Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

من Voxels إلى المعرفة: دليل عملي للتجزئة مجمع المجهر الإلكتروني 3D-البيانات

Published: August 13, 2014 doi: 10.3791/51673
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1, 1, 1,2
1Life Sciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Joint Bioenergy Institute, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 3National Energy Research Scientific Computing Center, Lawrence Berkeley National Laboratory

Summary

عنق الزجاجة للالخلوي المجهر الإلكتروني 3D هو ميزة استخراج (تجزئة) في غاية التعقيد خرائط كثافة 3D. قمنا بتطوير مجموعة من المعايير، التي توفر توجيهات بشأن النهج الذي تجزئة (دليل، وشبه الآلي، أو الآلي) هو الانسب لأنواع مختلفة من البيانات، وبالتالي توفير نقطة انطلاق لتجزئة فعالة.

Abstract

وقد سمحت النهج الحديثة المجهر الإلكتروني 3D مؤخرا فكرة غير مسبوقة في المنظمة 3D التركيبية للخلايا والأنسجة، مما يمكن التصور من آلات الجزيئات الكبيرة مثل المجمعات الالتصاق، فضلا عن الهياكل العليا، مثل الهيكل الخلوي والعضيات الخلوية في حياتهم خلية منها والسياق الأنسجة. بالنظر إلى التعقيد الكامن من وحدات التخزين الخلوية، فمن الضروري لاستخراج أول ملامح الفائدة من أجل السماح التصور، الكمي، وبالتالي فهم تنظيم 3D بهم. يتم تعريف كل مجموعة من البيانات الخصائص المميزة، على سبيل المثال، نسبة، هشاشة (الحدة) إشارة إلى الضجيج للبيانات، عدم تجانس معالمه، زحام ميزات، وجود أو عدم وجود الأشكال المميزة التي تسمح لسهولة تحديد الهوية، ونسبة من حجم كامل أن منطقة محددة من الفائدة تحتل. لا بد من النظر في جميع هذه الخصائصعند اتخاذ قرار بشأن التي تقترب لاتخاذ لتجزئة.

مجموعات 3D مختلفة ستة البيانات التركيبية عرض تم الحصول عليها من قبل ثلاثة التصوير نهج مختلف: الراتنج جزءا لا يتجزأ من التصوير المقطعي الإلكترون الملون، ركز ايون beam- وكتلة تسلسلي المسح face- المجهر الإلكتروني (SEM-الاكذوبه، SBF-SEM) من عينات الملون والمعشق أقل ما يقال بشدة ، على التوالي. لهذه مجموعات البيانات، تم تطبيق أربعة نهج تجزئة مختلفة: (1) جاء اليدوي بالكامل بناء نموذج فقط من التصور للنموذج، (2) تتبع تجزئة اليدوي للبيانات تليها تقديم السطح، (3) نهج شبه الآلي جاءت قبل تقديم السطح، أو (4) الآلي خوارزميات تجزئة مصمم خصيصا تليها تقديم السطحية والتحليل الكمي. اعتمادا على مزيج من خصائص مجموعة البيانات، تبين أن عادة واحد من هذه الطرق الأربعة الفئوية يتفوق على الآخرين، ولكن اعتمادا على التسلسل الدقيق للمعايير، موقد يكون نهج إعادة من واحد ناجح. بناء على هذه المعطيات، فإننا نقترح مخطط الفرز أن يصنف كلا موضوعية خصائص مجموعة البيانات الشخصية ومعايير موضوعية لتحليل مجموعات البيانات المختلفة.

Introduction

تقليديا، والمجهر الإلكتروني تم تقسيم (EM) في حقل 1) فرع علم الأحياء الهيكلي باستخدام عالية وفائقة عالية الدقة TEM، جنبا إلى جنب مع البيانات عادة صريحة أو ضمنية في المتوسط ​​للتحقيق في ثلاثي الأبعاد (3D) هيكل المجمعات الجزيئات مع تركيبة محددة وعادة ما يكون صغير الحجم نسبيا 1-4، و 2) فرع في التصوير الخلوي التي تصور المناظر الخلوية كامل 1،5،6. في حين أن فرع البيولوجيا البنيوية شهدت تطورا مذهلة على مدى العقود الأربعة الماضية، كان فرع بيولوجيا الخلايا يقتصر في معظمه على بعدين، في كثير من الأحيان على عينات أقل من أمثل الحفاظ عليها. فقط مع ظهور التصوير المقطعي الإلكترون في العقد الأخير لديه خلية التصوير التركيبية البيولوجي سعت إلى البعد الثالث 5،7، حيث بلغ متوسطها عادة لا يمكن إجراء مثل المناظر الخلوية، وبالتالي ملامح الفائدة، هي فريدة من نوعها عادة.

على الرغم من مشاهد تصور الخلوية وغالبا ما تكون مذهلة للعين، واستخراج كفاءة من السمات من الاهتمام والتحليل الكمي لاحق من هذه الكميات الخلوية معقدة للغاية تتخلف، وذلك جزئيا بسبب تكوين البروتين الدقيق هو عادة غير معروف، مما يجعل صعوبة في تفسير هذه الخلوية أحجام 3D. إلى هذا التاريخ، كثيرا ما يحتاج الأمر الخبرات البيولوجية واسعة من أجل تفسير tomograms المعقدة، أو حتى لتحديد المناطق الهامة والعناصر الأساسية في حجم 3D. نتيجة مضاعفات أخرى، تصور حجم 3D هو ملحوظ غير تافهة. يمكن اعتبار كميات من 3D وبالتالي تصور وأكوام من الصور 2D. تفتيش من قبل شريحة شريحة من الصور 2D متتابعة يقلل من تعقيد، ولكنه أيضا ميزة حدود استخراج وتحليل كمي وبالتالي إلى البعدين. ومع ذلك، بالنسبة لمعظم الأجسام 3D، تصوير مجلدات 3D على أنه مجرد كومة من الطائرات متتالية يؤدي إلى غير مكتملة ومنظور مشوه د في نظام معين طبيعة 3D. تتطلب طرق بديلة من الفحص البصري إما جعل حجم أو تقديم السطح، والتي تعطى-طبيعة كثير من الأحيان كثيفة من حجم الخلوي يمكن أن يؤدي بسهولة إلى وجهة نظر عرقلة من الأشياء المتداخلة أو تطغى مستخدم تماما، مما يجعل من الصعب التفاعلية تجزئة اليدوية.

لمعالجة هذه الحواجز، ومجموعة متنوعة كبيرة من ميزة استخراج الآلي وقد تم تطوير (تجزئة) النهج التي عادة ما تكون إما density- أو 8-10 القائم على التدرج. ومع ذلك، هذه الأساليب تميل إلى شريحة وحدة التخزين بالكامل بغض النظر عن أي مناطق أو الميزات التي تهم الخبراء، على الرغم من أن بعض الطرق الحديثة يمكن أن تستهدف ميزة معينة من الاهتمام مثل خيوط الأكتين 11. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للبرامج المنفذة تجزئة الآلي يؤدي أحيانا في إنتاج عدد كبير من وحدات التخزين الفرعية (على سبيل المثال، عند تطبيق immersio مستجمعات المياهن تجزئة) التي تحتاج في كثير من الأحيان المراد دمجها يدويا مرة أخرى تضم ميزة كاملة من الفائدة أو أن تخضع لمزيد من التجزئة. هذا ينطبق بشكل خاص للمجموعات البيانات المعقدة والمزدحمة، مما جعل معظم خوارزميات الكمبيوتر غير قادرة على استخراج فقط ملامح المصالح مع الإخلاص، وجهود كرأيشن كبيرة من قبل خبير في كثير من الأحيان اللازمة لإنتاج حجم مجزأة المطلوب.

وعلاوة على ذلك، غالبا ما يتم نشر حلول مخصصة لمشكلة محددة للغاية كورقة اجتماع العلمية، مع قليل من دون التركيز على جعلها واسعة وشاملة الأدوات في متناول الباحثين الذين ليس لديهم معرفة وثيقة من مجالات الرياضيات وعلوم الكمبيوتر و / أو رسومات الحاسوب. وتخصيص بيئة البرمجيات والبرمجة، وتحتوي على مجموعة من المكتبات تحليل الصور، يمكن أن يكون مجموعة أداة قوية تتيح للمستخدمين إرسال وحدات خاصة بهم بكفاءة لتجزئة دقيقة. ومع ذلك، فإن هذا النهج يتطلب تحويلةالتدريب ensive وخلفية في علوم الكمبيوتر من أجل الاستفادة من العديد من معالمه أو قدرات لتحليل الصور. يمكن للمرء أن يعمل ضمن هذه البيئة البرمجيات تنوعا لمجموعات بيانات معينة حيث الميزات هي أكثر متفرق، على سبيل المثال، من خلال استخدام النهج القائم على الشكل القوية التي تعتمد على الهندسة الفريدة "قوالب" لفصل الأشياء من الاهتمام من محيطهم 12،13 .

مجموعة متنوعة العادلة للحزم التصور رسومات الحاسوب التفاعلية موجودة لتجزئة اليدوية وبناء نموذج. بعض الحزم المتوفرة تجاريا، والبعض الآخر من أصل الأكاديمي وتوزيعه مجانا، مثل: جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو الوهم 14، جامعة كولورادو IMOD 15، وجامعة تكساس أوستن VolumeRover 16. ومع ذلك، فإن مجموعة واسعة وتعقيد ميزات وقدرات هذه البرامج تمتلك تفاقم حالة منحنى التعلم لعصامالفصل. توفر برامج التصور بعض نماذج هندسية بسيطة مثل الكرات والعصي من مختلف الأحجام، والتي يمكن وضعها في خرائط الكثافة من أجل خلق نموذج مبسط لحجم 3D المعقدة. هذه النماذج ثم تسمح قياسات هندسية والحجمي بسيطة وبالتالي تتجاوز مجرد "صورة جميلة". مثل هذا التعقب اليدوي للكائنات يعمل بشكل جيد للأحجام التي يحتاج فيها سوى عدد قليل من الكائنات التي سيتم تتبعها واستخراجها. ومع ذلك، فإن التطورات الأخيرة من الحجم الكبير التركيبية التصوير 3D باستخدام شعاع مركز أيون المجهر الإلكتروني (الاكذوبه-SEM) 17-20 أو كتلة التسلسلي المجهر الإلكتروني الماسح وجه (SBF-SEM) 21 يعرض مضاعفات إضافية أن حجم البيانات 3D يمكن للمجموعات تتراوح بين غيغابايت إلى عشرات ومئات غيغابايت، وحتى تيرابايت. لذلك، مثل هذه الكميات 3D كبيرة لا يمكن الوصول إليها عمليا ميزة استخراج اليدوي، وبالتالي كفاءة الفذ شبه الآلي الموجهة المستخدمسوف استخراج لدى عودتهم يكون واحدا من الاختناقات للتحليل الفعال للمجلدات 3D في المستقبل المنظور.

