, 100 ng / ml umano Flt-3 ligando, e 50 ng / ml fattore delle cellule staminali murine.
- Trasferimento da 1 a 4 x 10 5 cellule a 12 pozzetti piastre rivestite con RetroNectin e trasdurre con surnatanti Lego, ciascuna ad una molteplicità di infezione (MOI) di 6-7 per ottenere il 50% di efficienza di espressione per ogni FP, in presenza di StemSpan media e citochine dettagliati sopra e 4 mg / ml di solfato di protamina.
- Trasdurre cellulecon ogni vettore Lego singolarmente come descritto al punto 1.3.5 e mescolare le cellule dopo trasduzione (chiamato Mix) o co-trasdurre cellule con tutti i surnatanti 5 Lego vettoriali contemporaneamente (chiamato Co). Rimuovere le cellule 24 ore più tardi, lavare una volta con StemSpan media senza citochine, e risospendere in mezzi StemSpan senza citochine per il trapianto, o trasferirli su supporti fresco con citochine, e di cultura per ulteriori 96 ore prima di microscopia confocale e citometria a flusso.
- Eseguire trapianto di midollo osseo infondendo trasdotte Lin- HSPCs tramite iniezione in vena della coda 11 monodose Gy destinatari pre-irradiati (6-18 ore prima del trapianto) i destinatari, in un volume di 100 l, ad una dose di cellule per topo corrispondente a 1 cellule -4 x 10 5 Lin- originariamente placcato per la trasduzione. In ogni esperimento, trapianto di un'intera coorte di animali con la stessa popolazione di cellule del midollo osseo del donatore trasdotte.
- Per la caratterizzazione in vitro di trasdotte HSPC, la cultura le cellule per ulteriori 4-5 giorni in StemSpan completato con citochine e analizzare mediante citometria a flusso per efficienza di trasduzione, e al microscopio per la diversità di colore.
- Sacrificio singoli topi e recuperare tessuti e organi per l'imaging, a vari tempo indica fino a 120 giorni post-trapianto.
- Spruzzare con etanolo la pelliccia del mouse e incidere la pelle sul lato ventrale evitando capelli diffusione.
- Sezionare e accise secondo le procedure standard della milza, linfonodi poplitei, polmoni, cuore, pelle, tessuto adiposo, muscolo scheletrico, rene, fegato, così come la testa di accesso ai calvaria.
- In alternativa, utilizzare calvaria o impostare una finestra ossea per l'imaging dal vivo più volte nel corso del tempo 2,8,9 o immagine organi superficiali come i nodi della pelle e linfonodi in animale vivo.
- Mettere singoli organi in 35 millimetri piastre di coltura numero 0 copertura in vetro a 50-10056, l PBS per l'imaging intatti, senza sezionamento, fissazione o ulteriore lavorazione come descritto al punto 2.5.
- Per l'imaging volumetrico, mantenere gli organi in in PBS freddo fino al momento dell'uso. Per time-lapse imaging procedere immediatamente al di imaging di organi in DMEM, 10% FBS contenenti 20 HEPES mM a 37 ° C
- Sacrificio singoli topi e recuperare tessuti e organi per l'imaging, a vari tempo indica fino a 120 giorni post-trapianto.
2 confocale e microscopia a due fotoni e Image Analysis
- Eseguire immagini di microscopia utilizzando un sistema a cinque canali confocale e multiphoton Leica SP5 dotato di multi-linea Argon, diodo 561 nm, 594 nm HeNe, e HeNe 633 nm laser visibili. Utilizzare in modalità 2-fotone, un femtosecondi pulsata Ti: zaffiro (Ti-Sa) laser, sintonizzabile per l'eccitazione da 680 a 1.080 nm con correzione dispersione. Utilizzare in esperimenti che coinvolgono rosso-spostato PQ (tdTomato e mCherry), un oscillatore parametrico ottico (OPO) laser per estendere la gamma di lunghezze d'onda di uscita fino a 1,030-1,300 nm, in sequenza o simultaneamente con tegli Ti-Sa laser.
