Summary
Is beschreven het protocol tot zelf-reactieve CD4 T-cellen te detecteren in de hersenen en het hart door directe kleuring met hoofdhistocompatibiliteitscomplex klasse II dextramers in dit rapport. Voor uitgebreide analyse is een betrouwbare methode om de frequentie van antigeen-specifieke CD4 + T-cellen in situ sommen ook ontwikkeld.
Introduction
Gebruik van major histocompatibility complex (MHC) klasse II tetrameren voor de detectie van antigeen-specifieke CD4 T-cellen is een uitdaging geweest 1-7. Om de gevoeligheid van MHC klasse II tetrameren verbeteren, heeft het onderzoeksteam gecreëerd volgende generatie tetrameren, aangeduid "dextramers" 8. Dextramers bevatten dextran ruggengraten waarbij meerdere streptavidine-fluorofoor resten geconjugeerd, zodanig dat verschillende peptide-gebonden, gebiotinyleerde MHC monomeren kan worden bevestigd aan een dextran-molecuul 9. Zo kunnen grote aggregaten van MHC dextramers dat verschillende MHC-peptidecomplexen bevatten interageren met meerdere T-celreceptoren (TCR).
Deze groep recent bekomen dextramers voor diverse zelf-antigenen en aangetoond dat de detectiegevoeligheid van dextramers ongeveer vijf keer meer dan tetrameren 8. De experimentele systemen zijn experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) geïnduceerd met proteolipid eiwit (PLP) 139-151 in SJL muizen; EAE geïnduceerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) 35-55 in C57BL / 6 muizen; en experimentele auto-immune myocarditis (EAM) geïnduceerd met cardiale myosine zware keten-α (Myhc) 334-352 in A / J muizen. Deze studie demonstreert het gebruik van PLP 139-151 - en Myhc 334-352 dextramers antigeen-specifieke CD4 T-cellen te detecteren in situ met specificiteit Door een directe kleuring protocol, waardoor de noodzaak om de signalen te versterken gebruiken fluorofoor antilichamen, een benaderen gewoonlijk toegepast met behulp van tetrameren. Daarnaast is een uitgebreide methode evalueren weefsels ook bedacht betrouwbaar sommen de frequentie van antigeen-specifieke CD4 T-cellen in situ 10. Detectie van antigeen-specifieke T-cellen in situ maakt afbakening van gebeurtenissen veroorzaakt door specifieke antigene stimuli van die veroorzaakt door omstanders activatie. Ook de in situ techniek ook provides mogelijkheden om de kinetiek van antigeen-specifieke T cel infiltratie in de doelorganen volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring:
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren en door de Universiteit van Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE goedgekeurd.
1. Inductie van EAE
- EAE induceren bereiden peptide / compleet Freund's adjuvans (CFA) emulsie zoals beschreven in 11 de volgende wijzigingen: Stap 1.1:. Bereiden PLP 139-151 bij een concentratie van 1 mg / ml in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) Stap 1.4. gebruik 200 ul CFA emulsie die 100 ug PLP 139-151 per dier Stap 1.4.1: tien immunisatie van dieren bereiden 2 ml emulsie door het mengen van 1 ml PLP 139-151 (1 mg / ml in 1x . PBS) en een gelijk volume CFA Stap 1.5: injecteer 200 ul emulsie in gesplitste doses subcutaan in beide liezen (~ 75 pi elk) en borstbeen (~ 50 pi) van vijf tot zes weken oude female SJL / J muizen. Stappen 1.7 en 1.8 zijn niet van toepassing voor de inductie van EAE.
2. Klinische Scoring van EAE Muizen en oogsten van Cerebrums
- Bewaken van de dieren voor het uiterlijk van de klinische symptomen, en de score van de ziekte-ernst dagelijks vanaf dag 9 immunisatie als volgt: 0 - gezond; 1 - slappe staart of zwakte van de achterpoten, maar niet beide; 2 - slappe staart en zwakte van de achterpoten; 3 - gedeeltelijke verlamming van de achterpoten; 4 - volledige verlamming van de achterpoten; 5 - stervend of dood 12.
- Euthanaseren de muizen wanneer ze een neurologische score van 3 of 4 met behulp van CO 2 te bereiken. Om de muizen euthanaseren, eerste pre-vul de euthanasie kamer met CO 2 door de regulator van de CO 2-tank niet meer dan 6 psi en toestaan dat dieren blijven binnen de kamer voor ongeveer 5 minuten om volledige verstikking bereiken. Week de geëuthanaseerd dieren in 70% alcohol. Onmiddellijk plaats de dieren op een absorberend kussen en met een paar sterieleekhoorntjesbrood en schaar het hart bloot te leggen door het doorsnijden van de borstholte. Prik de juiste oorschelpen en perfuse door het injecteren van 10 ml koud PBS 1x in de linker ventrikel van het hart.
- Graven de schedel door te knippen de schedel in een circulaire manier met behulp van een paar gebogen schaar, en zorgvuldig, flip de schedelbeenderen met een tang. Oogst de hersenen door stompe dissectie en met een schone scalpel, een aparte grote hersenen van de kleine hersenen. Plaats de grote hersenen in een buis met koude 1x PBS en laat de buis op ijs tot verwerking.
3. In Situ kleuring van Cerebral Secties met MHC klasse II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers
- Bereid 4% PBS gebufferde laagsmeltende agarose, smelten door verhitten bij 50 ° C en laat het in een 40 ° C waterbad tot gebruik.
- Plaats de grote hersenen in een wegwerp diepe basis schimmel histologie cassette gehouden over ijs, en giet gesmolten (40 ° C) agarose. Onmiddellijk, druk op de hersenen zachtjesmet een tang om het weefsel onder te dompelen. Laat de cassette op ijs gedurende 15-20 minuten totdat het stollen is voltooid.
- Vul het vibratome bad met gekoelde 1x PBS. Vul de ruimte rond vibratome bad met ijsblokjes de temperatuur PBS tussen 0 en 2 handhaven ° C. Fix een schoon scheermesje in de vibratome en zet het mes hoek tot 15 °.
- Plaatsing van weefsel in vibratome. Knip overtollige agarose van alle wanden van de ingebedde weefsel en het ventrale oppervlak van de hersenen enigszins bloot.
- Smeer vibratome weefsel blok met super lijm en breng de agarose-ingebed weefsel over de verlijmde oppervlak door het plaatsen van de blootgestelde ventrale oppervlak van de hersenen over de lijm voor dwarse snijden. Verplaats het weefsel, zodra het weefsel is verdeeld over het blok.
- Plaats de vibratome blok met de agarose-ingebed weefsel op ijs, en laat de lijm drogen gedurende 15 minuten.
- In de tussentijd zet de weefsel chamBers een per putje van een 24-wells plaat. Vul de putjes die de weefselkamers met 1 ml koud 1x PBS, en laat de plaat op het ijs.
- Bereid de weefselkamers door het aanbrengen van een dunne nylon mesh aan de cut-uiteinde van een 25 ml polypropyleen pipet met behulp van superlijm; na het knippen van de overtollige gaas rond de pipet, snijd de pipet tot een lengte van 1 cm van het gaas.
- Laat de vibratome blad om het niveau van het bovenvlak van het weefsel; stel de vibratome snelheid tot 0,22 mm / sec en beginnen snijden met een voorwaartse beweging tot 200 micrometer dikke secties maken. Transfer een cerebrale sectie per putje met een aquarel zachte borstel in het weefsel kamers geplaatst in de putjes van een 24-wells plaat. Houd de plaat op ijs tot snijden voltooid is om weefsel degradatie te voorkomen. Opmerking: Volg deze stappen om te krijgen in totaal drie gekoppelde secties van drie verschillende gebieden van de hersenen dorsale om het ventrale oppervlak (figuur 2). Een deel vanelk paar (in totaal drie delen) die in drie afzonderlijke weefselkamers bestemd zijn voor kleuring met specifieke dextramers (IA s / PLP 139-151) en anti-CD4. Evenzo tweede reeks van drie secties die in drie afzonderlijke weefselkamers geplaatst zijn bestemd voor kleuring met controle dextramers (IA s / TMEV 70-86) en anti-CD4.
- Breng de drie weefselkamers met de voor kleuren met specifieke dextramers in drie putten in een 24-wells plaat met een kamer per putje in gedeelten die, 300 ui van een cocktail met allofycocyanine (APC)-geconjugeerde PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) en anti-CD4-fycoerythrine (PE, 5 ug / ml) in blokkerende oplossing (1x PBS met 2% normaal geit serum) werd eerder toegevoegd. Bedek de putjes met een deksel.
- Evenzo, de overdracht van de drie weefselkamers met de voor kleuring met controle dextramers in drie putten in een 24-wells plaat met een kamer per we sectiesll waarin 300 pl van een cocktail met APC-geconjugeerd TMEV 70-86 dextramers (2,5 ug / ml) en anti-CD4-PE (5 ug / ml) in blokkerende oplossing werd eerder toegevoegd. Bedek de putjes met een deksel. Opmerking: Raadpleeg Massilamany et al., 8 voor de bereiding van dextramers, en de dextran moleculen te bereiden dextramers werden vriendelijk verschaft door Immudex, Kopenhagen, Denemarken..
- Etiket van de putten, en wikkel de plaat met aluminiumfolie en plaats de plaat op een schommelende platform ingesteld op zachte rotaties gedurende 1,5 uur in het donker bij kamertemperatuur.
- Na de incubatieperiode was weefselcoupes op de schommelende platform in door de weefselkamers een nieuw putje met 1 ml koude 1x PBS en vermijd druppelen de inhoud van een putje in de andere. Herhaal het wassen driemaal, waardoor ten minste 10 minuten per wasbeurt. Zorg ervoor dat de coupes niet krijgen gedroogd als ze kunnen kleven aan de wanden van de kamer.
- Bevestig de secties door overmaking van het weefsel chammers in een nieuwe put in 24-wells plaat met 1 ml gefiltreerd PBS 4% gebufferde paraformaldehyde (pH 7,4) op een schommelende platform gedurende 2 uur onder zacht rotaties.
- Herhaal driemaal wassen zoals beschreven in stap 3.10.
- Plaats de gekleurde en vaste rubrieken op een schoon microscopisch preparaat met behulp van een aquarel zachte borstel. Veeg het overtollige water zonder de sectie aan te raken, en monteer het onderdeel met behulp van montage medium. Dek af met een microscopische dekglaasje en laat de dia drogen bij kamertemperatuur O / N in de donkere kamer.
- Bewaar de dia's in een lichtdichte dia opbergbox bij 4 ° C.
4. Inductie van EAM en verzamelen van Harten
- Laten EAM zoals beschreven in referentie 11.
- Euthanaseren de muizen op dag 21 immunisatie met behulp van schone kamer voorzien van CO 2 gasfles, en genieten van de dieren in 70% alcohol. Onmiddellijk plaats de dieren op een absorberend kussen en met behulp van een tang en schaar het hart bloots door snijden door de borstholte. Prik de juiste oorschelpen en perfuse door het injecteren van 10 ml koud PBS 1x in de linker ventrikel van het hart. Verzamel de hartjes en plaats in tubes met koude 1x PBS.
5. In Situ kleuring van Hart Secties met MHC klasse II (IA k) / Myhc 334-352 Dextramers
- Bereid 4% PBS gebufferde laagsmeltende agarose, smelten door verhitten bij 50 ° C en laat deze 40 ° C waterbad tot gebruik.
- Plaats het hart in een eenmalig diepe basisvorm histologie cassette op ijs gehouden en giet gesmolten 40 ° C agarose totdat het weefsel volledig ondergedompeld zoals beschreven in stap 3.2.
- Volg stap 3.3.
- Knip overtollige agarose van alle wanden van de ingebedde weefsel en de basis van het hart licht bloot. Smeer vibratome weefsel blok met super lijm en breng de agarose-ingebed weefsel over de verlijmde oppervlak door het plaatsen van het zichtbare oppervlak van dehart over de lijm. Verplaats het weefsel, zodra het weefsel is verdeeld over het blok.
- Plaats de vibratome blok met de agarose-ingebed weefsel op ijs, en laat de lijm drogen gedurende 15 minuten.
- Volg de stappen 3.5 en 3.6.
- Breng het hart delen met een aquarel zachte borstel in het weefsel kamers geplaatst in de putjes van een 24-wells plaat. Houd de plaat op ijs tot snijden voltooid is om afbraak van weefsel te voorkomen. Opmerking: Volg deze stappen om te verkrijgen in totaal acht gepaarde secties van de top naar de basis van het hart (figuur 2). Plaats alle secties in weefselkamers, toewijzing tot 3 secties per kamer. Een deel van elk paar (in totaal acht secties) is bestemd voor kleuren met specifieke dextramers (IA k / Myhc 334-352) en anti-CD4. Ook wordt een andere reeks van acht secties aangewezen voor kleuring met controle dextramers (IA k / RNase 43-56) en anti-CD4.
- Breng dedrie weefselkamers met de voor kleuren met specifieke dextramers in drie putten in een 24-wells plaat met een kamer per putje in gedeelten die, 300 ui van een cocktail met APC-geconjugeerd Myhc 334-352 dextramers (2,5 ug / ml) en anti-CD4-PE (5 ug / ml) in blokkerende oplossing werd eerder toegevoegd. Bedek de putjes met een deksel.
- Ook dragen de drie weefselkamers met de voor kleuring met controle dextramers in drie putten in een 24-wells plaat met een kamer per putje sectie waarin, 300 ui van een cocktail met APC-geconjugeerd RNase 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) en anti-CD4-PE (5 ug / ml) in blokkerende oplossing werd eerder toegevoegd. Bedek de putjes met een deksel.
- Etiket van de putten, en wikkel de plaat met aluminiumfolie en plaats de plaat op een schommelende platform ingesteld op zachte rotaties gedurende 1,5 uur in het donker bij kamertemperatuur.
- Volg de stappen, 3,10-3,11
- Herhaal het wassen thrijs zoals in stap 3.10.
- Plaats de gekleurde en vaste delen (maximaal drie secties / glijbaan) op een schoon microscopisch preparaat met behulp van een aquarel zachte borstel. Veeg het overtollige water zonder het aanraken van de secties, en monteer de delen met behulp van montage medium. Dek af met een microscopische dekglaasje en laat de dia drogen bij kamertemperatuur O / N in de donkere kamer.
- Bewaar de dia's in een lichtdichte dia opbergbox op 4 ° C.
6. Analyse van Dextramer + (dext +) CD4 + T-cellen door confocale laser scanning microscoop (LSCM) (voor beide hersenen en het hart secties)
- Gebruik Nikon A1-Eclipse 90i confocale microscoop systeem voor routinematige scannen en acquisitie van beelden. Om te starten Klik geopend, de NOS Elements AR-software (versie 4.13).
- Kies "TRITC" en "Cy5" kanalen van het paneel. De excitatie / emissie golflengtes respectievelijk voor TRITC en Cy5 kanalen, 561,5 nm / 553-618 nm en 640,7 nm / 663-738 nm standaard verschijnen.
- Wijs de pseudocolors "groene" en "rood" voor de TRITC (CD4-PE) en Cy5 (dextramer-APC) kanalen, respectievelijk.
- Plaats de te onderzoeken op de microscopische podium glijbaan en handmatig scherp onder 100X vergroting. Stel "HV" naar 110 en offset "0". Klik op "Focus" en stel de "spanning" om de lasers te optimaliseren.
- Klik op "Focus"; scan de sectie van boven naar beneden, en zet de 'Z' niveau voor het acquisitie. Klik op "CH-serie" en het verwerven van het beeld sequentieel. Identificeer Dext + CD4 + T-cellen verschijnen als gele gestippelde cellen op basis van co-lokalisatie van signalen gegenereerd uit zowel de rode (dextramers) en groen (CD4) kanalen.
- Gebruik Olympus FV500-BX60 confocale microscoop voor eenvoudige kwantitatieve opsomming van dext + CD4 + T-cellen. Om te beginnenklik geopend, de FluoView software (versie 4.3).
- Selecteer de kleurstoffen "Cy3" en "Cy5" uit het drop-down menu, en klik op "Apply" om de betreffende lasers te laden. Let op: de excitatie / emissie golflengtes voor Cy3 (543 nm / pseudocolored "groene"; CD4-PE) en Cy5 (633 nm / pseudocolored "rood"; dextramer-APC) kanalen.
- Plaats de te onderzoeken in het microscopisch preparaat glijbaan, en stel handmatig scherp het onder lage vergroting (4x of 10x). Klik op "Focus", terwijl de Cy3 laser is op, en de focus van de inflammatoire focus.
- Verander de doelstelling om 100X vergroting. Stel de bestandsgrootte tot "512/512" uit het drop-down menu. Klik op "Focus" en de waarden voor "PMT", "Gain" passen en "Offset" parameters om de lasers afzonderlijk te optimaliseren voor Cy3 en Cy5.
- Klik op "Z stage" en klik vervolgens op "Focus", terwijl zowel de lasers op. Reeksde dikte van de "Z stage" door de "up" en "down" pijlen te klikken. Stel de "Z" interval 2 urn.
- Klik op "Stop", en kies "Seq123". Klik vervolgens op "XYZ" en beginnen te verwerven serie "Z" beelden voor het geselecteerde gebied binnen de inflammatoire focus. Sla de "Z serie beelden 'als AVI-bestanden. Beeldbestanden op te slaan, selecteert u het beeld van de "Z serial imago", en vervolgens opslaan als "tiff"-formaat.
- Onderzoeken drie gepaarde delen van de hersenen waar een set van drie delen werd gekleurd met IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 en de andere set van drie secties met IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 te voeren kwantitatieve analyse.
- Evenzo, analyseren acht gepaarde secties voor hart, waarin een reeks van acht secties werd gekleurd met IA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 en andere set van acht secties met RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
- Onderzoek 10-15 ontstekingsfoci per sectie in grote hersenen, en in elke focus, het verwerven van een reeks van 15 tot 25 seriële beelden achter elkaar.
- Onderzoeken van een totaal van 20 ontstekingsfoci uit alle acht onderdelen van het hart en van ieder focus verwerven 10-15 seriële beelden achter elkaar. Neem de 'Z' seriële beelden door het scannen van de dia's in een 'horizontaal-verticaal up-horizontaal-verticaal neergaand' beweging, zodat herhaling van de serie 'Z' binnen dezelfde scherpstelling wordt vermeden.
- Once 'Z' seriële beelden worden opgenomen, de naam van de bestanden door het identificeren van de glijbaan, de naam van de secties, en het aantal van de 'Z' seriële beelden genomen.
- Gebruik 'ImageJ' software dext + CD4 + T-cellen te tellen in verhouding tot het totale aantal CD4 + T-cellen. Selecteer het 'type teller' in 'ImageJ, check &# 8216; toon alle 'en beginnen te tellen door te klikken op het midden van elke cel en blijven tellen in verschillende' Z 'seriële beelden met behulp van kant pijlen. Na het tellen van alle CD4 T-cellen, kiest u een ander type teller en tel de CD4 + Dext + T-cellen. Open het tabblad resultaat het totale aantal getelde cellen met twee verschillende tellers krijgen.
- Om het totale aantal te verkrijgen, voeg het aantal cellen in alle Z-serie beelden die alle drie cerebrale afdelingen of de acht secties hart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit verslag, in situ detectie van antigeen-specifieke autoreactieve CD4 T-cellen door directe kleuring met MHC klasse II dextramers beschreven. Vers gesneden cerebrale secties werden afgeleid van EAE muizen en gekleurd met cocktails met PLP 139-151 (specifieke) of TMEV 70-86 (controle) dextramers en anti-CD4. De bovenste panelen in Figuur 1 toont LSCM analyse van cerebrale secties costained met PLP 139-151 dextramers (rood) en CD4-antilichaam (groen), waar de dubbel-positieve cellen bleek geel. Een dergelijke functie was afwezig in secties gekleurd met TMEV 70-86 (controle) dextramers (onderste panelen). De costained (Dext + CD4 +) cellen vertoonden punctate puntjes rond de periferie. Kwantitatieve analyse van PLP-specifieke T-cellen in de cerebrale secties omvatte de volgende stappen (figuur 2): 1) Delen van drie paren gemaakt, en een deel van elk paar afzonderlijk is gekleurd met anti-CD4 en PLP 139-151 dextramers. Ook tweede reeks van drie secties werden gekleurd met anti-CD4 en controle (TMEV 70-86) dextramers. 2) Van een gegeven sectie, ontsteking foci (10 tot 15) werden geïdentificeerd op basis van anti-CD4 kleuring. 3) Een set van 'Z' serial beelden (15-25) werden genomen van ieder focus sequentieel van boven naar beneden met een interval van 2 micrometer tussen elk. In wezen werden 10 tot 15 vergelijkbare sets van Z-serie beelden die gelijk aantal ontsteking foci geanalyseerd elke sectie. 4) In afzonderlijke beelden, CD4 + cellen (groen), de cellen positief voor zowel dextramers (rood) en CD4 (groen), die verscheen als gele gestippelde cellen werden geteld door deze te markeren individueel gebruik van de open source software, ImageJ, en ten slotte, een totaal werd voor elke sectie verkregen door het aantal cellen geteld in alle Z-serie beelden. Omdat de cellen werden gemerkt, de mogelijkheid vertellen de cellen in meerdere beelden dieoverlappende werd geëlimineerd. Aldus kan een betrouwbare telling van dext + cellen ten opzichte van het totale aantal cellen die CD4 bereikt.
Deze studie werd verder uitgebreid tot het gebruik van dextramer reagentia voor het detecteren van antigeen gesensibiliseerde T-cellen in situ in EAM geïnduceerd met Myhc 334-352 in A / J muizen die ook een T-cel gemedieerde ziekte 13,14 demonstreren. Acht gepaarde hart secties werden verkregen, elk 200 micrometer dik, van EAM muizen (figuur 2). Van elk paar, een sectie (met een totaal van 8 delen) werd gekleurd met Myhc 334-352 dextramers en anti-CD4, terwijl een andere set van secties (8 in totaal) werd gekleurd met RNase 43-56 dextramers (controle) en anti CD4. Twintig sets Z-serie beelden op basis dat veel inflammatoire foci die acht secties werden achtereenvolgens hierboven (figuur 2) verkregen. In wezen, een bepaalde set van seriële im 'Z'leeftijden bestond uit 10 tot 15 individuele vertegenwoordigen een enkele inflammatoire focus. Analyse van deze beelden door LSCM toonde de aanwezigheid van cellen positief voor Myhc 334-352 dextramers (rood), en CD4 (groen) en onverwacht, de cellen gebonden met zowel dextramers en CD4 verscheen als geel gestippelde cellen (Figuur 3, top panelen) . De achtergrond kleuring voor controle dextramers was verwaarloosbaar (Figuur 3, bodem panelen). Het totale aantal dext + CD4 + T-cellen en het totale aantal CD4 + T-cellen werden bepaald voor elke sectie en de uitkomsten van alle secties werden tezamen toegevoegd aan het totaal aantal af te leiden voor elke subset (dext + CD4 + T-cellen, CD4 + T-cellen).
Figuur 1. Detectie van PLP-specifieke CD4 T-cellen door in situ kleuring met PLP 139-151 dextramers. EAE werd geïnduceerd in SJL muizen door immuniseren van dieren met PLP 139-151 in CFA. Bij beëindiging, werden cerebrums verzameld van EAE muizen ingebed in 4% agarose, en de secties werden gemaakt met behulp van vibratome. Na kleuring met cocktails die ofwel PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 of TMEV 70-86 dextramers (controle) / anti-CD4 en bevestiging met 4% PBS-gebufferde paraformaldehyde, werden secties gewassen en gemonteerd voor het onderzoek door LSCM. Top panelen: twee afzonderlijke secties gekleurd met PLP 139-151 dextramers/anti-CD4. Onderste panelen: twee afzonderlijke secties gekleurd met TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. Linkerpaneel: CD4, groen; Middenpaneel: dextramers, rood; Rechterpaneel: samengevoegd (pijlen, dext + CD4 + T-cellen). Oorspronkelijke vergroting 1000 X (aangenomen:.. Massilamany et al., 2014 Directe kleuring met Hoofdhistocompatibiliteitscomplex klasse II Dextramers Vergunning Detectie van antigeen-specifieke, Autoreactieve CD4 T-cels In Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Een benadering van dext + cellen te kwantificeren in de hersenen en het hart. Gekoppelde delen zijn gemaakt van hersenen of-oorschelp uitgesneden hart zoals afgebeeld (Panel 1). Een deel van elk paar dat beantwoordt aan de organen werd aangewezen voor het kleuren met specifieke dextramers (grote hersenen, PLP 139-151 dextramers, hart, Myhc 334-352 dextramers), en de andere set van secties voor controle dextramers (grote hersenen, TMEV 70 - 86, hart, RNase 43-56). Na de vaststelling en de montage werden de coupes onderzocht om ontstekingsfoci gebaseerd op kleuring met CD4 door LSCM (origineel mag lokaliserennification, 40X) (Panel 2). Elke inflammatoire focus als gevisualiseerd in drie-dimensionale (3D) weergave (Panel 3) werd onderworpen aan een reeks van 'Z' serial beelden opeenvolgend (Panel 4). In alle beelden, werden de cellen positief voor zowel specifieke of controle dextramers en CD4 of CD4 alleen geteld met behulp van 'ImageJ' software (aangenomen:.. Massilamany et al., 2014 Directe kleuring met Hoofdhistocompatibiliteitscomplex klasse II Dextramers Vergunning Detectie van antigeen- specifieke, Autoreactieve CD4 T-cellen in Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Detectie van cardiaal myosine-specifieke CD4 T-cellen door in situ
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Unlike MHC klasse I tetrameren, het gebruik van MHC klasse II tetrameren voor routinetoepassingen blijft uitdagend, vooral voor de voorloper frequenties van lage affiniteit autoreactieve CD4 T-cellen, mede door hun activering afhankelijkheid 6,15-17 sommen. Onlangs werd dit probleem omzeild door het creëren van de volgende generatie van tetrameren, genaamd "dextramers," waardoor wij antigeen-specifieke CD4 T-cellen te detecteren voor een aantal auto-antigenen, zoals PLP 139-151, MOG 35-55 en Myhc 334 - 352 8. In dit verslag voor het eerst het nut van MHC klasse II dextramers om autoreactieve CD4 T-cellen te detecteren en kwantificeren in situ aangetoond middels hersensecties van EAE muizen en hart coupes van EAM muizen. Op reactie basis dextramers bieden het voordeel dat een kleine hoeveelheid MHC / peptidecomplexen. In dit protocol elke reactie vereist slechts 0,75 ug MHC / peptide-monomeren. Bovendien stazoekvan met dextramers is een eenstapsreactie, aangezien dextramers worden samen geïncubeerd met anti-CD4, en de hele procedure van weefsel snijden tot kleuring, kan worden afgewerkt in minder dan een dag. In tegenstelling, de gepubliceerde protocollen voor in situ kleuring conventionele tetrameren gewoonlijk het amplificatie procedures waarbij de fluorescerende signalen worden geamplificeerd met secundaire antilichamen voor fluoroforen. Hierdoor kan kleuringen maximaal drie dagen in beslag 18-20.
Bovendien is het gebruik van dextramers cerebrale delen maakt detectie van antigeen-specifieke T-cellen diep in de weefselcoupes zelfs tot 50 urn. Opgemerkt werd dat PLP 139-151 dext + CD4 +-cellen bleken zowel perivascularly en ook binnen het parenchym bevinden. Bovendien is de intensiteit van de signalen gegenereerd uit Myhc 334-352 dextramers was laag in cardiale secties in vergelijking met de PLP 139-151 dextramers in hersenen secgen (Figuur 1), en een dergelijke variatie kan de karakteristieken uniek voor elk orgaan geven. Een van deze variabele is het vetgehalte dat aanwezig is in grote hoeveelheden in het hersenweefsel is, in tegenstelling tot hartweefsel dat hoofdzakelijk dwarsgestreepte spiervezels die mogelijk kunnen beperken gemakkelijke verspreiding van dextramers in de inflammatoire Focus omvat. Ter ondersteuning van dit begrip werden Myhc 334-352 dext + cellen waargenomen slechts een diepte tot 20 urn in de meerderheid van cardiale secties. Daarnaast Myhc 334-352 dext + cellen aanwezig waren verspreid door het myocard suggereert dat de verspreide aard van ontstekingsinfiltraten in myocarditic laesies.
In het algemeen kunnen twee belangrijke factoren nadelig beïnvloed detectie van antigeen-specifieke T-cellen in situ door LSCM. Ten eerste kan onvoldoende signalen van fluoroforen leiden tot de noodzaak om de signalen te versterken met fluorofoor antilichamen. Verder is die indirect vleking kan de specificiteit ondermijnen, zoals de achtergrond kleuring voor controle reagentia kan ook proportioneel 18,19 verhogen. Deze beperkingen werden ontweken door directe kleuring met de dextramers. Hoewel detectie van CD4 T-cellen met succes aangetoond met verse secties, het gebruik van dextramer reagentia bevroren weefsels vereist extra studies, die een uitdaging als behoud van weefsel-integriteit kan moeilijk zijn vanwege de neiging van weefsels krijgen uiteengevallen in verschillende kleuring stappen 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten werden verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association en de Children's Cardiomyopathie Foundation (SDG2462390204001), en de National Institutes of Health (HL114669). CM is een ontvanger van een postdoctoraal research fellowship subsidie van de Myocarditis Foundation, NJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4 °C |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4 °C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4 °C |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4 °C |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 °C |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4 °C |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4 °C | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
- Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
- Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
- Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
- Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
- Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
- Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
- Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
- Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
- Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
- Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
- Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
- Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
- Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).