قدمت هنا هي أربعة نهج تجزئة المختلفة التي تستخدم بشكل روتيني على طائفة واسعة من أنواع الصور البيولوجية. هذه الأساليب ثم يتم مقارنة لفعاليتها لأنواع مختلفة من مجموعات البيانات، والسماح لتجميعها في دليل لمساعدة علماء الأحياء تقرر ما يمكن أن يكون أفضل نهج تجزئة للميزة استخراج الفعال للبيانات الخاصة بهم. كما هي أدلة المستخدم بالتفصيل المتاحة لمعظم البرامج المذكورة، والهدف من ذلك هو عدم جعل المستخدمين المحتملين مألوفة مع أي من هذه الحزم معينة. بدلا من ذلك، فإن الهدف هو إظهار القوة والضعف لكل من هذه الاستراتيجيات تجزئة مختلفة من قبل تطبيقها على مجموعات البيانات ستة سبيل المثال ذات الخصائص المتنوعة. من خلال هذه المقارنة، تم وضع مجموعة من المعايير التي تستند إما على خصائص الصورة الموضوعية للمجموعات البيانات 3D، مثل تباين البيانات، هشاشة، الاكتظاظ، والتعقيد، أو تنبع من اعتبارات ذاتية، مثل الهدف المنشود للتجزئة، والأشكال التضاريسية من الميزات لتكون مجزأة، والكثافة السكانية من سمات الفائدة، وهذا يعني جزء من حجم المحتلة بواسطة ميزة المصالح، وكيف يمكن للمرء العائدات على النحو الأمثل مع الموارد المحدودة مثل الوقت وتوفر للموظفين. هذه مجموعات البيانات المختلفة المثال توضح كيف يمكن لهذه المعايير الموضوعية والذاتية بالتتابع تطبيقها في مجموعة متنوعة من التشكيلات لتسفر عن الاقتران بعض النهج مع ميزة استخراج أنواع معينة من مجموعات البيانات. التوصيات المقدمة سيساعد نأمل المبتدئين واجهت مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخيارات تجزئة اختيار النهج الأكثر فعالية لتجزئة حجم 3D الخاصة.

في حين أن التركيز في هذه الورقة هو ميزة استخراج، والانتباه إلى جمع البيانات وقبل تجهيز البيانات أمر بالغ الأهمية لكفاءة قegmentation. في كثير من الأحيان تلطيخ عينات يمكن أن يكون متساويا، وبالتالي، ينبغي النظر التحف تلطيخ المحتملة في إجراءات تجزئة. ومع ذلك، وصمة عار عادة يعطي أعلى إشارة إلى الضجيج، وبالتالي تتطلب أقل الترشيح وغيره من ضروب المعاملة الرياضية كميات الخلوية، والتي يحتمل أن يؤدي أيضا إلى التحف. مجموعات بيانات الصورة الخام منها تحتاج إلى الحصول عليها في إعدادات التباين وبيكسل الصحيحة، الانحياز، وأعيد بناؤها في حجم 3D. لtomograms، يتم بناؤها الصور الانحياز عادة ما تستخدم المرجحة الخلفية الإسقاط، ثم عادة ما تعرض مجموعة البيانات إلى خوارزميات مثل تقليل الضوضاء غير الخطية متباين الخواص نشر 22، 23 تصفية الثنائية، أو متوسط ​​عودي تصفية 24. يتم محاذاة البيانات التصوير الاكذوبه-SEM وSBF-SEM بواسطة شرائح عبر ربط متتالية في برامج الاستفادة XY مثل يماغيج 25. تعزيز التباين وتصفية يمكن تطبيقها على تعزيز ملامحالفائدة وبالتالي لاجتثاث الضوضاء صورة المكدس. تصفية يمكن أن يؤديها إما على وحدة التخزين بالكامل قبل subvolume اختيار أو على subvolumes المختارة، مع اقتراب تصفية يمكن أن تكون مكلفة حسابيا. أسفل عينة من البيانات (binning)، والذي يستخدم في بعض الأحيان للحد من الضوضاء و / أو تخفيض حجم الملف، ويوصى فقط إذا كانت البيانات قد تم oversampled بشكل ملحوظ مقارنة مع القرار المتوقع.

بعد الحد من الضوضاء، والصور يمكن بعد ذلك معالجتها مجزأة بطرق مختلفة، والتركيز في هذه الدراسة على الأربعة التالية: (1) نموذج الجيل اليدوي المستخرجة من خلال خلق نموذج الكرة والعصا، (2) تتبع اليدوي من الميزات المصالح، (3) الكثافة الآلي القائم على عتبة، و (4) بمواصفات محددة تجزئة الآلي عبر برنامج نصي للتجزئة محددة المشروع. تجزئة حدود 8 و 10 تجزئة غامرة مستجمعات المياه هي بدائل أفضل لالعتبة بسيطة، ولكن ريا تنتمي في نفس الفئة والتي لم تدرج صراحة في هذه المناقشة.

تتبع اليدوي للكثافة يتطلب تحدد ملامح الفائدة، شريحة تلو شريحة، والذي يسمح الإبقاء على الكثافة الأصلية للمناطق الفرعية الخلوية منها. هذا النهج يتيح السيطرة القصوى من عملية تجزئة، بل هي عملية شاقة وكثيفة العمالة.

النهج كثافة تجزئة الآلي (وذات الصلة) القائم على عتبة هي نصف آلية، حيث تختار خوارزمية بكسل استنادا إلى مجموعة من المعلمات المعرفة من قبل المستخدم. هي عدة الأكاديمية (مجاني) حزم التصور، مثل UCSF الوهم، IMOD، فيجي 26، وVolumeRover المتاحة، وكذلك التجارية (التي تتطلب تراخيص المدفوعة) حزم، وعادة ما تشمل كلا النوعين واحد أو أكثر من هذه الطرق تجزئة. وتشمل حزم البرمجيات المستخدمة في هذا العمل لتوضيح هذه الأساليب المختلفة كلا البرنامجين التجارية وق الأكاديمية المفتوحةource برامج لتوليد نموذج مجردة، وكذلك اليدوي والآلي كثافة تجزئة يدويا. ومع ذلك، يمكن للبرمجيات المصدر المفتوح في بعض الأحيان تقديم خيارات أكثر تقدما من خلال إمكانية التخصيص.

وأدت المقارنة بين هذه التقنيات باستخدام أنواع مختلفة من مجموعات البيانات إلى العرض التالية من القواعد والتوجيهات بشأن كيفية التعامل مع تجزئة كميات متنوعة 3D البيانات البيولوجية، والتي على حد علمنا لم يتم نشرها. وهكذا، وهذا هو المقارنة المنهجية الأولى من المناهج المختلفة وفائدتها على مجموعات البيانات ذات خصائص مختلفة بالنسبة للمستخدمين مع أهداف مختلفة.

Protocol

1. دليل ملخصات الجيل نموذج

ملاحظة: وصفت تفاصيل منهجية أدناه هي محددة لالوهم، ولكن يمكن استخدامها حزم البرامج الأخرى بدلا من ذلك. استخدم هذا الأسلوب عندما يكون الهدف الوحيد هو خلق نموذج هندسي (مثل الكرة والعصا نموذج) من أجل إجراء قياسات هندسية، بدلا من عرض شكل حجم الكائنات.

  1. استيراد حجم البيانات إلى برنامج مناسب اليدوي للجيل نموذج المستخرجة.
    1. حدد ملف> فتح خريطة لسحب ما يصل الحوار فتح ملف. انتقل إلى موقع الملف من الخريطة المطلوبة.
    2. سحب ما يصل عارض حجم التداول (أدوات> بيانات حجم التداول> عارض الحجم) ثم اختر خصائص> عرض نمط لعرض البيانات مع أنماط مختلفة التقديم.
    3. ضبط عتبة للعرض عن طريق سحب شريط عمودي على الرسم البياني في عارض حجم التداولالنافذة.
  2. التنقل من خلال حجم 3D (مثلا، شريحة من شريحة) لتحديد مساحة من الاهتمام للتجزئة والمحاصيل خارجا الحجم فرعية أصغر إذا لزم الأمر.
    1. في مربع الحوار عارض حجم التداول، انقر فوق المحور، ثم حدد X، Y، Z أو.
    2. في مربع الحوار عارض حجم، حدد ملامح> الطائرات. بنقرة واحدة لتحديد العمق لعرض الطائرة المقابلة لرقم في المربع الأيسر، وانقر فوق كافة لعرض كافة الطائرات.
    3. في مربع الحوار عارض حجم، حدد ملامح> اختيار المنطقة دون الإقليمية.
      1. انقر واسحب لإنشاء مربع مستطيل حول المنطقة ذات الاهتمام.
  3. وضع علامات على طول ميزة المصالح وربطها مع linkers عند الاقتضاء (غالبا ما يتم تلقائيا من قبل البرنامج) حتى اكتمال النموذج.
    1. من شريط القائمة حجم عارض، اختر الأدوات>الحوار الراسم حجم لفتح الحوار حجم الراسم. في الحوار الراسم حجم التداول، اختر ملف> جديد ماركر تعيين.
    2. في الحوار الراسم حجم التداول، تحقق ماوس> علامات مكان على جودة عالية، وعلامات مكان على الطائرات البيانات، نقل وتغيير حجم علامات، وصلة علامة جديدة لعلامة محددة، واختيار رابط على التوالي علامات.
    3. انقر على علامة حامل اللون، واختيار اللون. كرر هذه الخطوة للون الارتباط.
    4. أدخل نصف قطر للعلامة وربط عناصر بناء النموذج.
    5. في حجم الراسم النافذة، حدد علامات مكان باستخدام [الحق] زر الماوس، وتضاف نصف قطر للعلامات والروابط.
    6. انقر بالزر الأيمن على حجم البيانات لبدء وضع علامات. وسيتم ربط علامات تلقائيا.
    7. في الحوار الراسم حجم، حدد ملف> حفظ مجموعة علامة الحالي، ثم ملف> إغلاق مجموعة علامة.
    فتح مجموعة علامة الجديد (الخطوة 1.3.1) للبدء في بناء نموذج إلى السمة الثانية المرجوة من الفائدة. استخدام الألوان المتناقضة بين مجموعات علامة التأكيد على الاختلافات في الميزات.

2. دليل للبحث عن المفقودين من ملامح الاهتمام

ملاحظة: وصفت تفاصيل منهجية أدناه هي محددة لأميرة، ولكن يمكن استخدامها حزم البرامج الأخرى بدلا من ذلك. استخدم هذا الأسلوب عندما تكون الكثافة السكانية هي صغيرة نسبيا، وعندما دقة ميزة استخراج أمر بالغ الأهمية، وتتبع الدليل هو نهج تستغرق وقتا طويلا.

  1. بيانات حجم الواردات في برنامج مع خيارات تتبع اليدوية. البرمجيات مع هذه القدرة تتيح عموما على الأقل أداة الفرشاة الأساسية.
    1. لكميات كبيرة أو tomograms (على سبيل المثال، 16 بت 2،048 X 2،048 أو أكبر .rec أو .mrc tomograms ولدت في IMOD): حدد البيانات المفتوحة> حق انقر على filename.rec> تنسيق ...> اختر الخام كما LargeDiskData موافق> تحميل. تحديد البيانات الخام المناسب معلمات من معلومات رأس> طيب. تبديل وحفظ باسم جديد filename.am ملف لاستخدامها في الخطوات التالية.
    2. لأصغر صورة 3D كومة الملفات (على سبيل المثال، أو 3D. TIF .mrc أو .rec): البيانات المفتوحة> اختر filename.tif أو filename.mrc. تبديل وحق انقر> حفظ باسم filename.am . إذا تم إنشاء خطأ أو البرنامج لا يستجيب، قد يكون الملف كبير جدا ويمكن فتح باتباع الخطوة 2.1.1.
  2. التنقل من خلال شرائح لتحديد حجم الفرعية 3D للتجزئة، ومن ثم المحاصيل لهذا المجال من الفائدة.
    1. في عارض 3D الإطار، حدد Orthoslice لفتح ملف الصورة. استخدام شريط التمرير في أسفل للتنقل عبر شرائح.
    2. لاقتصاص بيانات أكبر وافتتح LargeDiskData، تبديل اسم الملف في نافذة بركة> حق انقر> LatticeAccess. ENTEص المرجوة حجم مربع> تطبيق. حفظ ملف جديد.
  3. إنشاء ملف تجزئة.
    1. تبديل الملف في إطار بركة> حق انقر> التعريف> LabelField. سيتم إنشاء ملف جديد وتحميلها تلقائيا في التبويب محرر الإنقسام.
  4. تتبع الحدود ميزة الأولى من الفائدة، ثم ملء التتبع باليد أو باستخدام أمر معين إلى البرامج المستخدمة. اتبع ميزة من الفائدة من خلال كل شرائح وتكرار اليدوية تجزئة البحث عن المفقودين. استخدم الأوامر التالية عند استخدام أميرة:
    1. استخدام أداة الرسام، تغيير حجم الفرشاة كما هو مطلوب، ثم استخدام مؤشر الماوس لتتبع حدود سمة من سمات الفائدة.
    2. ملء منطقة تتبع مع الاختصار "و". إضافة الاختيار بالنقر على زر مع رمز زائد، أو الاختصار "أ". إذا لزم الأمر، اضغط على "ش" إلى التراجع، و "ق" لطرح أو مسحها.
    3. توليد السطح لتقديم التصور والنوعية الأساسية أو التحليل الكمي في برامج التعليم دليل المستخدم.
      1. في علامة التبويب بركة كائن، تبديل اسم الملف-labels.am في الإطار بركة> انقر بالزر الأيمن> SurfaceGen.
      2. تحديد خصائص السطح المطلوب> تطبيق. سيتم إنشاء ملف filename.surf جديدة في بركة.
      3. لتصور حجم مجزأة، تبديل filename.surf في بركة نافذة> حق انقر> SurfaceView.
      4. استخدام الأدوات في نافذة 3DViewer للتحرك، تدوير، وتكبير حجم 3D.
    4. استخراج كثافة الدقيق وتحديد قياسات مثل حجم أو مساحة السطح. التصدير إلى برامج أخرى أكثر تقدما للعرض والتحليل والمحاكاة.
      1. على 3DViewer الإطار، انقر فوق أداة القياس> تحديد الخيار المناسب (طول 2D و 2D زاوية لقياسات على متن طائرة واحدة 2D، 3D طول وزاوية 3Dلإجراء قياسات على وحدة تخزين 3D).
      2. انقر على السطح شبكة لقياس طول المطلوب، وبعد المسافة، والزوايا. سيتم سرد القيم في نافذة خصائص.

    3. الآلي الإنقسام القائم على الكثافة

    ملاحظة: وصفت تفاصيل منهجية أدناه هي محددة لأميرة، ولكن يمكن استخدامها حزم البرامج الأخرى بدلا من ذلك.

    1. استخدام هذا النهج على مجموعات البيانات مع أي صنف من النقيض من ذلك، هشاشة، أو زحام سحب الكثافات من الفائدة.
    2. بيانات حجم الواردات في برنامج مجهزة العتبة، عصا سحرية، أو غيرها من الأدوات القائمة على كثافة للتجزئة التلقائي. اتبع الخطوات الموضحة في 2.1-2.1.2 في الاتجاهات للبحث عن المفقودين اليدوي.
    3. التنقل من خلال شرائح وتحديد منطقة للتجزئة. إذا لزم الأمر، والمحاصيل خارجا 3D حجم فرعية أصغر للتجزئة. اتبع الخطوات الموضحة في 2.2-2.2.2 في الاتجاهات للبحث عن المفقودين اليدوي.
    4. تحديد كثافةسمة من سمات الفائدة، عادة عن طريق النقر أو وضع علامة أو مرساة نقطة على الميزة. لو سمحت في البرنامج، أدخل مجموعة تضم عدد ميزة في كثافة بكسل وضبط هذا التسامح على النحو المرغوب فيه. وسيتم اختيار كثافة ينتمون إلى ميزة يصل وفقا للكثافة بكسل أو التسامح قيمة مرساة ل. استخدم الأوامر التالية عند استخدام أميرة.
      1. استخدام أداة العصا السحرية لميزات مع هوامش مميزة.
        1. انقر على مجال اهتمامها، ثم ضبط المتزلجون في عرض وإخفاء لالتقاط مجموعة من القيم الصحيح بحيث يتم تسليط الضوء على ميزة بالكامل. إضافة التحديد مع الاختصار "أ".
      2. استخدام أداة عتبة لميزات دون هوامش تمييزها بوضوح.
      3. حدد رمز عتبة. ضبط التمرير لضبط كثافة داخل النطاق المرغوب فيه بحيث يتم ملثمين فقط ملامح الفائدة. انقر فوق تحديد الزر، ثم إضافة التحديد مع الاختصار220؛ و".
      4. إلى شريحة حجم كامل، حدد كافة شرائح قبل أن يضيف الاختيار.
      5. لإزالة الضوضاء، حدد الإنقسام> جزر إزالة و / أو تجزئة> تسميات السلس.
    5. توليد سطح التصور والتحليل النوعي كما هو موضح في دليل 2.6-2.6.2 قسم البحث عن المفقودين. إذا رغبت في ذلك، وتصديرها إلى برامج أخرى للعرض 3D الكافي، التحليل الكمي والمحاكاة.

    4. مصممة خصيصا الإنقسام الآلي

    ملاحظة: استخدم هذا الأسلوب لإنشاء البرامج النصية المخصصة للتجزئة التلقائي، الأمر الذي يتطلب خبرة خلفية في علوم الكمبيوتر، ولكن يسمح القدرة على خلق نموذج كثافة الدقيق من الحجم الكبير.