- Immagine vari tessuti utilizzando una HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA obiettivo immersione acqua (WD = 2,5 mm), a-PLAPO CS HC-20X / 0,70 obiettivo NA secco (WD = 0.6 mm), o HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA obiettivo di immersione in acqua (WD = 0.6 mm).
- Ottenere confocale spettri di fluorescenza di raccolta pile lambda (xyλ) della luce emessa in 5 nm-larghezze di banda dello spettro visibile dalle cellule BM trasdotte con un singolo FP Lego vettore, nonché di controllo, non-trapiantato BM.
- Immagini di processo con il software Leica LAS v2.4.1-AF per creare spettri di riferimento di tutti i 5 fps, nonché di autofluorescenza (Figura 2A). Utilizzando l'individuo spettri FP e la differenza di luminosità fluorescenza (espressa in% di EGFP) di Cerulean (79%), Venere (156%), tdTomato (283%) e mCherry (47%) impostato 5 canali di imaging in sequenza come segue: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venere (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), e mCherry (594 / 618-670 nm) (
- Convalidare separazione accurata PQ, come le cellule trasdotte con ogni singolo FP sono visibili solo nel canale corrispondente e assente dal resto (Figura 2C). Inoltre, questo approccio multi-canale definito crea un "colorprint" uniche a 5 canali che consente la successiva analisi del colore e il monitoraggio clonale e ha il vantaggio di ridurre i tempi di acquisizione rispetto alle immagini spettrali.
- Immagini di processo con il software Leica LAS v2.4.1-AF per creare spettri di riferimento di tutti i 5 fps, nonché di autofluorescenza (Figura 2A). Utilizzando l'individuo spettri FP e la differenza di luminosità fluorescenza (espressa in% di EGFP) di Cerulean (79%), Venere (156%), tdTomato (283%) e mCherry (47%) impostato 5 canali di imaging in sequenza come segue: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venere (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), e mCherry (594 / 618-670 nm) (
- Emissione di fluorescenza separato, in modalità 2-fotone, da alta efficienza specchi dicroici personalizzato e raccogliere con un quattro canali non descanned rivelatore (NDD) come segue: uno specchio dicroico a 568 nm seguito da uno specchio dicroico a 465 nm, seguita da un filtro di emissione 452/45 nm per SHG o autofluorescenza e cerulea, un filtro 525/40 nm di emissione per EGFP o Venere, e uno specchio dicroico 648 nm e 620/60 nm filtro delle emissioni per tdTomato o mCherry.
- Rivelare informazioni strutturali da microscopia a due fotoni isegnale (SHG) da ossa e del collagene fibrillare (eccitato a 920 nm o 860 nm raccolti in una dispersa posteriore imaging contrasto ntrinsic (come descritto sopra) di autofluorescenza dei tessuti da elastina, NADH, (eccitato a 780 nm), e la seconda armonica generati direzione) 10,11.
- Per volume rendering 3D, raccogliere le serie di immagini xyz (tipicamente 1 x 1 x 4 micron 3 dimensioni voxel) lungo l'asse z a 5 micron intervalli su una gamma di profondità (150-300 micron) in tutto il midollo osseo e altri tessuti, su vaste regioni utilizzando la funzione piastrella del software per generare automaticamente i volumi cuciti comprendente un intero fossa sterno, circa 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) e 300 micron (z) (figure 2D-2E) e Movie 1.
- Immagine cranica il midollo direttamente attraverso il cranio, senza sezionamento 2, 8.
- Sezione sterno lungo il piano sagittale (bisezione) e poitrasversalmente al giunto tra 2 sternale fossato e immagine attraverso il taglio faccia 3,4,12 (Panoramica Figura 1B adattato da Takaku et al 3).
