Summary
주요 조직 적합성 복합체 클래스 II dextramers 직접 염색으로 뇌와 심장 자기 반응성 CD4 T 세포를 감지하는 프로토콜은이 보고서에 설명되어 있습니다. 종합적인 분석을 위해, 시츄 항원 특이 CD4 + T 세포의 빈도를 열거하는 신뢰할 수있는 방법도 고안되어있다.
Introduction
주요 조직 적합성 복합체의 사용은 항원 특이 CD4 T 세포의 검출 (MHC) 클래스 II 테트라 도전 1-7이었다. MHC 클래스 II 테트라의 검출 감도를 향상시키기 위해, 연구팀은 지정된 차세대 테트라, "dextramers"8을 만들었습니다. Dextramers는 여러 가지 펩타이드 닿는, 바이오틴 MHC 단량체 한 덱스 트란 분자 9에 부착 할 수있는 여러 스트렙 타비 딘 - 형광 부분이 접합되는 덱스 트란 등뼈가 포함되어 있습니다. 따라서, 몇개의 MHC-펩티드 복합체를 포함하는 MHC dextramers의 큰 응집체가 다수의 T 세포 수용체 (TCR도)와 상호 작용할 수있다.
이 그룹은 최근 다양한 자기 항원에 대한 dextramers을 생성 dextramers의 검출 감도가 약 테트라 8보다 5 배 정도였다. 실험 시스템은 실험자가 면역 뇌척수염을 포함 (EAE) 테오 단백질 (PLP) SJL 마우스에서 139-151로 유도; EAE는 수초 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG) C57BL / 6 마우스에서 35-55로 유도; 실험자가 면역 심근염 (EAM)는 심장 미오신 중쇄-α (Myhc) A / J 생쥐에서 334-352로 유도. 이 연구는 PLP 139-151의 사용을 보여 - 및 Myhc 334-352함으로써 형광 항체를 사용하여 신호를 증폭 할 필요가 없어, 직접 염색 프로토콜을 개발함으로써 특이 반응계에서 항원 특이 CD4 T 세포를 검출 dextramers 접근 일반적으로 테트라의 사용과 채택했다. 또, 조직을 평가하는 포괄적 인 방법은 또한 안정적 시츄 (10) 항원 특이 CD4 T 세포의 빈도를 열거 고안되었다. 시츄 항원 특이 T 세포의 검출 와키 활성화로 인한 것과 특정 항원 자극에 의해 유발 사건 묘사를 허용한다. 마찬가지로,있는 현장 기술도 제공하기대상 기관에 항원 특이 T 세포 침윤의 동역학을 추적하는 에스 기회.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
윤리 문 :
모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 실시 및 네브래스카 링컨, 링컨, 네브래스카의 대학에 의해 승인되었습니다.
EAE 1. 유도
- 단계 1.1 : EAE를 유도하기 위해, 다음의 수정 (11)에서 설명한 바와 같이 펩티드 / 완전 프로 인트 아쥬 반트 (CFA) 에멀션 제조. 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)의 1 ㎎ / ㎖의 농도에서 PLP 139-151 준비 단계 1.4 :. 동물 당 PLP 139-151의 100 μg을 포함 CFA 에멀젼 200 μl를 사용 1.4.1 단계 : 동물 10 마리를 예방 접종 1 PLP 139-151 ㎖의 (1 ㎎ / ㎖의 1X를 혼합하여 에멀젼 2 ㎖를 준비하는 . PBS)와 CFA의 같은 부피의 1.5 단계 : 두 서혜부 (~ 75 μL 각)과 5 ~-6 주짜리의 흉골 지역 (~ 50 μL)의 피하에 분할 복용 에멀젼 200 μl를 주입 FEMA르 SJL / J 마우스. 1.7 및 1.8 EAE의 유도를 위해 적용 할 수 없습니다 단계.
EAE 마우스와 대뇌의 수확 2. 임상 점수
- 임상 증상의 모양에 대한 동물을 모니터링하고, 다음 날 9 postimmunization 매일 질병 심각도 점수 : 0 - 건강; 1 - 꼬리 나 뒷다리의 약점 미약하지만 모두; 2 - 꼬리와 뒷다리의 약점 맥 빠진; 3 - 뒷다리의 부분 마비; 4 - 뒷다리의 완전한 마비; 5 - 죽어가는 혹은 죽은 12.
- 그들은 CO 2를 사용하여 3 또는 4의 신경 학적 점수에 도달했을 때 쥐를 안락사. 쥐를 안락사하기 위해,하지 6 PSI를 초과하는 CO 2 탱크의 조절기를 설정하여 CO 2를 먼저 안락사 챔버를 미리 기입 동물이 완료 질식을 달성하기 위해 약 5 분 동안 챔버 내에서 체류 할 수 있습니다. 70 % 알코올에 안락사 동물을 적신다. 즉, 흡수 패드에 동물을 배치하고 멸균의 쌍을 사용CEPS와 가위 흉강을 통해 절단에 의해 마음을 노출합니다. 오른쪽 귓바퀴에 구멍과 마음의 왼쪽 심실에 차가운 1X PBS 10 ㎖를 주입하여 perfuse.
- 곡선 가위를 사용하여 순환 적 두개골을 자르는하여 두개골을 발굴, 조심스럽게, 집게와 두개골 뼈를 플립. 해부를 둔 깨끗한 메스, 소뇌에서 별도의 대뇌를 사용하여 두뇌를 수확. 차가운 1X PBS가 들어있는 튜브에 뇌를 놓고 처리 될 때까지 얼음에 튜브를 둡니다.
3. MHC 클래스 II (IA들) / PLP 139-151 Dextramers와 대뇌 섹션의 제자리 염색법에
- 4 %는 PBS 버퍼 저 융점 아가 로스, 50 ° C에서 가열하여 용융 사용할 때까지 40 ° C의 물을 욕조에두고 준비합니다.
- 처분 할 수있는 깊은베이스 금형 조직학 카세트의 뇌를 놓고 얼음 위에 보관 및 용융 (40 ° C) 아가로 오스를 붓는다. 즉시 부드럽게 뇌를 눌러집게는 조직을 잠수함으로. 응고가 완료 될 때까지 15 ~ 20 분 동안 얼음에 카세트를 남겨주세요.
- 냉장 1X PBS로 vibratome 목욕을 입력합니다. 0과 2 사이의 PBS의 온도를 유지하기 위해 얼음 조각으로 vibratome 화장실 주위의 공간을 채우기 ° C. vibratome에 깨끗한 면도날을 수정하고 15 °로 블레이드 각도를 설정합니다.
- vibratome에있는 조직의 위치. 포함 된 조직의 모든 측면에서 초과 아가로 오스를 정돈하고 약간 대뇌의 복부 표면을 노출.
- 최고 접착제와 vibratome 조직 블록을 바르고 가로 단면의 접착제를 통해 대뇌의 노출 된 복부 표면을 배치하여 접착면에 아가로 오스 - 임베디드 조직을 전송합니다. 조직이 블록에 설정되면, 조직을 이동하지 마십시오.
- 얼음에 아가로 오스 - 임베디드 조직을 포함하는 vibratome 블록을 배치하고, 접착제가 15 분 동안 건조 할 수 있습니다.
- 한편, 티슈 참 배치24 - 웰 플레이트의 웰 당 하나를 BERS. 차가운 1X PBS 1 ㎖와 조직 챔버를 포함하는 우물을 입력하고 얼음에 플레이트를 둡니다.
- 얇은 나일론 최고 접착제를 사용하여 25 ㎖ 폴리 프로필렌 피펫의 절단 단부에 부착하여 메쉬 조직 실 준비; 피펫의 주위에 여분의 메쉬를 트리밍 한 후, 메쉬 1 cm의 길이로 피펫을 잘라.
- 조직의 상부면의 레벨까지 vibratome 블레이드를 내리고; 0.22 mm / 초에 vibratome 속도를 설정하고 200 μm의 두께 부분을 만들기 위해 전진과 절편 시작합니다. 잘 24 - 웰 플레이트의 우물 내에 배치 조직 챔버에 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 당 하나의 뇌 부분을 전송합니다. 절편은 조직의 저하를 방지하기 위해 완료 될 때까지 얼음에 플레이트를 유지합니다. 참고 : 복부 표면에 뇌 등의 세 가지 영역 (그림 2)에서 총 세 쌍 절에서 획득하려면 다음 단계를 수행합니다. 에서 하나의 섹션세 개의 개별 조직의 챔버에 배치 (총 세 부분에서) 각 쌍은 특정 dextramers로 염색을 위해 지정된 (IA S / PLP 139-151) 및 안티 CD4됩니다. 마찬가지로, 세 개의 개별 조직의 챔버에 배치됩니다 세 부분의 또 다른 세트는 제어 dextramers로 염색을 위해 지정된다 (IA S / TMEV 70 ~ 86) 및 안티 CD4.
- 하나의 챔버와 24 - 웰 플레이트에 세 우물에 특정 dextramers로 염색마다 잘 대해 지정된 섹션을 포함하는 세 가지 조직 챔버를 전송하는, 알로 피코를 포함하는 칵테일의 300 μL (APC) - 복합 PLP 139-151 dextramers (2.5 ㎍ / ㎖) 및 안티 CD4-피코 에리 트린 (PE,) 2 % 정상 염소 혈청과 솔루션 (1X PBS를 차단하는 / ㎖ 5 μg)은 이전에 추가했다. 뚜껑 우물을 커버.
- 마찬가지로, 우리 당 하나의 챔버와 24 웰 플레이트에 세 우물에 제어 dextramers로 염색을 위해 지정된 섹션을 포함하는 세 가지 조직 챔버를 전송LL하는, APC-공액 TMEV 70 ~ 86 dextramers (2.5 ㎍ / ㎖) 솔루션을 차단하는 안티 - CD4-PE (5 ㎍ / ㎖)이 포함 된 칵테일의 300 μL는 이전에 추가되었습니다. 뚜껑 우물을 커버. 참고 : Massilamany 참조 등 8 dextramers의 준비 및 dextramers이 친절하게 Immudex, 코펜하겐, 덴마크에 의해 제공되었다 준비하는 덱스 트란 분자..
- 우물을 레이블 및 알루미늄 호일로 접시를 포장하고 실온에서 어둠 속에서 1.5 시간 동안 부드러운 회전으로 설정 흔들 플랫폼에서 접시를 놓습니다.
- 잠복기 후, 잘 차가운 1X PBS 1 ㎖를 포함하는 신선한에 조직 챔버를 전송하여, 락을 플랫폼에서 조직 섹션을 씻어 아니라 다른에 하나의 내용을 드리블하지 마십시오. 세척 당 적어도 10 분을 허용, 세 번 세탁을 반복합니다. 그들은 챔버의 측면에 충실 수있는 조직 섹션이 건조되지 않도록해야합니다.
- 조직 참를 전송하여 섹션을 수정부드러운 회전과 2 시간 동안 락을 플랫폼에서 필터링 4 % PBS 버퍼 파라 포름 알데히드 (산도 7.4) 1 ㎖를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 신선한 잘으로 BER들.
- 단계 3.10에 설명 된대로 세 번 세탁을 반복합니다.
- 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 깨끗한 현미경 슬라이드의 염색 및 고정 섹션을 배치합니다. 부분을 건드리지 않고 여분의 수분을 닦아 설치 매체를 사용하여 섹션을 탑재합니다. 미세한 커버 슬립 커버 및 슬라이드 어두운 방에서 RT O / N에서 건조 할 수 있습니다.
- 4 ℃에서 빛을 방지 슬라이드 저장 상자에서 슬라이드를 저장
마음의 EAM 및 컬렉션 4. 유도
- 참고 11에 설명 된대로 EAM을 유도한다.
- CO 2 가스 실린더가 장착되어 깨끗한 실을 사용하여 21 일 postimmunization에 쥐를 안락사, 70 % 알코올에 동물을 적신다. 즉시 흡수 패드에 동물을 배치하고 집게와 가위를 사용하여 심장을 노출흉강을 통해 절단하여의. 오른쪽 귓바퀴에 구멍과 마음의 왼쪽 심실에 차가운 1X PBS 10 ㎖를 주입하여 perfuse. 차가운 1X PBS가 들어있는 튜브에 하트와 장소를 수집합니다.
5. MHC 클래스 II (IA 케이) / Myhc 334-352 Dextramers 심장 섹션의 제자리 염색법에
- 준비 4 % 저 융점 아가 로스, 50 ° C에서 가열 용융 (40)에 남겨 PBS 버퍼 사용할 때까지 C 물 목욕 °.
- 얼음에 보관 일회용 깊은베이스 금형 조직학 카세트에 마음을 놓고 단계 3.2에 설명 된대로 조직이 완전히 침수 될 때까지 용융 아가로 오스 40 ° C를 붓는다.
- 3.3 단계를 따릅니다.
- 포함 된 조직의 모든 측면에서 초과 아가로 오스를 정돈하고 약간 마음의 기반을 노출합니다. 최고 접착제와 vibratome 조직 블록을 도말의 노출면을 배치하여 접착 표면 아가 매립 조직을 전송할접착제 위에 심장. 조직이 블록에 설정되면, 조직을 이동하지 마십시오.
- 얼음에 아가로 오스 - 임베디드 조직을 포함하는 vibratome 블록을 배치하고, 접착제가 15 분 동안 건조 할 수 있습니다.
- 단계 3.5 및 3.6을 따르십시오.
- 24 웰 플레이트의 우물 내에 배치 된 조직 챔버에 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 심장 섹션을 전송합니다. 절편은 조직의 저하를 방지하기 위해 완료 될 때까지 얼음에 플레이트를 유지합니다. 참고 : 마음의베이스 정점에서 여덟 쌍 섹션 (그림 2) 총 취득하려면 다음 단계를 수행하십시오. 실 당 3 절까지 할당, 조직 챔버의 모든 섹션을 배치합니다. (총 여덟 섹션) 각 쌍에서 하나의 섹션은 특정 dextramers (IA K / Myhc 334-352) 및 안티 CD4로 염색을 위해 지정되어있다. 마찬가지로, 팔 부분의 또 다른 세트는 제어 dextramers (IA K / RNA 분해 효소 43-56) 및 안티 CD4로 염색을 위해 지정되어있다.
- 이동잘 당 하나의 챔버와 24 - 웰 플레이트에있는 세 개의 우물에 특정 dextramers로 염색을 위해 지정된 섹션을 포함하는 세 조직 챔버하는 300 APC-공액 Myhc 334-352 dextramers (2.5 ㎍ / ㎖)이 포함 된 칵테일 μL와 솔루션을 차단하는 안티 - CD4-PE (5 ㎍ / ㎖)을 이전에 추가했다. 뚜껑 우물을 커버.
- 이와 유사하게, 잘 당 하나의 챔버와 24 - 웰 플레이트에 세 우물에 제어 dextramers로 염색을 위해 지정된 섹션을 포함하는 세 가지 조직 챔버를 전송하는, 43-56 dextramers (2.5 μg을 APC-공액 RNA 분해 효소를 포함하는 칵테일의 300 μL 차단 솔루션에 / ㎖) 및 안티 CD4-PE (5 ㎍ / ㎖)을 이전에 추가했다. 뚜껑 우물을 커버.
- 우물을 레이블 및 알루미늄 호일로 접시를 포장하고 실온에서 어둠 속에서 1.5 시간 동안 부드러운 회전으로 설정 흔들 플랫폼에서 접시를 놓습니다.
- 단, 3.10 3.11에 따라
- 반복 세탁 THR단계 3.10에 설명 된대로 얼음.
- 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 깨끗한 현미경 슬라이드의 염색 고정 섹션 (최대 세 개의 섹션 / 슬라이드)를 놓습니다. 섹션을 건드리지 않고 여분의 수분을 닦아 설치 매체를 사용하여 섹션을 탑재합니다. 미세한 커버 슬립 커버 및 슬라이드 어두운 방에서 RT O / N에서 건조 할 수 있습니다.
- 4에서 광 증거 슬라이드 수납 박스에 슬라이드를 보관 ° C.
6. Dextramer +의 분석 (두뇌와 심장 섹션 모두에 공통) 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (LSCM)에 의해 (DEXT +) CD4 + T 세포
- 일상적인 검사 및 이미지 수집을 위해 니콘 A1-이클립스 90I 공 초점 현미경 시스템을 사용합니다. 시작하려면 열기, NIS 요소 AR 소프트웨어 (버전 4.13).
- "TRITC"와 패널에서 "Cy5에"채널을 선택합니다. TRITC 및 Cy5의 채널에 대한 각각의 여기 / 발광 파장 561.5 ㎚ / 553-618 nm의 기본적으로 표시 nm의 640.7 ㎚ / 663-738.
- 각각 TRITC (CD4-PE)와 Cy5에 (dextramer-APC) 채널에 대한 pseudocolors "녹색"과 "빨강"을 지정합니다.
- 현미경 단계에 검사 할 슬라이드를 놓고 100 배 배율에서 수동으로 초점을 맞 춥니 다. (110)에 "HV"을 설정하고 "0"으로 오프셋 (offset). "포커스"를 클릭하고 레이저를 최적화하기 위해 "전압"을 조정한다.
- "포커스"를 클릭; 위에서 아래로 섹션을 스캔 및 이미지 획득을위한 'Z'레벨을 설정합니다. "CH 시리즈"를 클릭하여 이미지를 순차적으로 취득. DEXT를 확인 + CD4 + T 세포는 적색 (dextramers)과 녹색 (CD4) 채널 모두에서 생성 된 신호의 공동 현지화를 기반으로 노란색 반점이있는 세포를 게재.
- DEXT + CD4 + T 세포의 쉬운 양적 열거 올림푸스 FV500-BX60 공 초점 현미경을 사용합니다. 시작하려면열기를 클릭, FLUOVIEW 소프트웨어 (버전 4.3).
- 드롭 다운 메뉴에서 염료 "를 Cy3"와 "Cy5에"를 선택하고, 각각의 레이저를로드하려면 "적용"을 클릭합니다. 참고 : Cy3에 대한 여기 / 방출 파장 (543 ㎚ / "녹색"모조 착색, CD4-PE)와 Cy5에 (633 ㎚ / "빨간색"모조 착색, dextramer-APC) 채널을.
- 현미경 슬라이드를 검사 할 슬라이드를 놓고 낮은 배율 (배 또는 10 배)에서 수동으로 초점을 맞 춥니 다. Cy3에 레이저가 켜져있는 동안 "포커스"를 클릭하고, 염증 초점 초점을 맞 춥니 다.
- 100 배의 배율로 목적을 변경합니다. 드롭 다운 메뉴에서를 "512분의 512"파일 크기를 설정합니다. "포커스"를 클릭하고 "PMT", "이익"의 값을 조정하고를 Cy3와 Cy5에 대해 개별적으로 레이저를 최적화하기 위해 매개 변수를 "오프셋".
- "Z 단계"를 클릭하고 레이저가 모두 켜져있는 동안 다음 "포커스"를 클릭합니다. 세트"위로"와 "아래"화살표를 클릭하여 "Z 스테이지"의 두께. 2 μm의 "Z"간격을 설정합니다.
- "중지"를 클릭하고 "Seq123"를 선택합니다. 그런 다음, "XYZ"버튼을 클릭 염증 초점 내에서 선택 영역에 대한 "Z"시리즈의 이미지를 획득 시작합니다. AVI 파일과 "Z 시리얼 이미지"를 저장합니다. 이미지 파일을 저장하려면 "Z 시리얼 이미지"에서 이미지를 선택한 후, "티파니"형식으로 저장합니다.
- 세 부분 중 하나 세트가 IA의 / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 및 IA의 / TMEV 70 ~ 86 dextramers/anti-CD4가 수행하는 세 가지 섹션의 다른 세트로 염색 된 뇌로부터 3 쌍 섹션을 검사 정량 분석.
- 이와 유사하게,하는, 여덟 섹션 중 하나 세트는 IA K / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 다른 자체로 염색 한, 심장 8 개의 쌍으로 섹션을 분석RNA 분해 효소 43-56 dextramers/anti-CD4 여덟 섹션의 t.
- 대뇌 섹션 당 10 ~ 15 염증성 병소를 검사하고, 각 초점, 15 25 시리얼 이미지를 순차적으로 세트를 취득.
- 마음의 8 개의 모든 부분에서 각각의 초점에서 20 염증성 병소의 총 검사는 순차적으로 10 ~ 15 시리얼 이미지를 수집. 같은 초점 내에서 'Z'시리즈의 반복을 피할 수 있도록 '수평 수직 최대 수평 - 수직 아래 운동에 슬라이드를 스캔하여'Z '일련의 이미지를 가져 가라.
- 'Z'연속 영상이 포착되면, 슬라이드 번호, 섹션 이름, 촬영 'Z'직렬 화상의 수를 파악하여 파일의 이름.
- CD4 + T 세포의 총수와 관련 DEXT + CD4 + T 세포를 계산하는 'ImageJ에'소프트웨어를 이용한다. ImageJ에 '의'카운터의 유형 '을 선택, 확인 및# 8216; 모두 표시 '및 각 셀의 중심을 클릭하여 계산을 시작하고 다른 계산에 계속'쪽 화살표를 사용하여 Z '시리얼 이미지. 모든 CD4 T 세포를 계산 한 후, 카운터의 다른 유형을 선택하고 + T 세포 CD4 + DEXT를 계산합니다. 두 개의 서로 다른 카운터로 계산 세포의 총 수를 얻을 수있는 결과 탭을 클릭합니다.
- 총 수를 획득하기 위해 모든 세 대뇌 섹션 또는 모두 팔 심장 섹션을 나타내는 모든 'Z'일련의 이미지 셀의 수를 추가한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 보고서에서, MHC 클래스 II dextramers 직접 염색하여 항원 특이, 반응성 CD4 T 세포의 현장 검출에 설명되어 있습니다. 갓 잘라 뇌 섹션은 EAE 마우스에서 파생 된 (제어) dextramers 및 안티-CD4 (특정) 또는 TMEV 70 ~ 86 PLP 139-151을 포함하는 칵테일을 염색 하였다. 그림 1의 상단 패널은 이중 양성 세포가 노란색 등장 PLP 139-151 dextramers (빨강) 및 CD4 항체 (녹색)로 costained 대뇌 부분의 LSCM 분석을 보여줍니다. 이러한 기능은 TMEV 70 ~ 86 (제어) dextramers (아래 패널)와 스테인드 섹션에 결석했다. costained (DEXT + CD4 +) 세포 둘레 점상 점을 보여 주었다. 대뇌 섹션 PLP 특정 T 세포의 정량 분석은 다음의 단계 (도 2)를 포함 : 1) 3 켤레 섹션은 제하고, 각각의 쌍에서 하나의 부분은 항-CD4와 PLP 139-15 개별적 더러운1 dextramers. 마찬가지로, 세 부분의 또 다른 세트는 안티 - CD4 및 제어 (TMEV 70 ~ 86) dextramers로 염색 하였다. 2) 주어진 섹션에서 염증 초점은 (10 ~ 15) 안티 - CD4 염색을 기준으로 확인되었다. 3) 'Z'시리얼 이미지 (15 25)의 세트는 각각의 사이에 2 μm의 간격으로 위에서 아래로 각 초점 순차적에서 촬영했다. 본질적으로, 염증성 병소의 동일한 수를 나타내는 'Z'시리얼 이미지의 10 ~ 15과 비슷한 세트는 모든 부분에서 분석 하였다. 4) 개별 이미지에서, CD4 + 세포 (녹색), 두 dextramers (빨강) 및 CD4으로 노란색 반점이있는 세포가 마지막으로 오픈 소스 소프트웨어, ImageJ에를 사용하여 개별적으로 표시하여 열거하고 있었다 나타났다 (녹색)에 대한 긍정적 인 세포, 총합계는 모두 'Z'직렬 이미지 꼽히고 셀의 개수를 추가하여 각 섹션에 대해 얻었다. 있는 여러 이미지의 셀을 열거의 세포가 표시된 것을, 가능성 때문에중복이 제거되었다. 따라서, CD4를 발현하는 세포의 총 수를 기준 DEXT + 세포의 안정적인 열거이 달성 될 수있다.
이 연구는 또한 상기 T 세포 - 매개 질환이다 13,14 A / J 마우스에 Myhc 334-352로 유도 EAM에서 반응계에서 항원 감작 T 세포를 검출하기위한 dextramer 시약의 사용을 보여주기 위해 확장되었다. 여덟 쌍 심장 섹션 EAM 마우스 (그림 2)에서 각 200 ㎛ 두께를 얻었다. 섹션 (총 8)의 또 다른 세트의 RNase 43-56 dextramers (제어) 및 안티 염색 된 반면, 각 쌍에서, (8 섹션의 총) 한 부분은, Myhc 334-352 dextramers 및 안티 CD4로 염색했다 - CD4. 모두 여덟 섹션을 대표하는 많은 염증 초점에 해당하는 'Z'시리얼 이미지의 스물 세트는 순차적으로 위의 (그림 2) 취득 하였다. 본질적으로, 'Z'직렬 IM 주어진 일련나이는 하나의 염증 초점을 표현 10 ~ 15 개인으로 구성되었다. LSCM 이러한 이미지를 분석 Myhc 334-352 dextramers (빨간색)에 대한 긍정적 인 세포의 존재를 보였으며, CD4 (녹색) 및 예상대로, dextramers 및 CD4 모두 결합 된 세포는 (그림 3, 상단 패널)와 같은 노란색 반점이있는 세포를 등장 . 제어 dextramers의 배경 염색 (그림 3, 하단 패널) 무시했다. DEXT + CD4 + T 세포의 총 수 및 CD4 + T 세포의 총수가 모든 섹션에서 각 섹션과 카운트에 대해 결정 하였다는 각 서브 세트 (DEXT + CD4 + T 세포에 대한 총 수를 도출하기 위해 함께 첨가 하였다; CD4 + T 세포).
그림 1. 현장에 의해 PLP 특정 CD4 T 세포의 검출 룽>. EAE는 CFA에 PLP 139-151과 동물을 면역에 의해 SJL 마우스에 PLP 139-151 dextramers와 염색을 유도했다. 종단에서 EAE 쥐로부터 수집 대뇌 아가 로스 4 %에 포함시키고, vibratome 섹션을 사용하여 제조 하였다. PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 또는 TMEV 70 ~ 86 dextramers (제어) / 안티 - CD4 4 % PBS 버퍼 파라 포름 알데히드로 고정 하나를 포함하는 칵테일로 염색 한 후, 섹션은 세척 및 LSCM 검진 장착. 상단 패널 : PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 염색을 두 개의 별도의 섹션. 하단 패널 : TMEV 70 ~ 86 dextramers/anti-CD4 염색을 두 개의 별도의 섹션. 왼쪽 패널 : CD4, 녹색; 가운데 패널 : dextramers, 빨강; 오른쪽 패널 : (화살표, DEXT + CD4 + T 세포)를 합병했다. 기존 배율 1,000 X (채택했다.. 주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers와 Massilamany 등 2014 년 직접 염색은 항원 특이, 반응성 CD4 T 세포의 탐지를 허용. 제자리 PLOS ONE 9의 (1). e87519) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(패널 1)과 같이 그림 2. 뇌와 마음에 DEXT + 세포를 정량하는 방법. 페어링 섹션은 뇌 또는 귓바퀴 - 절제의 마음에서 만들어집니다. 지정된 기관에 해당하는 각각의 쌍에서 한 섹션은 특정 dextramers (뇌, PLP 139-151 dextramers, 심장, Myhc 334-352 dextramers)로 염색에 지정하고, 제어 dextramers에 대한 섹션의 다른 세트 (뇌, TMEV 70 - 86, 심장, RNA 분해 효소 43-56). 고정 및 장착 후, 섹션 LSCM에 의해 CD4로 염색을 기준으로 염증 초점 (원래 잡지를 찾기 위해 조사 하였다nification, 40X) (패널 2). 3 차원 (3D)보기 (패널 3) 시각화 각 염증 초점은 'Z'시리얼 이미지를 순차적으로 (패널 4)의 세트로 하였다. 모든 이미지에서 단독으로 특정 또는 제어 dextramers 및 CD4, 또는 CD4 모두 양성 세포가 채택 'ImageJ에'소프트웨어 (사용하여 계산 하였다 :.. Massilamany 등을 2014 년 주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers와 직접 염색 항원 검출을 허용합니다 특정, 제자리 PLOS ONE 9 반응성 CD4 T 세포 (1) :.. e87519) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
현장에 의해 심장 마이 오신 특정 CD4 T 세포의 그림 3. 검출
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MHC 클래스 I 테트라와는 달리, 일상적인 응용 프로그램의 MHC 클래스 II 테트라의 사용은 특히 자신의 활성화 종속성 6,15-17에 부분적으로 인해 낮은 친화력자가 반응 CD4 T 세포의 전구체 주파수를 열거하는 도전되고 있습니다. 최근에,이 문제는 이러한 PLP 139-151, MOG 35-55과 Myhc 334으로자가 항원의 수를 항원 특이 CD4 T 세포를 감지하는 우리를 허용 ", dextramers"라고 사량의 다음 세대를 만들어 피할 수있었습니다 - (352) 8. 이 보고서에서, 처음으로, 현장에서자가 반응 CD4 T 세포를 감지하고 정량화하는 MHC 클래스 II dextramers의 유틸리티는 EAE 마우스에서 뇌 섹션 및 EAM 쥐에서 심장 섹션을 사용하여 증명되었다. 반응 기초 dextramers는 MHC / 펩티드 복합체의 양이 적은 이점을 제공한다. 이 프로토콜에서는, 각 반응은 0.75 μg MHC / 펩타이드 단량체가 필요합니다. 또한, 역에서dextramers 함께 ining는 dextramers는 반대로 CD4 coincubated로되어 있기 때문에, 한 단계의 반응이며, 전체 절차는, 조직 염색에 구획에서, 일 미만으로 완성 될 수있다. 대조적으로, 종래의 테트라 머와 동일계 염색에 대해 발행 프로토콜은 일반적으로 형광 신호는 형광 물질에 대한 이차 항체를 사용하여 증폭되는 증폭 절차를 포함한다. 그 결과, 염색 절차는 18 ~ 20를 완료하는 데 최대 3 일이 걸릴 수 있습니다.
또한, 대뇌 섹션 dextramers의 사용은 심지어 50 ㎛까지, 조직 절편에서 깊고 항원 특이적인 T 세포의 검출을 허용한다. 그것은 PLP 139-151 DEXT + CD4 + 세포가 모두 perivascularly 또한 실질 내에 위치한 것으로 밝혀졌다 지적 하였다. 뇌 초에서 PLP 139-151 dextramers과 비교했을 때 또한, Myhc 334-352 dextramers에서 생성 된 신호의 강도는 심장 섹션에서 낮았다tions (그림 1), 이러한 변화는 각 기관 고유의 특성을 반영 할 수있다. 하나의 이러한 변수는 잠재적으로 염증 초점 dextramers 락의 확산을 제한 할 수 주로 횡문근 섬유가 들어 심장 조직 반대로 뇌 조직에 다량으로 존재하는 지질 함량이다. 이 개념의 지원에서, Myhc 334-352 DEXT + 세포는 심장 부분의 대부분에서 20 μm의 깊이까지로 검출되었다. 또한, Myhc 334-352 DEXT + 세포는 모든 myocarditic 병변의 염증 침윤의 확산 특성을 제안 심근 흩어져 존재했다.
일반적으로 두 개의 주요 요인에 부정적인 LSCM 의해 반응계에서 항원 특이적인 T 세포의 검출에 영향을 미칠 수있다. 우선, 형광체에 의해 방출되는 신호는 불충분 형광 항체를 이용하여 신호를 증폭 할 필요성을 초래할 수있다. 둘째, 간접 스며제어 시약의 배경 염색도 비례 적으로 증가 할 수있다 (18, 19)로 ING는 특이성을 훼손 할 수 있습니다. 이러한 제한은 dextramers 직접 염색으로 우회했다. CD4 T 세포의 검출이 성공적으로 신선한 섹션으로 표시되었습니다,하지만, 냉동 조직에 dextramer 시약의 사용으로 인해 조직이 얻을 수의 경향 어려울 수 있습니다 조직의 무결성을 유지 등의 도전이 될 수있는 추가 연구가 필요 다양한 염색시 분해는 18, 19 단계를 반복합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않았습니다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회와 어린이의 심장 근육 병증 재단 (SDG2462390204001)과 국립 보건원 (HL114669)에 의해 지원되었다. CM은 심근염 재단, NJ에 의해 수여 박사 학위 취득 후 연구 활동 보조금의 수상자이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4 °C |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4 °C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4 °C |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4 °C |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 °C |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4 °C |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4 °C | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
- Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
- Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
- Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
- Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
- Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
- Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
- Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
- Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
- Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
- Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
- Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
- Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
- Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).