    1. أدوات (مثال محدد من الشكل تحت إشراف الإنقسام في MATLAB 27)
      1. صورة ما قبل المعالجة: إجراء اجتثاث الإشاعة، وإزالة الخلفية وتحسين الصورةباستخدام خط أنابيب التالية:
        1. تحميل الصورة باستخدام الأمر imread.
          1. في سطر الأوامر، أدخل: >> ايم = imread ($ image_path)، حيث $ image_path هو موقع الصورة التي سيتم تحليلها.
        2. من أدوات معالجة الصور، والدعوة ينر تصفية باستخدام النسبة المقدرة أو يعرف الضوضاء والقوة إلى إشارة (NSR).
        3. على الصورة معالجتها سابقا، استدعاء الدالة افتتاح صورة imopen لتقدير طبقة الخلفية، ثم تخصيص نتائج كقناع مختلف.
          1. في سطر الأوامر، أدخل:. >> خلفية = imopen (ايم، ستريل ($ shape_string، حجم $))، في هذه الطريقة، $ shape_string تساوي "القرص" على المتغير $ وتعطى حجم بواسطة محلل أي >> الخلفية = imopen (ايم، ستريل ('القرص'، 15)).
        4. طرح صورة تصفيتها مع الخلفية.
          1. في سطر الأوامر، أدخل: >> IM2 = ايم -الخلفية
        5. اعتمادا على نوعية النتائج، نفذ صورة التطبيع مع أو بدون طريقة التكيف أوتسو في 28، والتي يمكن أن يطلق عليه باستخدام وظيفة imadjust من أدوات معالجة الصور.
          1. في سطر الأوامر، أدخل: >> IM3 = imadjust (IM2)
        6. إعداد ملامح الفائدة للتجزئة، مما يحد من المناطق ذات الأهمية عن طريق اقتصاص صورة طبيعية.
          1. باستخدام الأمر imtool، واستكشاف المنطقة من الفائدة التي سيتم اقتصاص وتوفير الإحداثيات إلى الأمر: >> im3_crop = imcrop (IM3، [X2 X1 Y1 Y2])، حيث متجه [X1 X2 Y1 Y2] يناظر منطقة مربع ليتم اقتصاص.
      2. شكل الاعتراف / أشرف تصنيف الشكل: تدريب الخوارزمية من خلال تقديم أمثلة محددة لكل فئة من فئات مختلفة من الكائنات (آثار الخطية في صورة 2D عبر ملامح الفائدة).
        1. تأكد من أن يتم تثبيت VLFEAT 29 API بنجاح وزيارة موقع VLFEAT لتوثيق أكثر تعمقا.
        2. في سطر الأوامر، أدخل: >> [شجرة، ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop، $ K، $ NLEAVES) حيث $ K هو عدد الكتلة لاستخدامها أو عدد من الطبقات المراقب يريد لترتيب البيانات في، و $ NLEAVES هو العدد المطلوب من مجموعات ورقة أي >> [شجرة، ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop، 4،100)
        3. استخدام ميزات مجزأة يدويا كمدخل لVLFeat.
          ملاحظة: هذه المكتبة على أساس C مفتوحة المصدر أداء الترقيع بكسل، تجميع التصحيح، ومركز العنقودية تحديد المواقع اعتمادا على نوع الطريقة المختارة لتعمل بشكل أفضل لمجموعات البيانات. وتتراوح الخيارات المتاحة من ك يعني تجميع استنادا إلى نهج texton-30، والإخراج هو مجموعة العددية التي تصف السمات المرغوبة على أساس النماذج معين.
    2. تجزئة: استخدم هذا فوLLY الآلي، وإن كانت مكلفة حسابيا، نهج لقطاع فئات متعددة من الأشياء في وقت واحد، والتي سوف تكون مكتوبة على النحو خرائط منفصلة لمزيد من التصور والتحليل.
      1. تحميل مجموعة العددية الناتجة سابقا (نموذج).
      2. استدعاء الدالة آلة المتجهات (SVM) في VLFeat، وذلك باستخدام النموذج والصورة لتكون مجزأة كمدخل.
        1. في سطر الأوامر، أدخل: >> [ث، ب] = vl_svmtrain (س، ص، 0.1)، حيث x هو اقتصاص الصورة الأصلية im2_crop و y هي صورة موضوعية، الصورة التي تم مجزأة يدويا. استخدام >> ISEG = VL_IMSEG (I، التسميات) لتلوين النتائج وفقا للتسميات التي يولدها نظام المجموعة.
          ملاحظة: استنادا إلى خصائص النموذج، سوف VLFeat تصنيف الصورة على عدد من فئات (ملامح الفائدة) تعيين من البداية. اعتمادا على درجة من الدقة المرجوة، فمن الممكن الجمع بين هذه الطريقة مع المناهج الأخرى أو تقدير clustالمعلمات إيه مثل مراكز بدن والعنقودية. إخراج الخوارزمية SVM هو نموذج احتمالي وأقنعة الثنائية متعددة الطبقات المطلوب في مجموعات البيانات الجديدة.
      3. حفظ النتائج عن طريق إدخال الأمر: >> imwrite (ايم، $ تنسيق، $ اسم) حيث $ الشكل هو "شجار" و $ filename هو مسار ملف الإخراج.
      4. لتصور الصور، أدخل الأمر: >> imshow (IM).

Representative Results

ويبين الشكل 1 سير عمل نموذجي ل3D الإلكترون المجهري التصوير الخلوي، بما في ذلك التصوير المقطعي الإلكترون، الاكذوبه-SEM، وSBF-SEM. يتضمن سير العمل جمع البيانات الخام، والمحاذاة البيانات وإعادة الإعمار في حجم 3D، والحد من الضوضاء عن طريق الترشيح، وعند الضرورة، وزراعة المحاصيل في المنطقة ذات الاهتمام من أجل تعظيم فعالية البرنامج تجزئة المختار. هذه البيانات preprocessed ثم هو على استعداد لاستخراج ميزة / تجزئة.

ويوضح الشكل (2) وسير العمل المنصوص عليها في الشكل 1 مع أربع مجموعات مختلفة البيانات (الذي سيتم عرضه أدناه)، اثنتان منها عينات جزءا لا يتجزأ من الراتنج التي سجلتها الإلكترون التصوير المقطعي (أرقام 2A، 2B)، مع اثنين آخرين نابعة من الاكذوبه -SEM وSBF-SEM، على التوالي (أرقام 2C، 2D). الصور في الشكل 2 العمود 1 هي الإسقاطآراء (أرقام 2A1، 2B1) والصور سطح كتلة (أرقام 2C1، 2D1)، على التوالي، والتي على المواءمة وإعادة الإعمار وتجميعها في مجلد 3D. ويظهر العمود 2 شرائح من خلال مثل هذه الكميات 3D، والتي على تصفية (عمود 3) تظهر انخفاضا كبيرا في الضوضاء، وبالتالي غالبا ما تظهر أكثر هش. بعد اختيار وزراعة المحاصيل حجم 3D كبير إلى المنطقة ذات الاهتمام (العمود 4)، الاداءات 3D من الميزات مجزأة الفائدة (العمود 5) ويمكن الحصول على مزيد من وتفتيشها، ونا مميزا من الناحية الكمية وتحليلها.

ما مجموعه ست مجموعات البيانات 3D، تحتوي كل منها على كومة من الصور التي تم الحصول عليها إما عن طريق التصوير المقطعي الإلكترون (3 مجموعات البيانات)، وتستخدم الاكذوبه-SEM (2 مجموعات البيانات)، أو SBF-SEM (مجموعة 1 البيانات) لمقارنة مدى كل من أساليب تجزئة أربعة أداء (الشكل 3). مجموعات البيانات تنبع من مجموعة متنوعة من المشاريع البحثية المختلفة في المختبر، وبالتالي توفر عمجموعة متنوعة easonably مجموعات البيانات التجريبية النموذجية. تم فحص جميع مجموعات البيانات بواسطة أربعة باحثين مستقلين، كل منهم أكثر دراية مع نهج واحد معين، وأنهم اتهموا بتقديم أفضل نتيجة ممكنة لكل من ست مجموعات البيانات.

مجموعات البيانات من عينات كما يلي: 1. أرقام 3A1-3A5: ارتفاع ضغط المجمدة، وتجميد استبداله وجزءا لا يتجزأ من الراتنج كتكوت شعر الأذن الداخلية خلية أهداب ساكنة 31، 2. أرقام 3B1-3B5: الضغط العالي المجمد، الفريزر استبدال وجزءا لا يتجزأ من الراتنج جدار الخلية النباتية (غير منشورة)، 3. أرقام 3C1-3C5: ارتفاع ضغط المجمدة، والهدب المحرك الداخلي خلية شعر الأذن جزءا لا يتجزأ من الراتنج (غير منشورة)، استبدال تجميد 4. أرقام 3D1-3D5: pressure- عالية مجمدة، واستبداله تجميد كتل الراتنج جزءا لا يتجزأ من الميتوكوندريا الموجودة في خلايا الغدة الثديية الإنسان الظهارية HMT-S1 عنيبات ​​3522، والتي تم زرعها في laminin extracell الأغنياءالجزيئية مصفوفة 32،33، 5. أرقام 3E1-3E5: غير ملوثين المصنعة الفوق، وكتل جزءا لا يتجزأ من الراتنج من كبريتات المخفض الأغشية الحيوية البكتيرية (مخطوطة قيد الإعداد)، و6. أرقام 3F1-3F5: الحدود غشاء الخلايا المجاورة للHMT -3522 S1 عنيبات.

كما يتبين من الشكل 3، يمكن للنهج تجزئة مختلفة تؤدي إلى نتائج مماثلة في الغالب لبعض أنواع مجموعة البيانات، ولكن النتائج مختلفة تماما عن أنواع البيانات الأخرى. على سبيل المثال، مجموعة البيانات أهداب ساكنة خلية الشعر (الشكل 3A) ينتج كميات تجزئة معقولة مع جميع المناهج الأربعة، مع نموذج المستخرجة اليدوي الناتجة عن مستخدم خبير كونها أوضح لتفسير والتدبير. في هذه الحالة، مثل هذا النموذج يسمح للقياسات سريعة لمسافات خيوط خيوط، عد عدد من الروابط وجدت بين خيوط ممدود، وكذلك تحديد الأجزاء المفقودة من خريطة كثافة المقابلةإلى المواقع التي تضررت العينة أثناء إعداد العينات 34. هذه المعلومات هي أكثر صعوبة للحصول على أخرى باستخدام ثلاثة نهج تجزئة، على الرغم من أن تجزئة بمواصفات محددة الآلي يوفر نتائج أفضل من العتبة بحتة على أساس الكثافة.

لجدار الخلية النباتية (الشكل 3B)، ظهر جيل نموذج يدوي لتكون أكثر كفاءة في نقل شعور النظام في جدار الخلية، والتي أيا من الأساليب الأخرى تحقيقه. ومع ذلك، فإن نموذج المستخرجة لا يعبر زحام الكائنات في مجموعة البيانات. يدويا تتبع ملامح الفائدة يبدو لإعطاء نتيجة أفضل من نهج يشرف الشكل القائم على كثافة أو. من ناحية أخرى، تتبع اليدوي جدا كثيفة العمالة وتحديد حدود الميزات هو ذاتي إلى حد ما. لذلك، قد يكون من المفضل النهج الآلي للبتجزئة كميات كبيرة مع مفاضلة المحتمل بين الدقة وأنفقت الموارد على تجزئة اليدوية.

لمجموعة البيانات الهدب المحرك (الشكل 3C)، والخط نموذج الجيل المستخرجة ينتج نتيجة أنظف ويكشف عن بنية غير متوقعة من ثلاثة الأنابيب الدقيقة في وسط الهدب المحرك، وهي التفاصيل التي مرئيا بسهولة في البيانات التي تم اقتصاصها، لكنه خسر في جميع المناهج الأخرى بسبب عدم التجانس المفترض وصمة عار. ومع ذلك، يحتمل أن غاب غيرها من الميزات الحاسمة من خريطة كثافة في الجيل اليدوي للنموذج مجردة. هذا يرجع إلى حقيقة أن الطبيعة الشخصية للتشكيل نموذج يدوي يؤدي إلى بالتمجيد والتجريد من الكثافة الفعلية لاحظ، وبالتالي إلى التفسير الذاتي خلال تشكيل نموذج. وبالتالي، هذا المثال يوضح كيف طيف دليل نموذج الجيل المستخرجة يسمح احد لتركز على جانب محدد من حجم 3D. ومع ذلك، فشل الإدراك الانتقائي وتبسيط لإعطاء الاعتبار الكامل لجميع البروتين التعاونmplexes الحالية في مجموعة البيانات. وبالتالي، إذا كان الهدف هو إظهار مدى تعقيد البيانات، ثم أحد أفضل خدم مع أي من الأساليب الثلاثة الأخرى.