- Per 4D time-lapse imaging, posizionare asportati recentemente poplitea linfonodi, milza, polmone, o campioni calvaria non tagliata da 35 mm piatti della cultura numero 0 coprioggetti, in 50-100 ml DMEM 10% FBS contenente 20 HEPES mM a 37 ° C e utilizzare 2-fotone Ti-Sa di eccitazione (860 nm) combinata con l'eccitazione confocale (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) e Leica scanner di risonanza (8000 Hz / sec), prendendo z-stack (~ 80 micron) ad intervalli di 20 sec per un massimo di 1 ora.
- Per simultaneo a tre colori impiego di imaging 2P Ti-Sa sintonizzati a 860 nm contemporaneamente con il laser OPO (sintonizzato a 1.130 nm per tdTomato, o 1.140 nm mCherry) (Movie 2).
- Ricostruzione e analisi dei volumi 3D e sequenze temporali 4D
- Utilizzare Imaris x64 softwsono dati di cellule fluorescenti all'interno del midollo osseo e diversi tessuti e di esportarle come filmati 3D-rotazione versione 7.6, o pacchetti software alternativi per trasformare i-pile di tegole di immagini grezzi in volume rendering (3D), come descritto in precedenza 3,4 (Film 1) step-by-step esempio:
- In Imaris, Aprite l'immagine z-stack; Selezionare "Superare" per visualizzare la visualizzazione volume 3D.
- Utilizzare "navigare" per alzare il volume intorno a 360 °.
- Selezionare "Animazione" per creare un'animazione; utilizzare fotogrammi chiave per aggiungere viste selezionate, zoom, rotazioni del volume; Visualizzare in anteprima il filmato, modificare come necessario e salvare il file in un formato filmato desiderato (es: avi, mov).
- Per la valutazione quantitativa delle cellule e di clone di frequenza 3D, posizioni, dimensioni e distribuzione, ulteriore processo gli z-stack utilizzando i moduli Imaris XT che integrano applicazioni MATLAB spettacolo meas distanzamisurazio- (utilizzando un algoritmo di trasformazione distanza) e cluster analisi, come descritto in precedenza 3,4. Trasforma le sequenze di pile di immagini nel corso del tempo in quattro dimensioni (4D) film volumi rendering con il software x64 Imaris, e utilizzare spot e analisi di superficie per il monitoraggio semiautomatico della motilità cellulare in tre dimensioni utilizzando algoritmi di movimento autoregressivi.
- Eseguire l'analisi multispettrale delle cellule come segue: estrarre il multi-colore spot etichettati con l'aggiunta di tutti i 5 canali attraverso il canale aritmetica dei Imaris XT in un nuovo canale; determinare per tutti i punti (celle) l'intensità di fluorescenza media in ciascuno dei canali dei componenti 5. Esportare i valori nel software Excel per tracciare i grafici che mostrano il "colorprint" unico ovvero la relativa% di ogni FP a singola cellula (Figura 2E grafico). Correggere i set di dati per la deriva dei tessuti, e calcolare la velocità delle cellule e lo spostamento nel tempo, le lunghezze delle tracce, percorsi e distanze; I valori di esportazione in Excel software per tracciare grafici. Montare figure composite con Adobe Photoshop software CSS 5.
- Utilizzare Imaris x64 softwsono dati di cellule fluorescenti all'interno del midollo osseo e diversi tessuti e di esportarle come filmati 3D-rotazione versione 7.6, o pacchetti software alternativi per trasformare i-pile di tegole di immagini grezzi in volume rendering (3D), come descritto in precedenza 3,4 (Film 1) step-by-step esempio:
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Representative Results
Whole-mount 3D confocale / 2-fotoni microscopia ricostruzioni del corso sternale tempo il midollo osseo ha rivelato l'attecchimento e l'espansione dei trapiantati co-5fps in un modello con caratteristiche notevoli: cloni apparso chiaramente delineata, omogeneamente contrassegnati con ampia gamma di colori inizialmente e di progresso nel tempo per contenere preferenzialmente cellule principalmente un colore. Installazione di microscopia confocale ed esempi rappresentativi di immagini 5fps-segnato HSPC nel midollo osseo sternale sono illustrati nella Figura 2 e filmati 1 e 2.
Whole-mount ricostruzioni 3D di microscopia confocale / 2-fotone di tessuti intatti dimostrano la possibilità di tracciare il destino di colore contrassegnato cellule BM-derivati per periodi di tempo prolungati nei tessuti vivi. Esempi rappresentativi di cellule del midollo osseo derivate in ematopoietiche e non-ematopoietiche organi dopo il trapianto sono mostrati in Fi figura 3.
Figura 1 Panoramica delle procedure sperimentali. A) Le fasi schematiche illustrano isolamento delle cellule Lin- BM, trasduzione con vettori di Lego che codifica per una vasta gamma di varianti di colore fps, e reinfusione di cellule trasdotte in-mielo-ablazione topi (trapianto di midollo osseo). B) del midollo osseo (sterno, calvaria ), così come i vari organi / tessuti sono stati esaminati mediante microscopia confocale e due fotoni in diversi momenti dopo il trapianto. Pannello A è adattato dalla figura 1 in Malide et al. 4 e Panel B adattato dalla figura 1 in Takaku et al 3.
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Figura configurazione 2 confocale microscopia e di imaging per esempio rappresentativo 5fps-segnate HSPC nel midollo osseo. A) Spectral (xyλ) di imaging utilizzata per registrare spettri di emissione di riferimento per ogni FP, illustrato in istogrammi normalizzati pseudocolored con ciano (Cerulean), verde (EGFP), giallo (Venere), magenta (tdTomato) e rosso (mCherry): eccitato da 594 NM- (linea rossa continua) rispetto ai 561 NM- (linea rossa tratteggiata) lunghezza d'onda B) Cinque canali impostati immagine emissione sequenziale di:. Cerulean (468-482 nm), EGFP (496-514 nm), Venere ( 523-558 nm), tdTomato (579-597 nm) e mCherry (618-670 nm). Pannelli A e B sono adattati dalla figura 1 in Malide et al. 4 C) Imaging di sternale BM da topi trapiantati con trasdotte con i singoli vettori FP. Ogni FP era visibile solo nelle cellule trasdotte con il corrispondente vettore ripreso nel cap appropriatoAnnel, e assente dagli altri (non cross-talk). D, E) Attecchimento e ampliamento del trapiantato co-5FP contrassegnati cellule del midollo osseo in vivo. Al 4 ° giorno post-trapianto (D) gruppi di cellule marcate in un'ampia varietà di colori erano visibili vicino al bordo dell'osso (SHG, bianco), preferenzialmente adiacente alla giunzione tra due fossa. Di giorno 30 (E) una grande clone di colore unico (verde - giallo) si è espanso per occupare l'intera fossa come illustrato nella fuse così come canali singole immagini. PQ analisi del contenuto dimostra omogenea marcatura del 2 PQ varianti EGFP e Venere.
Figura 3 Esempi di cellule del midollo osseo derivate in ematopoietiche e non-ematopoietiche organi dopo il trapianto. Tis VarieSues e gli organi sono stati ripresi intatti attraverso una profondità di 150-200 micron e grandi superfici, computazionalmente cuciti e resi in 3D come ricostruzioni ombra. A) linfonodo popliteo a 120 giorni dopo il trapianto dimostra cellule sparse per lo più contrassegnate in giallo (Venere) e rosso (mCherry) perifericamente circondato da fibre di collagene (bianco, SHG). B) Allo stesso modo, la milza, allo stesso tempo, mostra piccoli gruppi e cellule per lo più sparsi di vari colori intrecciati da fibre di collagene rete. C) nelle cellule fluorescenti fegato con morfologia suggestiva delle cellule stellate, o macrofagi (cellule di Kupffer) di vari colori sono stati allineati lungo rete fibre di collagene (SHG bianco) delineare epatiche strutture lobulare. D) In un lembo cutaneo ripreso dalle cellule fluorescenti laterali dermica di diversi colori e morfologie sono stati osservati, la maggior parte con grandi dimensioni e morfologia suggerendo l'identità di Langerhan o dendritiche-like, LYIng in fibre di elastina (autofluorescenza a 780 nm, bianco) e lungo il collagene (SHG a 920 nm, bianco) fibre muscolari e follicoli piliferi. E) Nel cuore visto dal lato epicardico numerose cellule singole grandi fluorescenti con macrofago-come morfologia originario da più cloni in base ai diversi colori osservati sono visibili superficialmente e anche intervallati profonda tra cardiomiociti (bianco) visualizzati con la loro intrinseca autofluorescenza a due fotoni (a 780 nm). Non sono state osservate cardiomiociti fluorescenti FP. Cellule vicine (CE) dello stesso colore indicano nella proliferazione situ e di breve distanza di migrazione. F) Nel polmone numerose cellule fluorescenti con una gamma diversificata di colori sono stati sparsi in tutta la struttura pizzo-come fibre di collagene (SHG) a tutti di profondità livelli, con morfologie variabili suggerendo identità delle cellule, macrofagi, e di tipo 2 pneumociti dendritiche.
Movie 1 3D recostruzione di sternale BM a 4 giorni dopo il trapianto Co 5 fps. gruppi di cellule marcate in un'ampia varietà di colori erano visibili in prossimità del bordo dell'osso (SHG, bianco), preferenzialmente adiacente alla giunzione tra due fossa. Cliccate qui per visualizzare questo filmato.
Movie 2 4D lasso di tempo sternale BM a due fotoni e microscopia OPO al giorno 39 post-trapianto Co 3 fps (Cerulean - bianco, Venere - giallo, tdTomato - magenta) osso (SHG in bianco). Nota vari cloni statici segnalati in giallo o in combinazione giallo-magenta adiacente all'osso in contrasto con singole cellule progenitrici mieloidi altamente mobili. Cliccate qui per vedere questo film.
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Discussion
Descriviamo qui i dettagli di una potente metodologia recentemente messo a punto per il monitoraggio cellulare clonale, che unisce la grande diversità generata contrassegnando con-5FP codifica vettori Lego e l'imaging confocale con tandem e microscopia a 2 fotoni per ottenere volumetrico e l'imaging dinamico in tessuti vivi combinatorio. Questo ha esteso l'uso della marcatura registrando confocale identità spettrale in 5 "distinti" canali a 8-bit di colore a base di FP. Così il relativo rapporto di Cerulean, EGFP, Venere, tdTomato, mCherry all'interno di ogni cellula crea un "colorprint" unico per l'identificazione della progenie clonale. L'etichettatura multicolor da 5 fps aumenta la tavolozza etichetta con più diversità, che è stato mostrato particolarmente utile quando si studia la distribuzione, i contatti, gli accordi in cotto e le interazioni competitive tra le cellule o gruppi di cellule dello stesso tipo in campioni di tessuto denso. Combinato con 2-fotone eccitazione di caratteristiche strutturali intrinseche dei vari tessuti eorgani, si possono tenere traccia di colore contrassegnato cellule clonali nel loro ambiente nativo, senza la necessità di fissazione e sezionamento fisico. La dimostrazione che le cellule figlie derivate da singoli progenitori mantengono un caratteristico "color-print", nonostante la differenziazione e la proliferazione è stata dimostrata nel nostro studio pubblicato, con centinaia di cellule differenziate presenti in colonie singole in vitro (CFU) che mostra lo stesso "colorprint."
Questo approccio combina i vantaggi della singola cellula risolto imaging ad alta risoluzione, corredata sezionamento ottico mediante microscopia confocale. Molto grandi x - regioni del volume di tessuto denso intatto y (mm 2) possono essere esaminati mediante la generazione di-immagini affiancate. Queste immagini ad alta risoluzione di sezioni ottiche possono essere utilizzati per ricostruire computazionalmente (automaticamente e "on-the-fly") volumi completa 3D di grande complessità a una profondità di ~ 30 micron, comprendente ~ 20-30 strati di cellule,vascolare, l'osso e le strutture di collagene. Ricostruzioni 3D possono essere utilizzati per morfometriche analisi quantitative non invasive di interesse biologico. Un avvertimento importante da sottolineare è che grande volume / imaging ad alta risoluzione è in termini di tempo, per esempio 1 ora per ~ 1 mm 3 di tessuto (una fossa dello sterno), pertanto si consiglia di imaging non più di 1 per ogni esperimento del mouse per giorno in cui il midollo osseo, così come diversi tessuti devono essere esaminate in dettaglio.
Anche se attualmente è tecnicamente impossibile per l'immagine del midollo osseo sternale nello stesso topo ripetutamente nel corso del tempo, preziose informazioni può essere ottenuto studiando topi individuo in tempi diversi da una coorte originariamente trapiantato con la stessa popolazione di cellule Lin- lego-trasdotte. Lo sterno è una posizione eccellente per studiare la rigenerazione del midollo osseo a causa della sua precoce e completa ricostituzione emopoietica, stabilità, facilità di sezionamento, riproducibilità, e grande volume. E 'fondamentale per raggiungere quasi il 50% efficienza di trasduzione delle cellule Lin- per ogni singolo vettore FP, prima di procedere con un esperimento di trapianto e l'imaging, al fine di disporre di colore diversità sufficiente e FP-esprimono le cellule per rendere l'esperimento informativo. Ci sarà sempre un avvertimento che più di un clone può per caso finisce con Colorprints simili o identici, in particolare se la trasduzione è cellule inefficienti e molti hanno solo uno o due inserimenti. E 'anche importante essere sicuri che ogni iniezione coda vena individuale consegnato quasi il 100% della dose cellulare.
Questo dimostra la fattibilità di alta risoluzione 4D vivere studi dinamici combinando multifotonica scansione di risonanza e confocale time-lapse imaging. Esso consente non solo la caratterizzazione statica di vari cloni ma anche l'analisi delle differenze cinetiche tra celle contrassegnate dal colore stesso. Inoltre dimostra di video-rate 4D imaging tre PQ campioni etichettati impiegano successfully in tandem Tisa e OPO laser per una maggiore efficienza, meno dannoso, più profonda penetrazione del tessuto vivo, aprendo la strada a 2-Photon Imaging intravitale. Inoltre, stabilisce una valida opzione per monitorare le cellule per periodi prolungati (mesi) superando le limitazioni a base di coloranti correnti. Questo approccio utilizza commercialmente disponibile confocale laser e microscopio a due fotoni e metodi di analisi immagine dall'utente interattivo automatizzati basati su un pacchetto software disponibile in commercio che consente una facile implementazione nei consueti servizi di microscopia.
Infine, questa metodologia non è limitata all'analisi di HSPCs. Molti sistemi biologici potrebbero beneficiare della capacità di risolvere modalità spazio-temporali di elementi cellulari e strutturali clonale complesse tramite l'etichettatura multicolore e confocale e di imaging 2-fotone. Rigenerazione degli organi, le risposte immunitarie, e tumori metastatici modelli potrebbero essere interrogati, a suggerire solo alcune applicazioni potenziali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Production of Viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µg/ml is 1,000x |
| Recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µg/ml is 2,000x |
| Recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µg/ml is 2,000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µg/ml is 1,000x |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspend at 50 µg/ml |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | 4 µg/ml is 1,000x |
| Confocal and Two-photon Microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverslips 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane | ||
References
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