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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

Published: August 1, 2014 doi: 10.3791/51679
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 2, 1
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

Summary

主要組織適合性複合体クラスII dextramersとの直接染色により脳及び心臓における自己反応性CD4 T細胞を検出するためのプロトコルは、このレポートに記載されている。総合的な分析のために、 その場での抗原特異的CD4 + T細胞の頻度を列挙するための信頼できる方法も考案されている。

Introduction

抗原特異的CD4 T細胞の検出のための主要組織適合性複合体（MHC）クラスII四量体を使用することは挑戦であった1-7。 MHCクラスII四量体の検出感度を高めるために、研究チームは、次世代のテトラマー、指定された「dextramers「8を作成した。 Dextramersは、複数のストレプトアビジン-フルオロフォア部分は、いくつかのペプチドテザー、ビオチン化MHCモノマー一つデキストラン分子9に取り付けることができるようにコンジュゲートしたデキストラン骨格を含有する。このように、いくつかのMHC-ペプチド複合体が含まれているのMHC dextramersの大きな集合体は、複数のT細胞受容体（TCR）と対話することができます。

このグループは、最近、様々な自己抗原に対するdextramersを生成し、dextramersの検出感度は、約8四量よりも5倍であることを示した。実験システムは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAを含むE）、プロテオリピドタンパク質（PLP）SJLマウスにおける139-151で誘導し; C57BL / 6マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）35-55を用いて誘導EAE;心臓ミオシン重鎖α（MyHCの）A / Jマウスにおける334から352で誘導し、実験的自己免疫性心筋炎（EAM）。この研究は、PLP 139-151の使用を示す- 、それによってフルオロフォア抗体を用いからの信号を増幅する必要がなくなり、直接染色プロトコルを開発することにより、特異性を有するその場で抗原特異的CD4 T細胞を検出するためのMyHCの334から352 dextramers、アプローチは、一般的に四量体の使用に採用。また、組織を包括的に評価する方法はまた、確実にその場 10 における抗原特異的CD4 T細胞の頻度を列挙するために考案されている。 その場での抗原特異的T細胞の検出は、バイスタンダー活性化によって引き起こされるものから、特定の抗原刺激によって引き起こされる事象の描写を可能にする。同様に、 その場での技術ではまた、提供します：標的器官における抗原特異的T細胞の浸潤の動態を追跡する機会エス。

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Protocol

倫理声明：

全ての動物手順は、実験動物の管理と使用に関するガイドラインに沿って行われ、ネブラスカ大学リンカーン、リンカーン、ネブラスカ大学によって承認された。

EAEの1。誘導

  1. 工程1.1：EAEを誘導するために、以下の改変を伴う11に記載のようにペプチド/完全フロイントアジュバント（CFA）エマルジ ​​ョンを調製する。1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中1 mg / mlの濃度でPLP 139-151を調製するステップ1.4：動物1匹当たりのPLP 139-151100μgのを含むCFA乳化液200μlを使用する1.4.1ステップ ：10動物を免疫するために、PLP 139-151の1ミリリットル1Xにおける（1 mg / mlのを混合することにより、エマルジ ​​ョンの2ミリリットルを用意。PBS）とCFAを等量の1.5ステップ ：2鼠径領域（〜75μLずつ）と5対6週齢の胸骨領域（〜50μL）に皮下分割用量でエマルジ ​​ョン200μlのを注入FEMAルSJL / Jマウス。 1.7と1.8は、EAEの誘導には適用されません繰り返します。

EAEマウスと大脳の収穫の2。臨床スコアリング

  1. 臨床徴候の出現のために動物を監視し、次のように9日目免疫後から毎日疾患の重症度をスコア：0 - 健康的な; 1 - 尾または後肢の脱力両方ではなくぐったり。 2 - 尾と後肢の脱力ぐったり。 3 - 後肢の部分的な麻痺; 4 - 後肢の完全な麻痺; 5 -瀕死または死んだ12。
  2. それらはCO 2を用いて、3又は4の神経学的スコアに達したときにマウスを安楽死させる。マウスを安楽死させるべきではない6 PSIを超えるCO 2タンクのレギュレーターを回すことで、CO 2を最初に安楽死室を事前に記入し、動物が完全に窒息を達成するために約5分間、チャンバ内に滞在することができます。 70％アルコールで安楽死させた動物を浸す。すぐに、吸収パッド上に動物を配置し、無菌のペアを使用してCEPSとハサミは胸腔を通して切断することによって心を公開します。右心耳を穿刺し、心の左心室に冷たい1×PBSを10ミリリットルを注入することにより灌流。
  3. 湾曲したハサミを使用して循環的に頭蓋骨を切り取ることで頭蓋骨を掘削し、慎重に、鉗子で頭蓋骨を反転。鈍的切開によって脳を収穫し、小脳からのきれいなメスで、別々の大脳を使用。冷たい1X PBSを含む試験管に大脳を配置して処理するまで氷上にチューブを残す。

3。MHCクラスII（IA S）/ PLP 139-151 Dextramersと脳切片のその場染色

  1. 50°Cに加熱して溶融し、使用するまで40℃の水浴に入れたまま、4％PBS緩衝低融点アガロースを調製する。
  2. 使い捨ての深いベースモールドの組織学カセットに大脳を置き氷の上に保たれ、溶融した（40℃）、アガロースを注ぐ。すぐに、優しく大脳を押してください鉗子は、組織を沈めるようにして。凝固が完了するまで15〜20分間、氷上でのカセットのままにしておきます。
  3. チルド1X PBSでビブラトーム槽を埋める。 0と2の間のPBSの温度を維持するために氷浴でビブラトームの周りの空間を充填 ℃、ビブラにきれいなカミソリの刃を固定し、15℃にブレード角度を設定。
  4. ビブラトーム内の組織の配置。包埋組織のすべての側面からの過剰なアガロースをトリミングして、わずかに大脳の腹側表面を露出。
    1. スーパー接着剤でビブラ組織ブロックを塗抹し、横方向切片化のための接着剤を介して大脳の露出腹面を配置することにより、接着表面にアガロース包埋組織を移す。組織がブロックの上に設定されると、組織を移動しないでください。
    2. 氷上アガロース包埋組織を含むビブラトームブロックを置き、接着剤が15分間乾燥させます。
  5. 一方、組織を配置チャム24ウェルプレートのウェルごとに1つのBER。冷たい1X 1mlのPBSで組織チャンバーを含むウェルを記入し、氷の上にプレートを残す。
    1. 薄いナイロンスーパー接着剤を用いて、25 mlのポリプロピレンピペットのカット最後にメッシュを取り付けることにより、組織の室を準備し;ピペットの周りに余分なメッシュをトリミングした後、メッシュから1cmの長さにピペットを切る。
  6. 組織の上面のレベルまでビブラトームブレードを低下; 0.22ミリメートル/秒にビブラトーム速度を設定し、200μmの厚さの切片を作るために前進して切片を開始。 24ウェルプレートのウェル内に配置された組織室内に水彩柔らかいブラシを使用してごとに1つの脳のセクションを転送します。切片は、組織の劣化を防止するために、完了するまで氷上にプレートを保管してください。注意：腹面に脳の背側の3種々の領域（ 図2）から、合計、3ペアのセクションで入手する手順は、次のとおりです。から1つのセクション3個々の組織チャンバー内に配置、各ペア（計3つのセクション）は、特定のdextramers（IA S / PLP 139-151）および抗CD4で染色するために指定されています。同様に、3つの個別の組織チャンバ内に配置された3つのセクションの別のセットは、制御dextramers（IA 秒 / TMEV 70-86）および抗CD4で染色するために指定されている。
  7. 、中のウェルあたり1室と24ウェルプレートの3ウェルに特定dextramersで染色するための指定区間を含む3組織チャンバーを転送コシアニンを含むカクテルを300μl（APC）結合PLP 139-151 dextramers（2.5 μg/ ml）を、および抗CD4-フィコエリトリン（PE、2％正常ヤギ血清、5μg/ ml）をブロッキング溶液中で（1×PBS）を予め加えた。ウェルに蓋をして。
  8. 同様に、我々ごとに1つのチャンバーを24ウェルプレート中の3つのウェルに制御dextramersでの染色のために指定されたセクションを含む3つの組織チャンバーを転送するLLここで、APC結合TMEV 70から86 dextramers（2.5μg/ ml）をし、ブロッキング溶液中の抗CD4-PE（5μg/ mlの）を含むカクテル300μlのは、以前に追加されました。ウェルに蓋をして。注：。、Massilamanyらを参照してくださいdextramersの製造のための8、およびdextramersを準備するデキストラン分子が親切にImmudex、コペンハーゲン、デンマークから提供された。
  9. 井戸にラベルを付けて、アルミホイルでプレートをラップし、室温で暗所に1.5時間、穏やかな回転に設定ロッキングプラットフォーム上でプレートを置き。
  10. インキュベーション期間の後、ウェルの冷1×PBS 1 mlを含む新鮮な、組織チャンバを転送することによって、ロッキングプラットフォーム上で組織切片を洗浄し、そして他に一方の内容をドリブル避ける。洗浄あたり少なくとも10分を許可する、三度洗濯を繰り返してください。彼らは、チャンバの側面に固執することができますように組織切片を乾燥されないように確認してください。
  11. 組織チャムを転送することにより、セクションを修正穏やかな回転に2時間ロッキングプラットフォーム上で濾過4％のPBS-緩衝パラホルムアルデヒド液（pH7.4）の1ミリリットルを含む24ウェルプレート内の新鮮なウェルにBERが。
  12. ステップ3.10で説明したように三度の洗浄を繰り返します。
  13. 水彩柔らかいブラシを使用して清潔な顕微鏡スライドガラスに染色し、固定部を配置します。セクションに触れることなく余分な水分を拭いて、封入剤を使用してセクションをマウントします。微細なカバーガラスで覆い、スライドを暗い部屋でのRTのO / Nで乾燥させます。
  14. 4℃で、遮光性のスライド収納ボックス内のスライドを保存する

EAMと心のコレクション4。誘導

  1. 参照文献11に記載されるようにEAMを誘導する。
  2. CO 2ガスボンベを取り付けた清浄室を使用して、免疫後21日目にマウスを安楽死させると、70％アルコールで動物を浸す。すぐに、吸収パッド上で動物を配置し、鉗子やハサミを使用して心臓を露出胸腔を切断することによってS。右心耳を穿刺し、心の左心室に冷たい1×PBSを10ミリリットルを注入することにより灌流。冷たい1X PBSを含む試験管内の心と場所を収集します。

5。MHCクラスII（IA K）/ MyHCの334から352 Dextramersと心臓切片のその場染色

  1. 準備4％低融点アガロース、50℃に加熱して溶融し、40でそれを残して、PBS緩衝化 使用するまで、Cの水浴を°。
  2. 使い捨ての深いベースモールドの組織学カセットに心を置き、氷上に維持し、ステップ3.2で説明したように、組織が完全に水没するまで溶融40℃でアガロースを注ぐ。
  3. ステップ3.3に従ってください。
  4. 包埋組織のすべての側面からの過剰なアガロースをトリミングして、わずかに心の底を公開します。スーパー接着剤でビブラ組織ブロックを塗抹しの露出面を配置することにより、接着表面上アガロース包埋組織を転送のりの上の心。組織がブロックの上に設定されると、組織を移動しないでください。
    1. 氷上アガロース包埋組織を含むビブラトームブロックを置き、接着剤が15分間乾燥させます。
  5. ステップ3.5および3.6に従ってください。
  6. 24ウェルプレートのウェル内に配置された組織チャンバー内に水彩柔らかいブラシを使用して、心臓切片を転送する。切片は、組織の劣化を防ぐために完了するまで氷上にプレートを保管してください。注：心の底（ 図2）に頂点から合計8ペアのセクションで入手する手順は、次のとおりです。室あたりの3の項までの割り当て、組織チャンバー内のすべてのセクションを配置します。 （合計8つのセクション内の）各ペアから1つのセクションは、特定のdextramers（I-A K / MyHCの334から352）および抗CD4で染色するために指定されている。同様に、8つのセクションの別のセットは、制御dextramers（IA k個 / RNアーゼ43-56）および抗CD4で染色するために指定される。
  7. 転送中のウェルあたり1室で、24ウェルプレートの3ウェルに特定dextramersで染色するための指定区間を含む3組織チャンバー、APC結合MyHCの334から352 dextramers（2.5μg/ mlの）を含むカクテルを300μlとブロッキング溶液中の抗CD4-PE（5μg/ mlの）を予め加えた。ウェルに蓋をして。
    1. 同様に、1ウェルあたり1室、APC結合アーゼを43-56 dextramers（2.5μgのを含むカクテル300μlで24ウェルプレートの3ウェルに制御dextramersでの染色のために指定セクションを含む3組織チャンバーを転送/ ml）および抗CD4-PE（5μg/ ml）をブロッキング溶液中に予め添加した。ウェルに蓋をして。
  8. 井戸にラベルを付けて、アルミホイルでプレートをラップし、室温で暗所に1.5時間、穏やかな回転に設定ロッキングプラットフォーム上でプレートを置き。
  9. 3.10から3.11、手順に従ってください
  10. 繰り返し洗濯THRステップ3.10で説明したように氷。
  11. 水彩柔らかいブラシを使用して清潔な顕微鏡スライドガラスに染色し、固定部（最大3つのセクション/スライド）を配置します。のセクションに触れることなく余分な水分を拭いて、封入剤を使用してセクションをマウントします。微細なカバーガラスで覆い、スライドを暗い部屋でのRTのO / Nで乾燥させます。
  12. 4で光防スライド収納ボックスでスライドを保存する ℃、

6。Dextramer +の解析（脳と心臓切片の両方に共通）レーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）によって（DEXT +）CD4 + T細胞

  1. ルーチンスキャンおよび画像の取得のためのニコンA1〜エクリプス90I共焦点顕微鏡システムを使用してください。開始するには、オープン、NISの要素ARソフトウェア（バージョン4.13）をクリックします。
    1. 「TRITC」パネルから「Cy5の「チャンネルを選択してください。 TRITCおよびCy5のチャネルのそれぞれの励起/発光波長、561.5ナノメートル/ 553から618 nmおよび640.7 nmの/ 663から738 nmのデフォルトで表示されます。
    2. それぞれ、TRITC（CD4-PE）のための「緑」と「赤」擬似カラーおよびCy5（dextramer-APC）チャネルを割り当てる。
    3. 微視的ステージに検査されるスライドを置き、100倍の倍率で、手動で焦点を当てています。 110に「HV」に設定し、「0」へのオフセット。 「フォーカス」をクリックして、レーザーを最適化するために、「電圧」を調整してください。
    4. 「フォーカス」をクリックします。上から下にセクションをスキャンし、画像取得のための 'Z'レベルを設定します。 「CHシリーズ」をクリックし、画像を順次取得する。 DEXTを識別+ CD4 + T細胞は、赤色（dextramers）および緑色（CD4）チャネルの両方から発生するシグナルの共局在化に基づいて、黄色斑点状細胞に現れる。
  2. DEXT + CD4 + T細胞の容易な定量的な計数のためにオリンパスFV500-BX60共焦点顕微鏡を使用してください。開始するにはオープンをクリックし、FLUOVIEWソフトウェア（バージョン4.3）。
    1. ドロップダウンメニューから染料」のCy3」と「Cy5の」を選択し、各レーザをロードするために、「適用」をクリックします。 （543ナノメートル/疑似カラー「グリーン」、CD4-PE）のCy3の励起/発光波長およびCy5（633 NM /疑似カラー "赤"; dextramer-APC）チャンネル：注意してください。
    2. 顕微鏡スライドガラス上で検査されるスライドを置き、低倍率（4倍または10倍）の下で、手動で焦点を当てています。 Cy3のレーザーがオンになっている間は「フォーカス」をクリックして、炎症フォーカスを当てる。
    3. 100X倍率に目標を変更します。ドロップダウンメニューから「512分の512」に、ファイルサイズを設定します。 「フォーカス」をクリックして、「PMT」、「ゲイン」の値を調整し、Cy3およびCy5で別々にレーザーを最適化するためのパラメータを「オフセット」。
    4. 「Zステージ」をクリックして、レーザーの両方がオンになっている間「フォーカス」をクリックしてください。セット「アップ」および「ダウン」矢印をクリックして、「Zステージ」の厚さ。 2μmの「Z」の間隔を設定します。
    5. 「停止」をクリックし、「Seq123 "を選択します。その後、「XYZ」をクリックして、炎症焦点内の選択されたエリアに対して「Z」シリーズの画像の取得を開始。 AVIファイルなどの「Z連続画像」を保存します。画像ファイルを保存する「Zシリアル画像」から画像を選択して、「TIFF」形式として保存します。
  3. 三つのセクションの1セットが実行するために、IA S / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4およびIA S / TMEV 70から86 dextramers/anti-CD4と3節で、他の組で染色した大脳から3ペアのセクションを調べて、定量分析。
    1. 同様に、ここで、8つのセクションの1セットは、IA K / MyHCの334から352 dextramers/anti-CD4し、別のSEで染色し、心臓に8ペアのセクションを分析アーゼ43-56 dextramers/anti-CD4と8つのセクションのトン。
  4. 大脳内のセクションごとに10から15の炎症性病巣を調べ、それぞれの焦点で、15から25連続画像を順次セットを取得する。
    1. 心のすべての8つのセクションから、各焦点から20の炎症性病巣の合計を調べるには、順次10から15連続画像を取得する。同じ焦点内「Z」シリーズの繰り返しが回避されるように、「水平 - 垂直アップ水平 - 垂直ダウン」の動きでスライドをスキャンすることによって、「Z」のシリアル画像を撮影する。
    2. 「Z」のシリアル画像が取り込まれると、スライド番号、セクション名、および撮影「Z」のシリアル画像の数を特定することにより、ファイルに名前を付けます。
      1. CD4 + T細胞の総数に対するDEXT + CD4 + T細胞を計数する「ImageJの「ソフトウェアを使用。 ImageJの「中」のカウンタの種類」を選択し、確認してください＆＃8216;すべてを表示」し、各セルの中心をクリックして、カウントを開始し、別の中で数え続ける '側の矢印を使用して、Z'連続画像。すべてのCD4 T細胞をカウントした後、カウンターの別のタイプを選択し、+ T細胞、CD4 + DEXTを数える。 2異なるカウンタで計数した細胞の総数を取得するには、[結果]タブをクリックします。
      2. 合計数を取得するには、3つすべての脳のセクション、またはすべての8心臓切片を表すすべての「Z」のシリアル画像内のセルの数を追加します。

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Representative Results

本報告書では、MHCクラスII dextramersとの直接染色による抗原特異的、自己反応性CD4 T細胞のin situ検出に記述されている。新たに切断した脳のセクションでは、EAEマウス由来し、PLP 139-151（特定）またはTMEV 70から86（コントロール）dextramersおよび抗CD4を含むカクテルで染色した。 図1のトップパネルは、二重陽性細胞が出現し、黄色のPLP 139-151 dextramers（赤）とCD4抗体（緑）で同時染色脳切片のLSCM分析を示す。このような特徴はTMEV 70から86（コントロール）dextramers（下パネル）で染色した切片には存在しなかった。共染色（DEXT + CD4 +）細胞が周囲に点状のドットを示した。脳切片におけるPLP特異的T細胞の定量分析は、以下のステップ（ 図2）関与する：1）三組の切片を作製し、各対からの1つのセクションは、抗CD4およびPLP 139から15で個別に染色した1 dextramers。同様に、三つのセクションの別のセットは、抗CD4および対照（TMEV 70-86）dextramersで染色した。 2）所与のセクションから、炎症性病巣（10〜15）、抗CD4染色に基づいて同定した。 3） 'Z'のシリアルの画像（15〜25）のセットは、各々の間2μmの間隔で上から下へ順番に各焦点から採取した。本質的には、炎症性病巣の等しい数を示す 'Z'のシリアルの画像10〜15と同様のセットは、各セクションで分析した。 4）個々の画像、CD4 +細胞（緑）、黄色の点状細胞は最終的にはImageJ、個々にオープンソースソフトウェアを使用してそれらをマークすることによって、列挙され、あったように見えたの両方dextramers（赤）陽性の細胞およびCD4（緑）には、総計は、すべての 'Z'連続画像で計数した細胞の数を加えることにより、各セクションが得られた。細胞をマークしたことが理由であり、複数の画像中の細胞を再集計の可能性重複を排除した。このように、CD4を発現する細胞の総数に対するDEXT +細胞の信頼性の高い列挙を達成することができる。

この研究は、さらにまた、T細胞媒介性疾患である13,14、A / JマウスにおいてMyHCの334から352で誘導されEAM中でその場で抗原感作T細胞を検出するためのdextramer試薬の使用を実証するために拡張された。八ペア心臓切片は、EAMマウス（ 図2）から、各厚さ200μm、得られた。のセクション（合計8）の別のセットをアーゼ43-56 dextramers（コントロール）および抗染色したのに対し、それぞれのペアから、（8セクションの合計で）1セクションは、MyHCの334から352 dextramersおよび抗CD4で染色した-CD4。すべての8つのセクションを代表する多くの炎症性病巣に対応する「Z」のシリアル画像の二十組を上記のようにします（ 図2）を順次取得した。基本的に、「Z」のシリアルIMの与えられたセット年齢は一つの炎症性の病巣を表し、10〜15個体からなる。 LSCMによるこれらの画像の分析では、MyHCの334から352 dextramers（赤）陽性細胞の存在を示し、およびCD4（緑）、予想通り、dextramersおよびCD4の両方で結合した細胞は、黄色の点状細胞（ 図3、上パネル）として登場。制御dextramersの背景染色は（ 図3、下パネル）ごくわずかであった。 DEXT + CD4 + T細胞の合計数及びCD4 + T細胞の総数は全てのセクションの各セクションをカウントについて測定し、各サブセット（DEXT + CD4 + T細胞の合計数を導出するために一緒に加えた。CD4 + T細胞）。

図1
図1。 その場でのことで、PLP特異的CD4 T細胞の検出 PLP 139-151 dextramersで染色 >栄。EAEは、CFA中のPLP 139-151で動物を免疫することにより、SJLマウスに誘導した。終了時に、EAEマウスから採取し大脳を、4％アガロースに包埋し、切片をビブラトームを用いて行った。 PLP 139-151 dextramers/anti-CD4またはTMEVのいずれかを含むカクテル70から86 dextramers（コントロール）/抗CD4で染色し、4％のPBS緩衝化ホルムアルデヒドで固定した後、切片を洗浄し、LSCMによる検査のために取り付けられた。上のパネル：PLP 139-151 dextramers/anti-CD4で染色した2つのセクション。下のパネル：TMEV 70から86 dextramers/anti-CD4で染色した2つのセクション。左のパネル：CD4、緑;中央のパネル：dextramers、赤;右のパネル：（矢印、DEXT + CD4 + T細胞）を吸収合併。オリジナルの倍率1,000倍（採択：主要組織適合性複合体クラスII DextramersとMassilamany ら 、2014年の直接染色は、抗原特異的自己反応性CD4 T細胞の検出を可能にするその場でのワンPLoS 9（1）：e87519） この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2
（パネル1）に示すように、 図2の脳と心の中でDEXT +細胞を定量する手法。ペアのセクションは、大脳や耳介摘出した心臓から作られています。示された臓器に対応する各ペアから1つのセクションは、特定のdextramers（大脳、PLP 139-151 dextramers、心臓、MyHCの334から352 dextramers）での染色のために指定され、制御dextramersのためのセクションの他のセット（大脳、TMEV 70 - 86、心臓、アーゼ43-56）。固定と取付後、切片をLSCMで、CD4での染色に基づく炎症病巣を見つけるために調査した（元の等級nification、40X）（パネル2）。三次元（3D）ビュー（パネル3）で視覚化されるように、各炎症フォーカスが順次 'Z'のシリアルの画像（パネル4）のセットを行った。すべての画像では、単独の特定や制御dextramersおよびCD4、またはCD4両方に陽性細胞が採用さ'をImageJのソフトウェア（使用してカウントした：Massilamanyら 、2014主要組織適合性複合体クラスII Dextramersとの直接染色抗原の検出を可能にするその場で特定の、自己反応性CD4 T細胞PLOS ONE 9（1）：e87519） この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図3
図3。 その場でのことで心臓ミオシン特異的CD4 T細胞の検出 + CD4 + ：。Massilamanyら 、2014年の主要組織適合遺伝子複合体クラスとの直接染色II Dextramers その場で抗原特異的自己反応性CD4 T細胞の検出を可能にするワンPLoS 9（1）：e87519）。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。

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Discussion

MHCクラスIテトラマーとは違って、日常的なアプリケーションのためのMHCクラスII四量体の使用は、特にそれらの活性化の依存関係6,15-17に一部起因低親和性自己反応性CD4 T細胞の前駆体頻度を列挙するために、挑戦的であり続けている。最近では、この問題は、PLP 139-151、MOG 35〜55およびMyHCの334などの自己抗原の数の抗原特異的CD4 T細胞を検出するために、私達を許可する」、dextramers」と呼ばれる、四量体の次の世代を作成することによって回避されました - 352 8。本報告では、初めて、 その場で自己反応性CD4 T細胞を検出及び定量するためのMHCクラスII dextramersの有用性は、EAEマウス由来の脳切片、及びEAMマウスからの心臓切片を用いて実証されている。反応に基づいて、dextramersはMHC /ペプチド複合体の少量を必要とするという利点を提供する。このプロトコルでは、各反応は、0.75μgのMHC /ペプチドモノマーのを必要とする。また、STAdextramersとiningはdextramers抗CD4と共インキュベートされているので、一段階反応であり、全体の手順は、組織染色切片から、日未満で終了することができる。対照的に、従来の四量体を用いたin situ染色のために公開されたプロトコルは、一般的に蛍光シグナルを蛍光団のための二次抗体を用いて増幅された増幅手順を伴う。その結果、染色手順は、18〜20を完了するために3日かかることがあります。

さらに、脳切片におけるdextramersの使用は、さらには50​​ミクロンまでの、組織切片における深い抗原特異的T細胞の検出を可能にする。これは、PLP 139-151 DEXT + CD4 +細胞が血管周囲の両方とも実質内に配置されることが見出されたことが注目された。脳秒でのPLP 139-151 dextramersと比較した場合、さらに、MyHCの334から352 dextramersから生成された信号の強度は、心のセクションで低かったtions（ 図1）、このような変化は、各臓器への固有の特性を反映し得る。一つのそのような変数は、潜在的に炎症に焦点dextramers容易に拡散するのを制限することができ、主に横紋筋線維を含有する心臓組織とは対照的に、脳組織において高量で存在する脂質含量である。この概念を支 ​​持するものとして、MyHCの334から352 DEXT +細胞のみを心臓のセクションの大部分において20μmで、深さは最大検出された。さらに、MyHCの334から352 DEXT +細胞は、すべての心筋炎の病変における炎症性浸潤の拡散性を示唆して心筋に点在存在していた。

一般に、2つの主要な要因は、負にLSCMによってその場で抗原特異的T細胞の検出に影響を与えることができる。まず、フルオロフォアによって放出された不十分な信号は、蛍光団抗体を用いて信号を増幅する必要性をもたらすことができる。第二に、このような間接的なシミコントロール試薬のためのバックグラウンド染色にも比例して18,19増やすことができますようにINGは、特異性を弱体化させることができます。これらの制限は、dextramersとの直接染色することによって回避された。 CD4 T細胞の検出に成功し、新鮮なセクションが示されている、が、凍結された組織におけるdextramer試薬の使用は、組織の完全性の保持が原因で組織を取得するために傾向が困難な場合があるように挑戦することができ、追加の研究が必要です種々の染色が18,19のステップの間に崩壊した。

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Disclosures

利害の競合が宣言されなかった。

Acknowledgments

この作品は、アメリカ心臓協会と子供の心筋症財団（SDG2462390204001）、および国立衛生研究所（HL114669）によってサポートされていました。 CMは心筋炎財団、ニュージャージー州によって授与ポスドク研究フェローシップ助成金の受取人である。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

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References

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免疫学、発行90、dextramers; MHCクラスII;
主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞の<em>その場</em>検出<em>に</em>
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Massilamany, C., Gangaplara, A.,… More

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

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