في حالة مصفوفة مثقف 3D الغدة الثديية عنيبات ​​(الشكل 3D)، تتم تجزئة الميتوكوندريا تباين عالية من قبل جميع النهج الأربعة بكل سهولة، مع تتبع اليدوي من الميزات ليس من المستغرب أيضا العائد على أفضل النتائج بأقل قدر من التلوث ( الرقم 3D3). ومع ذلك، تتبع اليدوي جدا كثيفة العمالة وبالتالي فهي ذات استخدام محدود لكميات كبيرة. كلا الكثافة أساس عتبة ويشرف شكل تجزئة الآلي استخراج الميتوكوندريا بشكل جيد، وستؤدي إلى تجزئة شبه مثالية، إذا تم توظيف المزيد من الحيل لتنظيف (على سبيل المثال، والقضاء على كافة الكائنات دون عتبة معينة من كثافة فوكسل) كاستثمارات متاحة في مجموعات مختلفة. في هذه الحالة، لم اليدوي بناء نموذج المستخرجة لم تسفرنتائج واعدة، وذلك جزئيا بسبب الميتوكوندريا لا يمكن بسهولة أن يقترب مع الكرة والعصا النماذج.

فيما يتعلق البكتيرية التربة المجتمع / بيوفيلم (الشكل 3E)، وثلاثة من النهج الأربعة تسفر عن نتائج معقولة، مع الجيل النموذج اليدوي لا يؤدون بشكل جيد بسبب التحدي لتمثيل الأجسام البيولوجية، مثل البكتيريا، من خلال الأشكال الهندسية. يمكن الكشف عن الزوائد خارج الخلية تنشأ من البكتيريا في نهج تجزئة الآلي ولكن ليس كذلك في ميزة تتبع اليدوي. يمكن تشكيل يشرف-بمواصفات محددة تجزئة الآلي مزيد من فصل ميزات خارج الخلية من البكتيريا على الرغم من كثافتها مماثلة (لا تظهر البيانات)، مما يسمح الكمي السهل حتى من مجموعات البيانات الكبيرة للغاية. لأن هذا هو الأصل مجموعة بيانات كبيرة جدا، وتجزئة بمواصفات محددة الآلي outcompeted بوضوح جميع المناهج الأخرى، ولكن قد استفاد من تعقيد منخفضةوتوزيع متفرق نسبيا من الكائنات ذات الاهتمام (منخفض زحام).

عند النظر في واجهة بين اثنين من الخلايا حقيقية النواة في سياق الأنسجة مثل (الشكل 3F)، إلا أن تتبع اليدوي لملامح الفائدة تنتج نتائج جيدة. فشل نهج تجزئة الآلي القائم على كثافة للكشف عن الحدود بين غشاء الخلايا المجاورة تماما، وفشلت حتى في النهج بمواصفات محددة، وذلك جزئيا بسبب شكل خلية لا تقارب بسهولة أو تتساوى مع الأشكال، على الرغم من نجاح واضح لها للبكتيريا في بيوفيلم (الشكل 3E5).

ملاحظة من الشكل 3 أن النهج تجزئة بشكل جيد على بعض مجموعات البيانات ولكن ليس على الآخرين أدت إلى مسألة ما يميز كل من هذه مجموعات البيانات، وما إذا كان من الممكن تصنيف أنواع خصائص البيانات أو الأهداف الشخصية التي ظهرت ل تطابق جيد مع respectiv بهمنهج ه. لم يجر سابقا دراسة منهجية لهذا الموضوع، وبالتالي كخطوة أولى لإنشاء قائمة تجريبية من الخصائص صورة وأهداف شخصية قد توجه مبتدئ في محاولتهم للعثور على أفضل نهج لاستخراج سمة من سمات مجموعة البيانات الخاصة بهم.

تم تحديد ثمانية معايير كما تظهر أهمية في الشكل 4، ويمكن تقسيمها إلى فئتين رئيسيتين: (1) الميزات التي هي متأصلة في مجموعة البيانات، و (2) أهداف شخصية الباحث والاعتبارات الأخرى التي هي أكثر إلى حد ما ذاتية، وإن كان بنفس القدر من الأهمية. الأمثلة الموضحة يتم رسمها في الغالب من مجموعات البيانات ستة في الشكل 3، مع ثلاث مجموعات بيانات إضافية يجري إدخالها: واحد (الشكل 4A1) هو البرد مقطعية من البرد المقطع من جدار الخلية النباتية thaliana نبات الأرابيدوبسيس، والثاني (أرقام 4A2 ، 4B1، 4D1 أرقام 3F1-3F5 بل هو أكثر تعقيدا بكثير، والثالث (أرقام 4B2 ، 4D2) هو راتنج القسم مقطعية من داخل خلية الشعر في الأذن أهداب ساكنة رأي مستعرضة، مماثلة لمضمون عينة يظهر في طريقة العرض الطولي في Figuress 2A1-2A5 و3A1-3A5.

عن فئة المعايير الموضوعية مثل خصائص الصورة، ويقترح أربعة الصفات المتأصلة في مجموعات البيانات ذات أهمية:

  1. على النقيض البيانات يمكن أن يكون (1) منخفض (الشكل 4A1) كما هو الحال بالنسبة للtomograms البرد EM، (2) المتوسط ​​(الشكل 4A2) مثل المناظر الخلوية مع عدم وجود عضية واضحة أو غيرها من ميزة مكانة بارزة، أو (3) عالية (الشكل 4A3)، كما هو الحال بالنسبة لkinociمقطعية liary أو أهداب ساكنة في المقطع العرضي، ويرجع ذلك إلى محاذاة عناصر الخيطية يفصل بوضوح داخل ض الاتجاه.
  2. يمكن أن تكون البيانات غامض (الشكل 4B1)، مع عدم وجود حدود واضحة واضح بين كائنين وضع عن كثب، مثل الخلايا في الأنسجة، أو هش (الشكل 4B2)، مع حدود محددة بشكل حاد. هذا هو جزئيا وظيفة من قرار مجموعة البيانات، وهو أعلى بطبيعتها بعامل حوالي 2-4 لtomograms إلكترون مقارنة الاكذوبه-SEM. وبطبيعة الحال، حدود أكثر وضوحا مرغوبة لكل من دليل وكذلك نهج تجزئة الآلي، ولكنها ضرورية للنهج الأخير.
  3. يمكن للخرائط الكثافة إما مزدحم (الشكل 4C1) كما يتضح من مكونات جدار الخلية النباتية متباعدة بإحكام، أو قليلة السكان (الشكل 4C2)، وكذلك في مستعمرة البكتيريا، التي تجسد الانفصال الذي يجعل الآلي صورة تجزئة أسهل بكثير.
  4. يمكن خرائط الكثافة تكون معقدة للغاية مع ميزات مختلفة إلى حد كبير في كثير من الأحيان مع الأشكال غير النظامية، مثل الأنسجة وعائي السطور حول الأوعية الدموية (الشكل 4D1) أو تشبه عضية الأشياء واضحة المعالم مع منظمة مماثلة، مثل أهداب ساكنة في المقطع العرضي ( الرقم 4D2).

نلاحظ أيضا جداول مختلفة إلى حد كبير في جميع الأمثلة المختلفة، مما يجعل المقارنة صعبة إلى حد ما.

وبصرف النظر عن معايير أكثر موضوعية مثل الخصائص صورة، أربعة معايير غير موضوعية للغاية التي ستوجه اختيار المسار المناسب واقترح أيضا:

  1. الهدف المنشود: قد يكون الهدف هو تصور الشعر حزمة هدب ساكن في تعقيدها وتحديد ودراسة شكل الجسم (الشكل 4E1)، أو لإنشاء الكرة والعصا نموذج مبسط والمستخرجة المضمن في خريطة الكثافة و يسمح عد بسرعة إلىالثانية قياس الكائنات الهندسية (طول خيوط والمسافة وعدد الاتصالات) (الشكل 4E2).
  2. مورفولوجيا الميزة يمكن أن تكون غير منتظمة للغاية ومعقدة مثل خلايا، مثل مناطق التفاعل خلية خلية (الشكل 4F1)، إلى حد ما شكل مماثل مع بعض الاختلاف، مثل الميتوكوندريا (الشكل 4F2)، أو معظمها على شكل مماثل، مثل خيوط الأكتين وعبر وصلات في ربطة الشعر في اتجاه طولي الشكل (4F3).
  3. نسبة ميزة الفائدة (الكثافة السكانية) مهمة، باعتبارها واحدة قد ترغب في شريحة كافة الميزات في مجموعة بيانات 3D، كما هو الحال بالنسبة لجدران الخلايا النباتية (الشكل 4G1)، أو سوى نسبة ضئيلة من حجم الخلوي كما هو الحال الميتوكوندريا في مشهد الخلوي غير متجانسة (الشكل 4G2). اعتمادا على حجم مجموعة البيانات والنسبة المئوية لحجم تتطلب تجزئة، قد يكون من الأكثر كفاءة في استخدامالنهج اليدوية. في حالات أخرى، مثل عند واحد مهتم في مجموعة متنوعة من الميزات، وببساطة ليس هناك بديل لاستخدام نهج تقسيم شبه الآلي.
  4. المعيار الذاتي رئيسي آخر هو مقدار الموارد واحد هو على استعداد للاستثمار في عملية تجزئة وأي مستوى من الإخلاص مطلوب للإجابة على سؤال البيولوجي. يمكن للمرء أن تريد وتحتاج لقياس المعلمات ميزة في الحجمية (مثل حجم والحجم والمساحة السطحية، وطول، وبعد المسافة من الميزات الأخرى، الخ)، وفي هذه الحالة قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من الرعاية للحصول على معلومات كمية دقيقة (الشكل 4H1)، أو الغرض قد يكون لمجرد التقاط صورة 3D شكله (الشكل 4H2). في عالم مثالي حيث هي موارد غير محدودة، واحد واضح لا تريد أن تقدم أي تنازلات بل يختار المسار الأكثر دقة لميزة استخراج اليدوي بمساعدة المستخدم. في حين أن هذا يمكن أن تعمل للعديد من مجموعات البيانات، في المستقبل القريب مجلدات 3D فيل ل يكون في ترتيب بواسطة 10K 10K 10K أو أعلى من قبل، وسوف دليل تجزئة لن تكون قادرة على لعب دور بارز في بتجزئة مثل هذا الفضاء الهائل. اعتمادا على تعقيد البيانات والخصائص بيانات أخرى، قد تصبح تجزئة شبه الآلي ضرورة.

في الشكل 5، وترد القوة والضعف لفترة وجيزة لنهج تجزئة الأربعة. وترد كذلك الأهداف الشخصية وخصائص الصورة التي تم تحديدها في الشكل 4 التي يمكن أن الزوج مع كل نهج. في الشكل 6، الأهداف الشخصية وخصائص صورة ست مجموعات البيانات تجسد كيفية فرز البيانات واتخاذ قرار بشأن أفضل نهج. كلا الرقمين 5 و 6 يتم توسيع عليها في المناقشة.

حمولة / 51673 / 51673fig1highres.jpg "العرض =" 500px "/>
الرقم 1. سير العمل لإعادة الإعمار التصوير البيولوجي والتحليل. يعطي هذا الرسم البياني لمحة عامة عن مختلف الخطوات المتخذة لجمع والصور التي جمعتها عملية التصوير المقطعي، وتركز أيون شعاع SEM، والمسلسل وجه كتلة SEM. نتائج جمع البيانات الخام في 2D سلسلة الميل أو أقسام التسلسلية. هذه المجموعات صورة 2D يجب أن تكون محاذاة وإعادة بنائها في 3D، ثم يصفى من أجل الحد من الضوضاء وتعزيز النقيض من الميزات المثيرة للاهتمام. أخيرا، يمكن أن البيانات مجزأة وتحليلها، مما يؤدي في النهاية إلى نموذج 3D. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2.يتم عرض أمثلة على سير العمل لأنواع البيانات المختلفة من التصوير المقطعي والاكذوبه-SEM كل خطوة من خطوات سير العمل بعد جمع البيانات من خلال أربع مجموعات البيانات (الصفوف م). الراتنج جزءا لا يتجزأ من التصوير الطبقي الملون من أهداب ساكنة مقطوع طوليا، الراتنج جزءا لا يتجزأ من التصوير الطبقي الملون من جدار الخلية النباتية السليلوز، الاكذوبه-SEM الثدي الميتوكوندريا الخلايا الظهارية، وSBF-SEM من E. البكتيريا القولونية. ويرد شريحة 2D من خلال البيانات الخام في العمود 1، وصورة من البيانات بعد المواءمة وإعادة الإعمار 3D يتكون العمود 2. تقنيات التصفية المطبقة في العمود 3 ما يلي: مرشح المتوسط ​​(A3)، غير متباين الخواص مرشح نشر (B3)، التمويه الضبابي (C3)، ومرشح imadjust في MATLAB (D3). يتم عرض مثال من أفضل تجزئة لكل مجموعة البيانات من المساحة المحصولية من الفائدة (العمود 4) بوصفها 3D تقديم في العمود 5. أشرطة النطاق: A1-A3 = 200 نانومتر، A4 = 150 نانومتر، A5 = 50 نانومتر، B1-B3 = 200 نانومتر، B4-B5 = 100 نانومتر، C1-C3 = 1 مم، C4-C5 = 500 نانومتر،D1-D3 = 2 مم، D4-D5 = 200 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
الرقم 3. تطبيق أربعة تجزئة النهج إلى مجموعات البيانات المثال كانت مجزأة مجموعات البيانات ستة سبيل المثال من خلال جميع الأساليب الأربعة:. اليدوي الجيل المستخرجة النموذج، تتبع اليدوي، تجزئة الآلي القائم على الكثافة، ومصممة خصيصا تجزئة الآلي. كان اليدوي الجيل المستخرجة نموذج فعال لراتنج جزءا لا يتجزأ من التصوير المقطعي الملون من أهداب ساكنة (A)، وكان الغرض هو خلق نموذج للأغراض الكمية بدلا من استخراج الكثافة. لراتنج جزءا لا يتجزأ من التصوير المقطعي الملون من جدار الخلية النباتية (B)، segmenta الآلي القائم على كثافةكان نشوئها الأسلوب الأكثر فعالية لاستخراج السليلوز بسرعة من خلال العديد من الشرائح، حيث كما اتخذت الطرق اليدوية المزيد من الجهد على سوى بضع شرائح من البيانات. الجيل اليدوي نموذج المستخرجة إنشاء الثلاثي أنيبيب في التصوير المقطعي الملون من الهدب المحرك (C)، في حين لم أساليب تجزئة أخرى لا، ولكن النهجين الآلي استخراج الكثافة بسرعة أكبر وبالتالي كانت تفضل. بسبب شكل الميتوكوندريا من الاكذوبه-SEM في خلايا الثدي الظهارية (D)، شريطة تتبع اليدوي نتيجة أنظف، وكثافة سكانية منخفضة جنبا إلى جنب مع استخدام وسائل الاستيفاء يسمح للتجزئة سريعة. نظرا للحجم الكبير الذي يحتاج إلى مجزأة، أثبتت مصممة خصيصا تجزئة الآلي لتكون أكثر كفاءة لشريحة كانت SBF-SEM البكتيريا البيانات (E)، ولكن كلا النهجين التلقائي للمقارنة. على الرغم من أن تستغرق وقتا طويلا، فإن الطريقة الوحيدة لاستخراج الاكذوبه-SEM من غشاء الخلية الظهارية الثدي (F) تتبع اليدوي أشرطة النطاق:A1-A5 = 100 نانومتر، B1-B5 = 100 نانومتر، C1-C5 = 50 نانومتر، D1-D5 = 500 نانومتر، E1-E5 = 200 نانومتر، F1-F5، والحانات = 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. خصائص صورة الهدف والأهداف الشخصية الذاتية لtriaging مجموعات البيانات. باستخدام أمثلة من البيانات مجموعة الخصائص، يقترح معايير لإبلاغ القرار على النحو الذي تجزئة النهج للاستخدام. فيما يتعلق الخصائص الموضوعية، يمكن للبيانات أن لها أصلا النقيض منخفضة أو متوسطة أو عالية (A1-A3)، يكون غامض أو هش (B1-B2)، مسافات أو مزدحمة (C1-C2)، ويكون مجمع أو ببساطة ميزات المنظمة (D1-D2). وتشمل الأهداف الشخصية الذاتية وس المطلوب bjective تستهدف نموذج مبسط أو استخراج الكثافة الدقيقة (E1-E2)، وتحديد ورقة الملتوية، وحجم معقد، أو التشكل الخطي باعتباره سمة من سمات الفائدة (F1-F3)، واختيار الكثافة السكانية العالية أو المنخفضة ميزة الفائدة (G1-G2)، والبت في المفاضلة بين عالية الدقة وعالية لتخصيص الموارد للعودة المتناقصة على الاستثمارات مثل الوقت (H1-H2) أشرطة النطاق: A1 = 50 نانومتر، A2 = 1500 نانومتر ، A3 = 100 نانومتر، B1 = 1500 نانومتر، B2 = 200 نانومتر، C1 = 100 نانومتر، C2 = 200 نانومتر، D1 = 10 مم، D2 = 200 نانومتر، E1 = 100 نانومتر، E2 = 50 نانومتر، F1-F2 = 500 نانومتر، F3 = 50 نانومتر، G1 = 100 نانومتر، G2 = 1 مم، H1-H2 = 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

بكسل "/>
الشكل 5. جدول مقارنة بين خصائص البيانات وتهدف ذاتية المناسبة لنهج تجزئة مختلفة. يلخص هذا الجدول القوة والضعف في كل منهج تجزئة. يمكن للمعايير من الشكل 4 تساعد في تحديد مجموعات البيانات التي تناسب الأسلوب الذي تجزئة. وقد تم اختيار هذه الخصائص صورة موضوعية وأهداف شخصية ذاتية للاستخدام الأمثل للكل النهج، ولكن مجموعات مختلفة قد تعيق أو تساعد كفاءة تجزئة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الشكل الانسيابي 6. قرار لكفاءة رriage من تجزئة النهج لمجموعات البيانات ذات خصائص مختلفة. استنادا إلى أبرز الخصائص في الشكل 4، ويوضح هذا الرسم البياني الذي ساهمت أربعة معايير أكثر إلى قرار نهائي بشأن النهج الأفضل لتقسيم كل مجموعة البيانات من الشكل 3. كل مجموعة البيانات ونا مميزا لمتابعة بسرعة خطوط عريضة تمثل عملية اتخاذ القرارات الأولية، فضلا عن الخطوط المنقطة التي تعكس مسار بديل قد تكون أو لا تؤدي إلى نفس النهج. وأفضل مجزأة على الهدب المحرك، والبكتيريا، ومجموعات البيانات جدار الخلية النباتية مع اثنين من النهج الآلي. في المقابل، فإن غشاء الخلية والميتوكوندريا مسارات يؤدي دائما إلى البحث عن المفقودين اليدوي نظرا لخصائصها الصعبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات فعالة لاستخراج كميات من الميزات ذات الصلة 3D EM من أجل مواكبة البيانات تسونامي التي ضربت مؤخرا التصوير البيولوجي. في حين أن البيانات يمكن أن تتولد في ساعات أو أيام، فإنه يأخذ عدة أشهر لتحليل حجم 3D في العمق. وبالتالي، فمن الواضح أن تحليل الصور أصبح عنق الزجاجة للاكتشافات العلمية؛ دون حلول مناسبة لهذه المشاكل، والعلماء التصوير تصبح ضحايا نجاحهم الخاص. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى تعقيد عالية للبيانات وأيضا الزحام الجزيئات التي توجد عادة في الخلايا البيولوجية، حيث تظهر البروتينات والمجمعات بروتين واحد آخر الحدود وأساسا والتدرج المستمر للكثافة الرمادي. ومما يعقد المشكلة عن طريق إعداد العينات والتصوير عيوب، وفي بعض الحالات إعادة الإعمار التحف الصورة، مما يؤدي إلى أقل من الكمال البيانات الحجمية التي يمكن أن تشكل تحديات لنهج مؤتمتة بالكاملوفاق. أهم، ومع ذلك، هو حقيقة أن الخبراء في إعداد العينات، والتصوير، والتفسير البيولوجي نادرا ما ضليعا في العلوم الحسابية، وبالتالي تتطلب توجيهات بشأن كيفية التعامل بشكل فعال ميزة استخراج وتحليل. لذلك، من خلال استخدام الأمثلة المختلفة، ويوضح البروتوكول كيفية تحضير البيانات للتجزئة، فضلا عن الخطوات اليدوي للجيل المستخرجة النموذج الآلي تجزئة القائم على الكثافة، تتبع اليدوي لملامح الفائدة، ومصممة خصيصا تجزئة الآلي. النهج اليدوي والآلي المبين في الإجراء يمكن العثور عليها في مجموعة كبيرة ومتنوعة من البرامج تجزئة، بعضها مذكور هنا، ولكن الآخرين أداء وظائف مماثلة وبنفس القدر مناسبة تماما.

وتظهر النتائج أن فعالية كل من النهج تجزئة 3D تختلف لكل نوع مختلف من مجموعات البيانات. على الرغم من أن نهج مختلفة نوعيا أنتجت قالاداءات 3D imilar والمنتج النهائي، ومقدار الوقت والجهد المبذول في كل أثناء عملية تجزئة تفاوتت بشكل كبير. وتتلخص التوصيات المناسبة لخصائص الصورة والأهداف الشخصية في نهج تجزئة في الشكل 5، الذي هو مزيد من شرح في الأقسام الفرعية الأربعة التالية. طبقت هذه المعايير إلى ست مجموعات البيانات، كما هو مبين في الرسم البياني قرار الشكل 6. على الرغم من أن الأرقام 5 و 6 هي مجرد تهدف إلى توفير الأساس المنطقي لكل مجموعة البيانات وكيفية ترجيح كل من المعايير في عملية صنع القرار، أنها لا توفر التوجيه مضمونة، وإنما هي نقطة البداية. هناك ببساطة الكثير من المعايير التي تؤثر في عملية صنع القرار: بعضها معايير موضوعية، مثل مجموعة بيانات الخصائص، بينما البعض الآخر معايير أكثر موضوعية، مثل الهدف المنشود. فمن المأمون القول أن مجموعات البيانات التي تعرض ليف عاليةش من النقيض مع حدود واضحة حادة، ولها الميزات التي يتم فصلها بشكل جيد ومتجانس نسبيا (وليس تنوعا جدا)، ويتم معالجتها بهدف عرض نموذج الكثافة لعدد كبير من الكائنات، فإن النهج الآلي تكون متفوقة، إن لم يكن ل حقيقة أن النهج اليدوية ببساطة أن تكون الموارد (الوقت) -prohibitive. من ناحية أخرى، إذا النقيض منخفضة، البيانات هو غامض وبالتالي يتطلب معرفة خبير، والكائنات هي مزدحمة، وتظهر ملامح تنوع كبير وبالتالي فهي غير متجانسة، واحد قد لا يكون لديك أي خيار آخر سوى ميزة استخراج دليل / تجزئة.

دليل ملخصات الجيل نموذج

اليدوي تتبع نموذج المستخرجة غير فعالة بشكل خاص في بتجزئة العناصر الخطية، وتوفير البذور نقطة (كرات) التي يمكن توصيلها (العصي) تلقائيا. هذه الكرات والعصي نماذج يمكن أن تكون قوية جدا لقياس طول والتوجه الثاني من هذا النموذج وتقديم نموذج المستخرجة بشكل كاف لكلا التفتيش النوعي والتحليل الكمي. الجيل اليدوي نموذج المستخرجة يستخدم عادة عند تقليل الموارد المنفقة على تحليل أكثر أهمية من الإخلاص المطلق لأشكال البيانات الأصلية. ومن أنجح مع ميزات والخطية المتجانسة من الفائدة (على سبيل المثال، خيوط وأنابيب). تباين البيانات، هشاشة، وزحام لا تلعب دورا رئيسيا في تحديد نجاح هذه الطريقة، وطالما أن العين البشرية يمكن التعرف على موضع اهتمام. في بعض الأحيان يمكن أيضا أن تستخدم مثل هذه النماذج على أنها هيكل عظمي لقطاع خريطة 3D في المنطقة حول الهيكل العظمي. على الرغم من أن النموذج المجرد بدلا من التفكير من الكثافة بالضبط، لأنها تمثل نسخة هيكل عظمي لكثافة 3D، وبالتالي يسمح لتصور خالية من الفوضى والتحليل النوعي. ويمكن أيضا القياسات الكمية مثل الطول يتحدد من نموذج تقريبي. لمثال على البرمجيات مع دليل نموذج الجيل المستخرجة، يرجى زيارة دليل المستخدم الوهم المفصل على الانترنت في http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .

بحث عن المفقودين اليدوي لملامح الفائدة

تتبع الفرشاة اليدوية يعمل بشكل جيد مع خصائص البيانات كلها تقريبا، ولكنها أيضا معظم الوقت طريقة طويلا. في بعض الأحيان، هو التقنية الوحيدة لاستخراج سمة من سمات الفائدة من مجموعة صورة معقدة تحتوي على مجموعة كبيرة من الميزات، مثل غشاء الخلية رقيقة ومعقدة. واحد أداة مفيدة المتوفرة في بعض البرامج تسمح الاستيفاء بين شرائح مجزأة بشكل متقطع عند ميزة الفائدة تتغير على نحو سلس. تتبع اليدوي يمكن تطبيق أكثر كفاءة إذا كانت البيانات هو هش ولديه متوسطة إلى عالية التباين، ولكن يمكن أيضا أن تستخدملمجموعات البيانات أكثر صعوبة، طالما المستخدم على دراية موضع اهتمام. تعقيد البيانات يمكن أن تتراوح من كائنات منفصلة لمجموعات البيانات المعقدة والمزدحمة، حيث يتم معبأة بشكل وثيق الكائنات. في الحالة الأخيرة، قد يكون تجزئة اليدوية الخيار الوحيد، مع اقتراب التلقائي في كثير من الأحيان صعوبة في جزء من حجم المطلوب واستخراج أكثر من اللازم أو أقل من اللازم. ميزة الأشكال التضاريسية الصعبة، مثل ورقة الملتوية أو وحدات التخزين، كما يمكن استخراجها بواسطة هذا الأسلوب. ومع ذلك، يجب على المستخدم أن نضع في اعتبارنا أن مجموعة بيانات مع العديد من الخصائص صعبة لا يمكن مجزأة إذا كانت الكثافة السكانية من سمات الفائدة منخفضة، وتقسيم الكثافة السكانية العالية من سمات الفائدة تصبح زمنيا باهظة. للحصول على مثال البرمجيات مع تتبع اليدوي، يرجى زيارة دليل المستخدم أميرة مفصل على الانترنت في http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

الآلي الإنقسام القائم على الكثافة

على النقيض من التقنيات اليدوية، والنهج الآلي عادة ما تكون أقل استهلاكا للوقت، وهو عامل مهم في الاعتبار عند تجزئة كومة كبيرة من الصور. ومع ذلك، العتبة بسيطة قد لا تكون دقيقة، وأكثر من الوقت يمكن أن تنفق على تحسين وكرأيشن من حجم مجزأة تلقائيا. تجزئة الآلي القائم على كثافة يعمل بشكل أفضل على مجموعات البيانات التي تعرض عدد كبير من ميزات مشابهة من الفائدة التي تتطلب كل تجزئة. إذا كانت البيانات أكثر تعقيدا، يمكن لهذه التقنيات الآلية لا تزال بمثابة الخطوة الأولى، ولكن من المرجح أن تتطلب بعض التدخل اليدوي أسفل الخط من أجل تحديد subvolume تحتوي على سمة من سمات الفائدة. هذه الاستراتيجية عادة ما يعمل بشكل جيد على الأشكال التضاريسية الخطية أو وحدات التخزين معقدة، لكنها نادرا ما ناجحة مع ورقة الملتوية رقيقة مثلأغشية الخلايا. تدخل المستخدم مع الحد الأدنى من النهج الآلي يمكن تجزئة من خلال كميات كبيرة أو صغيرة، في حين أن إنفاق الموارد القليلة المستخدم مثل الوقت في مقابل عالية الدقة. للحصول على مثال البرمجيات مع تجزئة الآلي القائم على الكثافة، يرجى زيارة دليل المستخدم أميرة مفصل على الانترنت في http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .

مصممة خصيصا الآلي الإنقسام

مصممة خصيصا تجزئة الآلي تسمح التخصيص قوة خوارزميات لمجموعة بيانات محددة، ولكن غالبا ما يكون محدد لمجموعة البيانات أو نوع البيانات، مناسبة لعدد محدود من الخصائص الميزة، ولا يمكن تعميمها بسهولة. الإجراء عرضت هنا يختلف عن النهج العامة تجزئة الآلي، مثل غمر المياه ومستوى آخر طرق مجموعة، والتي تعتمد على تقرير المبرمج للنقاط الحرجة البذور، تليها التوسع مكعب يسيرون بسرعة من هذه النقاط البذور. وهناك تباين حول هذا الموضوع هو تقسيم الحدود، حيث بإبلاغ المعلومات متجه الانحدار حدود الميزة. في المقابل، فإن السيناريو مخصصة المستخدمة هنا يعتمد على مرحلة التدريب حيث أن المستخدم يتتبع بعض الأمثلة يدويا. من خلال التعلم الآلي، وخوارزميات محددة كشف وثم تعلم كيفية التعرف بشكل مستقل خصائص وخصائص البيانات الموجودة باستمرار في آثار. مستخدم خبير يمكن إعادة تدريب خوارزميات وتحسين دقة تجزئة من قبل بما في ذلك المزيد من يتتبع سبيل المثال لتوفير مجموعة أكبر من المعايير الميزة. وعموما، قد لا تكون العتبة النهج والنهج ذات الصلة، أو حتى بمواصفات محددة ومفيدة لاستخراج سمة واحدة من الاهتمام من صورة مع التنوع معقدة من العضيات أو الأشكال، كما كرأيشن قد يكون تماما كما كثيفة العمالة كما تتبع اليدوي.

">

استراتيجيات لTriaging البيانات واختيار نهج الإنقسام

نظرا لمعايير ذاتية وموضوعية المعروضة في الشكل 4 وملخص قواعد البيانات المناسبة في الشكل 5، مخطط صنع القرار مبين في الشكل (6) يمكن أن تساعد على تقييم فعالية استراتيجيات ميزة استخراج لمجموعة كبيرة ومتنوعة من مجموعات البيانات. وtriaged مجموعات البيانات في أربعة قرارات متتالية، كل منها يمكن أن تشمل أي واحد من كل أربعة أهداف فضلا عن معايير ذاتية أربعة أدخلت في الشكل 4. وكمثال على ذلك، الشكل 6 هو عقلاني للtriaging كل البيانات ستة مجموعات مبين في الشكل 3. مما لا شك فيه، لتضع كل البيانات ليس هناك مسار واحد فريد من نوعه، ولكن بدلا مسارات مختلفة من خلال هذه المصفوفة التالية معايير مختلفة لاتخاذ القرارات التي قد تؤدي رس نفس أو مختلفة توصية لتجزئة البيانات. في حين أن كل مجموعة البيانات سيكون لها مجموعتها الخاصة من الخصائص، التي لا يمكن توقعها، يتم إعطاء أمثلة ستة، كل يقترن مع شرح الأساس المنطقي وراء ميزة يفضل النهج استخراج / تجزئة. تشمل معظم أيضا اقتراحا لقرار طريق بديل إما أن النتائج في استخدام نفس أو نهج تجزئة مختلفة (الشكل 6).

والهدب المحرك هو هش البيانات التي تم تحديدها مع حدود واضحة المعالم، الأمر الذي يجعل من المرجح النهج الآلي لتحقيق النجاح. جميع الميزات التي تهم يتم فصل جيدا، لصالح مرة أخرى نهجا الآلي. بالإضافة إلى ذلك، ملامح الفائدة مشابهة لبعضها البعض، مما يجعلها مثالية متجانسة نسبيا مجموعة البيانات للبمواصفات محددة تجزئة. وأخيرا، كان الهدف لاستخراج ميزة بأكملها، لصالح نهج شبه الآلي. ونتيجة لذلك، فقد خلص إلى أن العتبة الآلي (الخط الأخضر الصلبة) وكذلك (على سبيل المثال، تشكل تجزئة أشرف) نهج مصمم خصيصا (الخط الأخضر منقط) من المرجح أن تفعل جيدا على هذا مجموعة البيانات على حد سواء.

معايير مماثلة، على الرغم من وضعها في ترتيب مختلف في الشبكة اتخاذ القرار، تنطبق على حالة البكتيريا. ينصح نهج بمواصفات محددة وذلك جزئيا بسبب هذا مجموعة البيانات كان كبير جدا. وبالتالي، تحظر الموارد المحدودة لنهج التدخل اليدوي / تجزئة كثيفة العمالة. بينما العتبة قد أسفرت عن نتائج مقبولة، وكان نهج مصمم خصيصا قادرة على تنفيذ الهدف الرئيسي للدراسة لفصل الأشكال البكتيرية مدور من الودائع المعدنية خارج الخلية، وتقع إما في الفترات الفاصلة بين البكتيريا أو بجوار البكتيريا، وبالتالي فإن كان يفضل النهج بمواصفات محددة.

لمجموعات البيانات أهداب ساكنة، وكان الاعتبار الأول الهدف المنشود: أن الهدف إما أن يكون لإظهار كثافة كاملأو لخلق نماذج هندسية. بلغ حجم الفائدة منطقة مزدحمة، وكان الهدف هو جزء من عدد كبير من الكائنات ككائنات فصل من أجل تنفيذ التحليل الكمي الحجمي، بما في ذلك أطوال والأرقام والمسافات، والتوجه، وما كان من المفيد في وقت لاحق أن كائنات الفائدة كانت الخطية أساسا، وهذا جعل نموذج هندسي تتبع الأسلوب المفضل. ومع ذلك، إذا كان بدلا من ذلك الهدف لإظهار كثافة بأكملها، ثم التشكل ميزة الخطي وكذلك التباين العالي نسبيا مع حدود محددة بشكل حاد من شأنها أن تجعل بروتوكول العتبة الآلي ممكنا.

أغشية الخلية والحالات البيانات الميتوكوندريا تشكل تحديا للنهج الآلي بسبب فئاتهم من ميزة التشكل: صفائح وأحجام الملتوية، على التوالي. كان الهدف هو تتبع خلية أو الميتوكوندريا مخطط بدقة، ولكن هناك موارد محدودة فقط للقيام بذلك. بالإضافة إلى ذلك، ملامح مشتركةطبقا لتقديرات معقدة ولا يمكن بسهولة الكشف عن شكل أو المشفرة تلقائيا، على الرغم من أن لمجموعات البيانات الميتوكوندريا نهج البرمجة المخصصة المتخذة للبكتيريا وقد يتم تطبيقها مع مزيد من التخصيص. لحسن الحظ، وغشاء الميتوكوندريا أنفسهم لا تمثل سوى جزء صغير من وحدة التخزين بالكامل، وبالتالي، تتبع اليدوي هو واضحة وإن كان نهج تستغرق وقتا طويلا. تتبع اليدوي هو أيضا الأسلوب المفضل لمثل هذه مجموعات البيانات عندما يكون التباين منخفض نوعا ما، والحدود وغامض إلى حد ما. ونتيجة لذلك، حتى لو كانت تشكل جزء كبير من مجموعات البيانات، هذه ورقة الملتوية يجب أن تتبع يدويا، وذلك ببساطة بسبب عدم وجود بديل أفضل.

مجموعة البيانات النبات يشكل تحديات خاصة بها لأن الهدف هو شريحة كافة الكائنات، التي هي كثيفة متباعدة وتشكل مشهد مزدحم. عرض كثافة كما هو شأنها تمكين قياسات حول شكل وتنظيم الكائنات، ولكن بecause بتجزئة يدويا ومكلفة للغاية، كان يعمل العتبة التلقائي كل كائن الخيطية بدلا من ذلك.

تم عرض مختلف الخطوات والنتائج المقابلة في خلق نموذج 3D هنا، ولكن الأهم من ذلك، وخصائص ومعايير البيانات الشخصية التي وجدت لتكون حاسمة في تحديد كما تم توضيح أفضل مسار للتجزئة. تشمل الخصائص المهمة للبيانات الصورة نفسها ما يوصف هنا المقابل، الاكتظاظ، هشاشة، وعدد من الأشكال أو الخصائص (مثل العضيات، خيوط، الأغشية) مختلفة. معايير ذاتية لتشمل النظر في الهدف المنشود من تجزئة (قياس / العد، تمثيل هيكل عظمي البيانات / عرض مجلدات في الاداءات 3D)، والخصائص المورفولوجية من ميزة الفائدة (خطي، ممدود، الشبكات، معقدة، معقد)، وكثافة ملامح الفائدة بالنسبة لحجم كامل (جزء من الكائنات التي هيحاجة مهمة واستخراجها)، وموازنة المبادلات من إنفاق الموارد على الإخلاص تجزئة للبيانات الأصلي وعودة على خفض الاستثمار مما أدى إلى تحسينات تدريجية لتخصيص أعلى بكثير من الموارد.

مجال تجزئة الصورة قد نضجت بشكل كبير خلال السنوات الأخيرة، وحتى الآن لا يوجد حل سحري، لا خوارزمية أو البرنامج الذي يمكن أن تفعل كل شيء. نمت أحجام مجموعة بيانات من مئات ميغابايت إلى عادة عشرات غيغابايت، وأنهم بدأوا الآن أن يتجاوز تيرابايت، مما يجعل التقسيم اليدوي شبه مستحيل. وبالتالي، لا بد من استثمارها في النهج ميزة استخراج ذكية وفعالة في الوقت التي تحاكي عملية صنع القرار المزيد من الموارد البشرية. سوف تحتاج هذه الجهود لتكون مجتمعة مع (1) نظام المعلومات الجغرافية (GIS) ومقرها قواعد البيانات الهرمية الدلالية (مماثلة لجوجل الأرض)، (2) تقنيات تجريد البيانات (أي الانتقالمن فوكسل لتمثيل هندسي / الحجمي) متوافق مع التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) والبرمجيات من أجل خفض كبير في كمية البيانات وبالتالي تمكين عرض كميات أكبر 35، (3) تقنيات المحاكاة، لأنها كثيرا ما تستخدم في التخصصات الهندسية، فضلا عن (4) الرسوم المتحركة المتطورة وقدرات صنع الفيلم، بما في ذلك الرسوم المتحركة من خلال ذبابة (على غرار ما تم تطويرها لصناعة الألعاب).

بشكل واضح وفعال ميزة استخراج وتجزئة يكمن في قلب هذه الثورة القادمة في الخلوي التصوير ذات الدقة العالية، وبينما سوف يكون دائما حاجة إلى اتباع نهج أفضل، مبادئ قدمت هنا، وكذلك أمثلة على ما اتخذ نهج لأنواع البيانات المختلفة ، وسوف توفر بعض المعلومات القيمة لاتخاذ قرار بشأن النهج الذي لاتخاذ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amira FEI Visualization Sciences Group http://www.vsg3d.com/amira/overview
Chimera UCSF http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Fiji/ImageJ National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/
IMOD Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells http://bio3d.colorado.edu/imod/
Photoshop Adobe http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html
MATLAB MathWorks http://www.mathworks.com/
VLFeat VLFeat http://www.vlfeat.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auer, M. Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine. J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).
  2. Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography. Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).
  3. Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).
  4. Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction. Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).
  5. Chen, S., McDowall, A., et al. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).
  6. Meyerson, J. R., White, T. A., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).
  7. Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
  8. Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging. J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).
  9. Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks. Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).
  10. Volkmann, N. A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps. Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).
  11. Rigort, A., Günther, D., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).
  12. Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation. Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).
  13. Lin, Z., Davis, L. S. Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).
  14. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0. Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).
  17. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  18. Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  19. Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).
  20. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).
  21. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
  22. Frangakis, A. S., Hegerl, R. Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion. Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).
  23. Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).
  24. Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering. Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  26. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. MathWorks. MATLAB. , (2012).
  28. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).
  29. Vedaldi, A., Fulkerson, B. VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).
  30. Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. What are Textons? International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).
  31. Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).
  32. Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).
  33. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  34. Shin, J. B., Krey, J. F., et al. Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle. Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).
  35. Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta. Journal of Information & Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 90، المجهر الإلكتروني 3D، واستخراج ميزة، وتجزئة وتحليل الصور والتعمير، تتبع اليدوي، العتبة
من Voxels إلى المعرفة: دليل عملي للتجزئة مجمع المجهر الإلكتروني 3D-البيانات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tsai, W. T., Hassan, A., Sarkar, P., … More

Tsai, W. T., Hassan, A., Sarkar, P., Correa, J., Metlagel, Z., Jorgens, D. M., Auer, M. From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data. J. Vis. Exp. (90), e51673, doi:10.3791/51673 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter