Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

В Ситу обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II

Published: August 1, 2014 doi: 10.3791/51679
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 2, 1
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

Summary

Протокол обнаружить самореактивные лимфоциты CD4 в мозг и сердце путем прямого окрашивания главного комплекса гистосовместимости dextramers класс II был описан в настоящем докладе. Для всестороннего анализа, надежный способ перечислить частоты антиген-специфических CD4 + Т-клеток в месте также предназначен.

Introduction

Использование главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II тетрамерами обнаружения антиген-специфических CD4 Т-клеток был вызов 1-7. Для повышения чувствительности обнаружения тетрамеров МНС класса II, исследовательская группа создала тетрамеров нового поколения, предназначенные "dextramers" 8. Dextramers содержать декстран магистралей, в которой множество стрептавидином флуорофор фрагменты конъюгируют таким образом, что несколько пептидов привязи, биотинилированные мономеры МНС могут быть присоединены к одной молекуле декстрана 9. Таким образом, крупные агрегаты МНС dextramers, которые содержат несколько комплексов МНС-пептид может взаимодействовать с несколькими рецепторами Т-клеток (TCR).

Эта группа недавно генерируется dextramers для различных аутоантигены и показали, что чувствительность обнаружения dextramers был примерно в пять раз больше, чем тетрамеры 8. Экспериментальные системы включают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAЕ) индуцируют протеолипидного белка (PLP) 139-151 у мышей SJL; EAE индуцировали миелина олигодендроцитов (MOG гликопротеина) 35-55 в C57BL / 6 мышей; и экспериментальный аутоиммунный миокардит (EAM), индуцированный с сердечной миозина тяжелой цепи-α (MyHC) 334-352 в / J мышей. Это исследование демонстрирует использование PLP 139-151 - и MyHC 334-352 dextramers обнаружить антиген-специфических CD4 Т-клеток в месте со спецификой путем разработки прямое протокол окрашивания, тем самым устраняя необходимость усиливать сигналы от использования флуорофорные антитела, подход обычно используют с использованием тетрамеров. Кроме того, комплексный метод оценки тканей также был разработан, чтобы надежно перечислить частоты антиген-специфических Т-клеток CD4 на месте 10. Обнаружение антиген-специфических Т-клеток в месте допускает разграничение событий, вызванных конкретных антигенных стимулов от тех, которые вызваны активацией наблюдателем. Аналогичным образом, в технику Ситу также ProvidES возможности отслеживать кинетику антиген-специфических Т-клеток инфильтратов в целевых органах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Заявление по этике:

Все животные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами для уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Университета Небраска-Линкольн, Lincoln, NE.

1. Индукция EAE

  1. Для индукции ЕАЕ, подготовить пептид / полном адъюванте Фрейнда (CFA) эмульсии, как описано в 11 со следующими изменениями: Шаг 1.1:. Подготовить PLP 139-151 в концентрации 1 мг / мл в 1X фосфатно-солевом буфере (PBS) Шаг 1.4:. использовать 200 мкл CFA эмульсии, содержащей 100 мкг PLP 139-151 на одно животное Шаг 1.4.1: иммунизировать десять животных, готовить 2 мл эмульсии путем смешивания 1 мл PLP 139-151 (1 мг / мл в 1X . PBS) и равный объем CFA Шаг 1,5: вводить 200 мкл эмульсии в Сплите дозах подкожно в двух паховых областях (~ 75 мкл каждой) и грудины области (~ 50 мкл) пять-шесть-недельных FEMAле SJL / J мышей. Шаги 1.7 и 1.8, не применяются для индукции ЭАЭ.

2. Клиническая Подсчет EAE мышах и заготовке Cerebrums

  1. Монитор животных для появления клинических признаков, и оценка болезненного тяжести ежедневно с днем ​​9 после иммунизации следующим образом: 0 - здоровый; 1 - хромота хвоста или задних конечностей слабости, но не то и другое; 2 - хромота хвоста и задних конечностей слабость; 3 - частичный паралич задних конечностей; 4 - полный паралич задних конечностей; 5 - агония или мертвым 12.
  2. Усыпить мышей, когда они достигают неврологическое оценку 3 или 4 с помощью CO 2. Чтобы усыпить мышей, сначала предварительно заполнить эвтаназии камеру с CO 2, поворачивая регулятор СО 2 танка не более 6 фунтов на квадратный дюйм и позволяют животным остаться в камере в течение примерно 5 минут, чтобы достичь полного асфиксии. Замочите эвтаназии животных в 70% спирте. Сразу разместить животных на абсорбирующей прокладки и с использованием пары стерильный длябелые грибы и ножницы разоблачить сердца, проходящем через грудной полости. Прокол правильные ушные раковины и заливать путем введения 10 мл холодной 1x PBS в левые желудочки сердца.
  3. Выкопать череп на отрезая череп по кругу с помощью пары изогнутых ножниц и осторожно, флип костей черепа щипцами. Урожай мозг, тупым и с помощью чистой скальпель, отдельный головной мозг от мозжечка. Поместите головной мозг в пробирку, содержащую холодной 1X PBS и не оставляют пробирку на льду до обработки.

3. В Ситу Окрашивание головного разделах с МНС класса II (И.А. ов) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Получение 4% PBS буфером с низкой температурой плавления агарозы, расплав при нагревании при 50 ° С и оставить его в водяной бане при 40 ° С до использования.
  2. Поместите головной мозг в одноразовом глубоко база формы гистологии кассеты удерживается на льду, и залить расплавленный (40 ° C) агарозы. Сразу нажмите головной мозг мягкос щипцы, чтобы погрузить ткань. Оставьте кассету на льду в течение 15-20 мин, пока отверждение не будет завершена.
  3. Заполните Vibratome ванну с охлажденным 1x PBS. Заполните пространство вокруг Vibratome бане со льдом, чтобы поддерживать температуру PBS между 0 и 2 ° C. Fix чистую лезвие в Vibratome и установить угол лезвия 15 °.
  4. Размещение ткани в Vibratome. Обрежьте излишки агарозы от всех сторон встроенном ткани и немного разоблачить брюшной поверхности головного мозга.
    1. Намажьте Vibratome тканей блок с супер клей и передачи агарозном встраиваемый ткани над клееной поверхности, помещая подвергается вентральной поверхности головного мозга над клей для поперечной срезов. Не перемещайте ткань, как только ткань установлен на блоке.
    2. Поместите Vibratome блок, содержащий агарозы встраиваемый ткани на льду, и позвольте клею высохнуть в течение 15 мин.
  5. В то же время, поместите ткань ChamБерс один на лунку в 24-луночный планшет. Заполните лунки, содержащие ткани камер с 1 мл холодного PBS 1x, и оставить пластину на льду.
    1. Подготовка ткани камеры путем присоединения тонкий нейлон сетка с вырезом конце 25 мл полипропиленовой пипетки с использованием супер клей; после обрезки избытка сетку вокруг пипетки, разрезать пипеткой длиной 1 см от сетки.
  6. Опустить Vibratome лезвие до уровня верхней поверхности ткани; установить скорость Vibratome 0,22 мм / сек и начать секционирования с движением вперед, чтобы сделать толщиной 200 мкм разделы. Трансфер один мозговой раздел на лунку, используя акварель мягкой щеткой в ​​тканевые камер, помещенных внутри лунки 24-луночного планшета. Держите тарелку на льду до секционирования не обходится для предотвращения деградации тканей. Примечание: Выполните следующие действия, чтобы получить в общей сложности, три парных секций из трех различных регионах мозга спинной до брюшной поверхности (рис. 2). Один из разделов откаждая пара (в общей сложности три секции) размещены в трех отдельных камер ткани предназначены для окрашивания конкретных dextramers (IA с / PLP 139-151) и анти-CD4. Кроме того, еще один набор из трех секций, которые размещаются в трех отдельных камер ткани предназначены для окрашивания управления dextramers (И.А. с / TMEV 70-86) и анти-CD4.
  7. Передача три камеры ткани, содержащие участки, предназначенные для окрашивания конкретных dextramers на три лунки в 24-луночный планшет с одной камеры на лунку, в котором, 300 мкл коктейля, содержащего аллофикоцианин (АРС)-конъюгированные PLP 139-151 dextramers (2.5 мкг / мл) и анти-CD4-фикоэритрин (РЕ; ранее добавляли 5 мкг / мл) в блокирующем растворе (1X PBS с 2% нормальной козьей сывороткой). Покройте скважин с крышкой.
  8. Аналогичным образом, передавать три камеры ткани, содержащие участки, предназначенные для окрашивания с контрольными dextramers на три лунки в 24-луночный планшет с одной камеры на мыLL, в котором, 300 мкл коктейля, содержащего APC-конъюгированного TMEV 70-86 dextramers (2,5 мкг / мл) и анти-CD4-PE (5 мкг / мл) в блокирующем растворе добавленный. Покройте скважин с крышкой. Примечание: Обратитесь к Massilamany и др., 8 для подготовки dextramers, и молекул декстрана по подготовке dextramers были любезно предоставлены Immudex, Копенгаген, Дания..
  9. Этикетка скважин, и оберните тарелку с алюминиевой фольгой и поместите пластину на качающейся платформе, установленной в нежных вращений в течение 1,5 часа в темноте при комнатной температуре.
  10. После периода инкубации, мыть срезах тканей на качающейся платформе, путем переноса ткани камеры для свежих хорошо, содержащий 1 мл холодного PBS 1x, и избежать ведением содержимое одного хорошо в другой. Повторите промывку трижды, позволяя по крайней мере, 10 мин на промывку. Убедитесь, что срезы ткани не получают сушат, как они могут прилипнуть к стенкам камеры.
  11. Fix разделы путем переноса ткани ChamBers в свежую лунку в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл отфильтрованной 4% PBS-буферном параформальдегида (рН 7,4) на платформе-качалке в течение 2 часов с нежным вращений.
  12. Повторите промывку трижды, как описано в шаге 3.10.
  13. Поместите окрашенных и фиксированные разделы, посвященные чистой предметное стекло с использованием акварели мягкую кисть. Протрите излишки воды, не касаясь раздел и смонтировать раздел, используя монтажную среду. Обложка с микроскопическим покровного и позволяют слайды высохнуть при комнатной температуре O / N в темной комнате.
  14. Храните слайды в ящике для хранения слайд светонепроницаемый при 4 ° С.

4. Индукция EAM и сбора сердец

  1. Вызвать EAM, как описано в ссылке 11.
  2. Усыпить мышей на день 21 после иммунизации с использованием чистой камеру, снабженную CO 2 газового баллона, и замочить животных в 70% спирте. Сразу разместить животных на абсорбирующей прокладки и с использованием пары щипцов и ножниц подвергать сердцес разрезанием через грудной полости. Прокол правильные ушные раковины и заливать путем введения 10 мл холодной 1x PBS в левые желудочки сердца. Сбор сердца и место в пробирки, содержащие холодной 1X PBS.

5. В Ситу Окрашивание сердца разделах с МНС класса II (И.А. к) / MyHC 334-352 Dextramers

  1. Подготовка 4% PBS буфером с низкой температурой плавления агарозы, расплав при нагревании при 50 ° С и оставить его в 40   не ° C водяной бане до использования.
  2. Поместите сердце в одноразовом глубокой база формы гистологии кассеты выдерживали на льду, и залить расплавленный 40 ° C агароза, пока ткани не будут полностью погружены как описано на стадии 3.2.
  3. Выполните шаг 3,3.
  4. Обрежьте излишки агарозы от всех сторон вложенного ткани и слегка подвергать основание сердца. Намажьте Vibratome тканей блок с супер клей и передачи агарозном встраиваемый ткани над клееной поверхности, помещая открытую поверхностьсердце на клей. Не перемещайте ткань, как только ткань установлен на блоке.
    1. Поместите Vibratome блок, содержащий агарозы встраиваемый ткани на льду, и позвольте клею высохнуть в течение 15 мин.
  5. Выполните шаги 3,5 и 3,6.
  6. Передача отделов сердца с использованием акварель мягкой кистью в тканевых камерах, расположенных в лунки 24-луночного планшета. Хранить пластину на льду до секционирования не завершится, чтобы предотвратить деградацию ткани. Примечание: Выполните следующие действия, чтобы получить в общей сложности, восемь парных секций от вершины до основания сердца (рис. 2). Поместите все разделы в ткани камер, выделяя до 3-х секций в камере. Один из разделов из каждой пары (в общем объеме восьми разделов) предназначен для окрашивания конкретных dextramers (И.А. к / MyHC 334-352) и анти-CD4. Кроме того, еще один набор из восьми разделов предназначен для окрашивания управления dextramers (И.А. к / РНКазных 43-56) и анти-CD4.
  7. Трансфертри камеры ткани, содержащие участки, предназначенные для окрашивания конкретных dextramers на три лунки в 24-луночный планшет с одной камеры на лунку в котором, 300 мкл коктейля, содержащего APC-конъюгированные MyHC 334-352 dextramers (2,5 мкг / мл) и анти-CD4-PE (5 мкг / мл) в блокирующем растворе добавленный. Покройте скважин с крышкой.
    1. Аналогичным образом, передавать три камеры ткани, содержащие участки, предназначенные для окрашивания с контрольными dextramers на три лунки в 24-луночный планшет с одной камеры на лунку, в котором, 300 мкл коктейля, содержащего APC-конъюгированного РНКазы 43-56 dextramers (2,5 мкг / мл) и анти-CD4-PE (5 мкг / мл) в блокирующем растворе добавленный. Покройте скважин с крышкой.
  8. Этикетка скважин, и оберните тарелку с алюминиевой фольгой и поместите пластину на качающейся платформе, установленной в нежных вращений в течение 1,5 часа в темноте при комнатной температуре.
  9. Выполните шаги, 3.10 в 3.11
  10. Повторите промывание Четлед, как описано в шаге 3.10.
  11. Поместите окрашенных и фиксированные разделы (до трех разделах / слайд) на чистую предметное стекло с помощью акварели мягкую кисть. Протрите излишки воды, не касаясь секции и монтировать разделы с помощью монтажной среды. Обложка с микроскопическим покровного и позволяют слайды высохнуть при комнатной температуре O / N в темной комнате.
  12. Храните слайды в ящике для хранения слайд светонепроницаемый на 4 ° C.

6. Анализ Dextramer + (Dext +) CD4 + Т-клетки с помощью лазера сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM) (общий для обоих мозга и сердца разделах)

  1. Используйте Nikon A1-Eclipse-90i конфокальной системы микроскоп для рутинных сканирования и приобретения изображений. Для начала Нажмите открытым, программное обеспечение NIS Elements AR (версия 4.13).
    1. Выберите "TRITC" и "Cy5" каналы с панели. Длины волн возбуждения / испускания соответственно для TRITC и Cy5 каналов, 561,5 нм / 553-618 нм и 640,7 нм / 663-738 нм отображается по умолчанию.
    2. Назначьте pseudocolors "зеленых" и "красный" для TRITC (CD4-PE) и Cy5 (dextramer-APC) каналов, соответственно.
    3. Поместите слайд быть осмотренным на микроскопическом стадии и выполните фокусировку вручную под 100-кратном увеличении. Установите "HV" до 110 и смещение на "0". Нажмите "Фокус" и настроить "напряжение" для оптимизации лазеров.
    4. Нажмите "Фокус"; сканировать раздел сверху донизу, и установить уровень 'Z' для получения изображения. Нажмите кнопку "CH серию" и приобрести изображения последовательно. Определить Dext + CD4 + Т-клетки появляются как желтые точечные элементы на основе совместной локализации сигналов, генерируемых как от красного (dextramers) и зеленый (CD4) каналов.
  2. Используйте Olympus FV500-BX60 конфокальной микроскопии для легкого количественного подсчета Dext + CD4 + Т-клеток. Для началанажмите открытым, программное обеспечение FluoView (версия 4.3).
    1. Выберите красителей "Су3" и "Cy5" из выпадающего меню, и нажмите кнопку "Применить", чтобы загрузить соответствующие лазеры. Примечание: длины волн возбуждения / эмиссии для Cy3 (543 нм / псевдоцветной "зеленый"; CD4-PE) и Cy5 (633 нм / псевдоцветной "красный"; dextramer-APC) каналов.
    2. Поместите слайд быть осмотренным на предметное стекло, и сфокусировать его вручную под малом увеличении (4X или 10X). Нажмите "Фокус" в то время как лазер Су3 включен, и сосредоточиться на очаг воспаления.
    3. Измените задачу 100-кратном увеличении. Установить размер файла "512/512" от выпадающем меню. Нажмите "Фокус" и отрегулируйте значения для "ПМТ", "усиления" и "Смещение" параметры для оптимизации лазеров отдельно для Cy3 и Cy5.
    4. Нажмите "Z этап" и нажмите кнопку "Фокус" в то время как оба лазеры на. Набортолщина "Z этапе", нажав кнопку "вверх" и "вниз" стрелки. Установите "Z" интервал до 2 мкм.
    5. Нажмите кнопку "Стоп", и выберите "Seq123". Затем нажмите "XYZ" и начать получения изображений серии «Z» для выбранной области в очаг воспаления. Сохраните "Z серийные изображения" как AVI файлов. Чтобы сохранить файлы изображений, выберите изображение из "Z последовательного образа", а затем сохранить в формате "TIFF".
  3. Изучите три парных разделы из головного мозга, где один набор из трех разделов окрашивали И.А. с / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 и другой набор из трех секций с И.А. с / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 выполнять Количественный анализ.
    1. Точно так же, проанализировать восемь парных разделы для сердца, в котором, один набор из восьми разделов окрашивали И.А. к / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 и другой себет из восьми разделов с РНКазы 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Изучите 10 до 15 воспалительные очаги за раздел в головном мозге, и в каждом фокусе, приобрести набор 15 до 25 последовательных изображений последовательно.
    1. Изучите в общей сложности 20 очагов воспаления из всех восьми секций сердца и от каждого фокуса приобрести от 10 до 15 последовательных изображений последовательно. Возьмите 'Z' серийные изображения путем сканирования слайдов в "до-горизонтально-вертикального сверху вниз горизонтально-вертикальный« движения так, чтобы повторение 'Я' серии в том же фокусе избежать.
    2. После того, как последовательные изображения 'Z' в плен, назвать файлы путем выявления номеров слайдов, имя секциях, и ряд 'Z' серийных снимков, сделанных.
      1. С помощью программного обеспечения ImageJ '' считать Dext + CD4 + Т-клеток по отношению к общему количеству CD4 + Т-клеток. Выберите "тип счетчика" в "ImageJ, проверьте &# 8216; показать все »и начать отсчет, нажав на центр каждой ячейки и продолжает отсчет в различных 'Z' серийных изображений с помощью боковых стрелок. После подсчета всех лимфоциты CD4, выберите другой тип счетчика и подсчитать CD4 + Dext + Т-клеток. Перейдите на вкладку результаты, чтобы получить общее количество подсчитанных клеток с двух различных счетчиков.
      2. Чтобы получить общее количество, добавить количество клеток во всех 'Z' серийных изображений, представляющих все три мозговых разделы или все разделы сердечные восемь.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом докладе, в обнаружении месте антигенспецифических, аутореактивных лимфоцитов CD4 путем прямого окрашивания dextramers МНС класса II описан. Свежесрезанных мозговые участки были получены от мышей EAE и окрашивали коктейлей, содержащих PLP 139-151 (специфические) или TMEV 70-86 (управление) dextramers и анти-CD4. Верхние панели на рисунке 1 показывает LSCM анализ мозга секций costained с PLP 139-151 dextramers (красный) и CD4 антитела (зеленый), где двойные-позитивные клетки появились желтого цвета. Такая особенность отсутствовал в срезах, окрашенных TMEV 70-86 (управление) dextramers (внизу панели). В costained (Dext + CD4 +) клетки показали точечные точек вокруг периферии. Количественный анализ PLP-специфических Т-клеток в коре головного секций участвуют следующие действия (рис. 2): 1) были сделаны Разделы трех пар, и одна секция из каждой пары окрашивали индивидуально с анти-CD4 и PLP 139-151 dextramers. Кроме того, еще один набор из трех разделов окрашивали dextramers анти-CD4 и управления (TMEV 70-86). 2) Из данного раздела, воспалительные очаги (10 до 15) были определены на основе окрашивания анти-CD4. 3) Набор 'Z' серийных изображений (15 до 25) были взяты из каждой фокус последовательно сверху вниз с интервалом в 2 мкм между собой. В сущности, от 10 до 15 подобных наборов последовательных изображений 'Z', представляющие равное количество воспалительных очагов были проанализированы в каждом разделе. 4) В отдельных изображений, CD4 + клетки (зеленые), клетки положительные для обеих dextramers (красный) и CD4 (зеленый), который появился как желтые точечные подсчет клеток, пометив их индивидуально, используя программное обеспечение с открытым исходным кодом, ImageJ, и наконец, общий итог был получен для каждой секции, добавив количество подсчитанных клеток во всех 'Z' серийных изображений. Потому что клетки были отмечены, возможность пересчета клеток в нескольких изображений, которыеперекрытие был ликвидирован. Таким образом, надежность перечисление Dext клеток + отношению к общему количеству клеток, экспрессирующих CD4 может быть достигнута.

Это исследование было расширено, чтобы продемонстрировать использование dextramer реагентов для обнаружения антиген-сенсибилизированный Т-клеток на месте в EAM индуцированной с MyHC 334-352 в / J мышей, что также клеточно-опосредованный болезнь Т 13,14. Восемь парных разделы сердца были получены, каждый толщиной 200 мкм, от EAM мышей (рис. 2). Из каждой пары, одна секция (в общей сложности 8 секций) окрашивали MyHC 334-352 dextramers и анти-CD4, в то время как другой набор секций (8 в общей сложности) окрашивали РНКазы 43-56 dextramers (контроль) и анти -CD4. Двадцать множества последовательных изображений 'Z', соответствующих, что многие воспалительных очагов, представляющей все восемь секций были приобретены последовательно, как описано выше (рис. 2). По сути, данный набор серийный им 'Z'возраст состоял из 10 до 15 человека представлена ​​одну единственную воспалительный фокус. Анализ этих изображений по LSCM показал наличие клеток, позитивных по MyHC 334-352 dextramers (красный), и CD4 (зеленый) и ожидаемо, клетки связаны с обеих dextramers и CD4 появились желтые точечные клетки (рис. 3, верхние панели) . Фон окрашивание контрольных dextramers было незначительным (рис. 3, нижняя панели). Общая численность Dext + CD4 + Т-клеток и общее количество CD4 + Т-клеток были определены для каждого раздела и рассчитывает из всех секциях были добавлены вместе, чтобы получить общее количество для каждого подмножества (Dext + CD4 + T-клеток; CD4 + Т-клетки).

Рисунок 1
Рисунок 1. Обнаружение PLP-специфических Т-клеток CD4 на месте с помощью окрашивание ПЛП 139-151 dextramers. ЕАЕ вызывали у мышей SJL путем иммунизации животных с PLP 139-151 в CFA. При прекращении, cerebrums собранные от мышей EAE были включены в 4% агарозном и срезы с использованием Vibratome. После окрашивания с коктейлями, содержащими либо PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 или TMEV 70-86 dextramers (контроль) / анти-CD4 и фиксации с 4% PBS-буферном параформальдегиде, срезы промывали и установлен для рассмотрения LSCM. Топ панели: два отдельных срезах, окрашенных PLP 139-151 dextramers/anti-CD4. Донные панели: два отдельных срезах, окрашенных TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. Левая панель: CD4, зеленый; Ближний панели: dextramers, красный; Правая панель: объединены (стрелки, Dext + CD4 + Т-клеток). Оригинальный увеличение 1000 X (принят:.. Massilamany др., 2014 Прямая Окрашивание с главного комплекса гистосовместимости класса II Dextramers позволяет регистрировать антигенспецифических, Аутореактивных лимфоцитов CD4с на месте PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Подход к количественной Dext + клеток в мозгах и сердцах. Парные секции выполнены из головного мозга или ушной раковины-вырезали сердце, как показано (панель 1). Один из разделов из каждой пары, соответствующей указанных органов был назначен для окрашивания конкретных dextramers (головного мозга, ПЛП 139-151 dextramers; сердца, MyHC 334-352 dextramers), а с другой набор разделов для управления dextramers (головного мозга, TMEV 70 - 86; сердца, РНКазы 43-56). После фиксации и крепления, секции были рассмотрены с целью найти воспалительные очаги на основе окрашивания CD4 на LSCM (оригинальный магнитныйличение, 40X) (Панель 2). Каждый воспалительного очага, как визуализировать в трехмерном (3D) зрения (Panel 3) подвергался набора 'Z' серийные изображения последовательно (Panel 4). Во всех изображений, клетки положительные как на специфическое или контроля dextramers и CD4, или CD4 одиночку подсчитывали с использованием программного обеспечения «ImageJ" (принят:.. Massilamany и др., 2014 Прямая Окрашивание с главного комплекса гистосовместимости класса II Dextramers Позволяет определение антигена- Конкретные, Аутореактивных лимфоцитов CD4 на месте PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Обнаружение сердечных миозина-специфических CD4 Т-клеток на месте + CD4 + (принятые:.. Massilamany др., 2014 Прямая Окрашивание с главного комплекса гистосовместимости класса II Dextramers позволяет регистрировать антигенспецифических, Аутореактивных CD4 Т-клеток на месте PLoS ONE 9 (1):. E87519). Пожалуйста, нажмите здесь чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В отличие от I тетрамеров МНС класса, использование тетрамеров МНС класса II для обычных приложений продолжает оставаться сложной, особенно для перечисления частоты предшественники низкоаффинных аутореактивных лимфоцитов CD4, отчасти из-за их активации зависимости 6,15-17. В последнее время эта проблема была обойдена путем создания следующего поколения тетрамеров, под названием "dextramers," позволяя нам обнаружить антиген-специфических CD4 Т-клеток в течение ряда аутоантигенам, таких как PLP 139-151, МНГ 35-55 и MyHC 334 - 352 8. В этом докладе, в первый раз, полезность dextramers МНС класса II для выявления и количественной самореактивные лимфоциты CD4 на месте было продемонстрировано с использованием срезы головного мозга от мышей EAE и сердечные разделы из мышей EAM. На основе реакции, dextramers обладают тем преимуществом, требующий небольшого количества MHC / пептидных комплексов. В этом протоколе, каждая реакция требуется только 0,75 мкг МНС / пептидных мономеров. Кроме того, ГНАining с dextramers является один шаг реакция, так как dextramers которые выдерживают совместно с анти-CD4, и вся процедура, от ткани срезов к окрашиванию, может быть завершена менее чем за день. В противоположность этому, опубликованные протоколы для окрашивания на месте с обычными тетрамеров обычно включают процедуры амплификации, в которых флуоресцентные сигналы усиливаются с помощью вторичных антител для флуорофоров. В результате окрашивания процедуры могут занять до трех дней, чтобы завершить 18-20.

Кроме того, использование dextramers в мозговых секций позволяет обнаруживать антиген-специфических Т глубоко в срезах тканей клеток, вплоть до 50 мкм. Было отмечено, что PLP 139-151 Dext + CD4 + клетки были обнаружены быть расположены как perivascularly а также в паренхиме. Кроме того, интенсивность сигналов, генерируемых из MyHC 334-352 dextramers была низкой в ​​сердечных секциях по сравнению с ПЛП 139-151 dextramers в мозговой секусловиям (рис. 1), и такое изменение может отражать характеристики, уникальные для каждого органа. Одним из таких переменная содержание липидов, который присутствует в больших количествах в ткани головного мозга в отличие от сердечной ткани, содержащей в основном поперечно-полосатых мышечных волокон, которые потенциально могут ограничить диффузию легко dextramers в воспалительного очага. В поддержку этого понятия, MyHC 334-352 Dext + клеток были обнаружены только на глубину до 20 мкм в большинстве сердечных разделах. Кроме того, MyHC 334-352 Dext + клеток присутствовали разбросаны на всем протяжении миокарда предлагая на рассеянный характер воспалительных инфильтратов в миокардитического поражений.

Как правило, два основных фактора, может отрицательно повлиять на обнаружение антиген-специфических Т-клеток на месте путем LSCM. Во-первых, недостаточно сигналы, испускаемые флуорофорами может привести к необходимости усиления сигналов с помощью флуорофорные антител. Во-вторых, такие косвенным пятноIng может подорвать специфику, так как фон окрашивание контрольных реагентов может также увеличить пропорционально 18,19. Эти ограничения были обойти путем прямого окрашивания с dextramers. Хотя, обнаружение лимфоцитов CD4 успешно показано со свежими секций, использование dextramer реагентов в замороженных тканях требует дополнительных исследований, которые могут быть проблемой, поскольку сохранение ткани-целостности может быть трудно из-за тенденции для ткани, чтобы получить распалась в различное окрашивание шаги 18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов не объявлялись.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Американской ассоциации сердца и Детского кардиомиопатии Foundation (SDG2462390204001) и Национальных Институтов Здоровья (HL114669). CM является получателем докторской исследования стипендий гранта, предоставленного Миокардит фонда, Нью-Джерси.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).

Tags

Иммунологии выпуск 90 dextramers; МНС класса II;
<em>В Ситу</em> обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Massilamany, C., Gangaplara, A.,… More

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter