Summary
Il protocollo per rilevare le cellule autoreattive T CD4 nel cervello e nel cuore dalla colorazione diretto con complesso maggiore di istocompatibilità di classe II dextramers è stato descritto nella presente relazione. Per un'analisi completa, un metodo affidabile per enumerare le frequenze di cellule CD4 + T antigene-specifiche in situ è pensato anche.
Introduction
L'uso del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II tetrameri per la rilevazione di cellule antigene-specifiche CD4 T è stata una sfida 1-7. Per migliorare la sensibilità di rilevazione di MHC classe II tetrameri, il team di ricerca ha creato tetrameri di prossima generazione, denominati "dextramers" 8. Dextramers contengono dorsali destrano in cui più frazioni streptavidina-fluoroforo sono coniugate, in modo che diversi peptidi-tethered, biotinilati monomeri MHC possono essere collegati ad una molecola destrano 9. Così, grandi aggregati di dextramers MHC che contengono diversi complessi MHC-peptide possono interagire con molteplici recettori delle cellule T (TCR).
Questo gruppo ha recentemente generato dextramers per varie auto-antigeni e ha dimostrato che la sensibilità di rilevazione di dextramers era di circa cinque volte più di tetrameri 8. I sistemi sperimentali includono encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) indotto con proteolipid proteina (PLP) 139-151 nei topi SJL; EAE indotta con mielina degli oligodendrociti glicoproteina (MOG) 35-55 in topi C57BL / 6; e miocardite autoimmune sperimentale (EAM) indotta con miosina cardiaca catena pesante-α (MyHC) 334-352 in A / J topi. Questo studio dimostra l'uso di PLP 139-151 - e MyHC 334-352 dextramers per rilevare le cellule antigene-specifiche CD4 T in situ con specificità sviluppando un protocollo di colorazione diretta, eliminando così la necessità di amplificare i segnali utilizzando anticorpi fluoroforo, un approccio comunemente impiegato con l'utilizzo di tetrameri. Inoltre, un metodo completo di valutare tessuti è anche stato studiato per enumerare affidabile le frequenze di cellule CD4 T antigene-specifiche in situ 10. Rilevamento di cellule T antigene-specifiche in situ permette delineazione di eventi provocati da stimoli antigenici specifici da quelle causate dall'attivazione astanti. Allo stesso modo, la tecnica in situ anche provides opportunità per monitorare la cinetica di infiltrazioni di cellule T antigene-specifiche negli organi bersaglio.
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Protocol
Etica Dichiarazione:
Tutte le procedure di polizia sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvati dalla University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.
1. Induzione di EAE
- Per indurre EAE, preparare l'emulsione peptide / adiuvante completo di Freund (CFA) come descritto in 11 con le seguenti modifiche: Fase 1.1:. Preparare PLP 139-151 ad una concentrazione di 1 mg / ml in 1x tampone fosfato isotonico (PBS) Fase 1.4:. utilizzare 200 ml di emulsione CFA contenenti 100 mg di PLP 139-151 per animale Passo 1.4.1: per immunizzare dieci animali, preparare 2 ml di emulsione mescolando 1 ml di PLP 139-151 (1 mg / ml in 1x . PBS) e un volume uguale di CFA Passo 1.5: iniettare 200 ml di emulsione in dosi per via sottocutanea divisi nelle due regioni inguinali (~ 75 ml ciascuna) e la regione sternale (~ 50 ml) di cinque-sei settimane di età fematopi le SJL / J. I passi 1.7 e 1.8 non sono applicabili per l'induzione di EAE.
2. Punteggio clinico di topi EAE e la raccolta di cervelli
- Monitorare gli animali per la comparsa di segni clinici, e segnare la malattia-gravità tutti i giorni dalle 9 giorni post-immunizzazione come segue: 0 - sani; 1 - limp coda o debolezza degli arti posteriori, ma non entrambi; 2 - limp coda e debolezza degli arti posteriori; 3 - parziale paralisi degli arti posteriori; 4 - paralisi completa degli arti posteriori; 5 - moribondi o morti 12.
- Euthanize i topi quando raggiungono un punteggio neurologica di 3 o 4 utilizzando CO 2. Per eutanasia topi, pre-riempire la camera di eutanasia in primo luogo con CO 2 ruotando il regolatore del serbatoio di CO 2 non superiore a 6 psi e permettono animali di rimanere all'interno della camera per circa 5 minuti per raggiungere la completa asfissia. Immergere gli animali sacrificati nel 70% di alcol. Immediatamente, collocare gli animali su un tampone assorbente e usando un paio di sterile perfunghi porcini e forbici espongono i cuori tagliando attraverso la cavità toracica. Forare le orecchiette destra e profumato iniettando 10 ml di freddo 1x PBS nei ventricoli sinistro dei cuori.
- Scavare il cranio tagliandoli cranio in modo circolare usando un paio di forbici curve, e con attenzione, capovolgere le ossa del cranio con una pinza. Raccogliere il cervello smussato dissezione e utilizzando un bisturi pulito, cervello separato dal cervelletto. Mettere il cervello in una provetta contenente freddo 1x PBS e lasciare la provetta in ghiaccio fino al trattamento.
3. In Situ colorazione di sezioni cerebrali con MHC di classe II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers
- Preparare 4% PBS tamponata basso punto di fusione agarosio, sciogliere mediante riscaldamento a 50 ° C e lasciato in un bagno d'acqua a 40 ° C fino all'utilizzo.
- Mettere il cervello in un usa e getta stampo base profonda cassetta istologia mantenuto su ghiaccio e versare fuso (40 ° C) agarosio. Immediatamente, premere il cervello delicatamentecon una pinza di immergersi tessuto. Lasciare la cassetta in ghiaccio per 15-20 minuti fino a quando la solidificazione è completa.
- Riempite la vasca con vibratome refrigerati 1x PBS. Riempire lo spazio intorno vibratome bagno con cubetti di ghiaccio per mantenere la temperatura di PBS tra 0 e 2 ° C. Fissare una lama di rasoio pulito nel vibratome e impostare l'angolo della lama a 15 °.
- Posizionamento del tessuto in vibratome. Trim eccesso di agarosio da tutti i lati del tessuto incorporato e leggermente esporre la superficie ventrale del cervello.
- Spalmare vibratome blocco di tessuto con colla super e trasferire il tessuto agarosio-embedded sulla superficie incollata posizionando la superficie ventrale esposta del cervello sopra la colla per sezionamento trasversale. Non spostare il tessuto, una volta che il tessuto è impostato sul blocco.
- Posizionare il blocco vibratome contenente il tessuto agarosio-embedded su ghiaccio, e lasciare asciugare la colla per 15 min.
- Nel frattempo, posizionare la camera di tessutobri uno per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Riempire i pozzetti contenenti le camere di tessuto con 1 ml di PBS 1x freddo, e lasciare la piastra su ghiaccio.
- Preparare le camere di tessuto ed accompagnato da una sottile maglia in nylon al taglio-end di una pipetta 25 ml in polipropilene utilizzando colla super; dopo il taglio della maglia in eccesso intorno alla pipetta, intercettato pipetta con una lunghezza di 1 cm dalla mesh.
- Abbassare la lama vibratome al livello della superficie superiore del tessuto; impostare la velocità vibratome a 0,22 mm / sec e iniziare sezionamento con un movimento in avanti per fare 200 sezioni micron di spessore. Trasferire una sezione cerebrale per bene con un pennello morbido acquerello nelle camere di tessuto collocati all'interno dei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Mantenere la piastra su ghiaccio fino sezionamento è completa per prevenire il degrado del tessuto. Nota: Seguire questa procedura per ottenere in totale, tre sezioni coppie provenienti da tre diverse regioni della dorsale cervello alla superficie ventrale (Figura 2). Una sezione daogni coppia (in totale tre sezioni) collocato in tre alloggiamenti del tessuto individuali sono designati per la colorazione con dextramers specifici (IA s / PLP 139-151) e anti-CD4. Allo stesso modo, un'altra serie di tre sezioni che si trovano in tre alloggiamenti del tessuto individuali sono designati per la colorazione con dextramers di controllo (IA s / TMEV 70-86) e anti-CD4.
- Trasferire le tre camere di tessuto contenenti le sezioni designate per colorazione con dextramers specifici in tre pozzetti in una piastra da 24 pozzetti con una camera per pozzetto in cui, 300 ml di un cocktail contenente allophycocyanin (APC)-coniugati PLP 139-151 dextramers (2,5 mcg / ml) e anti-CD4-ficoeritrina (PE; stato precedentemente aggiunto 5 mg / ml) in soluzione di bloccaggio (1x PBS con siero normale di capra 2%). Coprire i pozzetti con un coperchio.
- Allo stesso modo, trasferire le tre camere di tessuto contenenti le sezioni designate per la colorazione con dextramers di controllo in tre pozzetti in una piastra da 24 pozzetti con una camera per noill in cui, 300 ml di un cocktail contenente TMEV APC coniugato 70-86 dextramers (2,5 mcg / ml) e anti-CD4-PE (5 mg / ml) in soluzione di blocco aggiunto in precedenza. Coprire i pozzetti con un coperchio. Nota: Consultare Massilamany et al, 8 per la preparazione di dextramers, e le molecole di destrano per preparare dextramers sono stati gentilmente forniti da Immudex, Copenhagen, Danimarca..
- Etichettare i pozzi, e avvolgere il piatto con un foglio di alluminio e posizionare la piastra su una piattaforma oscillante impostata su rotazioni dolci per 1,5 ore al buio a temperatura ambiente.
- Dopo il periodo di incubazione, lavare sezioni di tessuto sulla piattaforma oscillante, trasferendo le camere di tessuto per un fresco e contenente 1 ml di PBS 1x freddo, ed evitare dribblando il contenuto di un pozzetto nell'altra. Ripetere il lavaggio tre volte, permettendo almeno 10 minuti per lavaggio. Assicurarsi che le sezioni di tessuto non vengono asciugati in quanto potrebbero aderire ai lati della camera.
- Fissare le sezioni trasferendo il cham tessutobri in un fresco ben in piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml di filtrato 4% paraformaldeide tamponata con PBS (pH 7.4) su una piattaforma oscillante per 2 h con rotazioni dolci.
- Ripetere il lavaggio tre volte come descritto al punto 3.10.
- Posizionare le sezioni colorate e fissate su un vetrino microscopico pulito con una spazzola morbida acquerello. Asciugare l'acqua in eccesso senza toccare la sezione, e montare la sezione con mezzo di montaggio. Coprire con un vetrino microscopico e permettere ai vetrini si asciughino RT O / N in camera oscura.
- Conservare i vetrini in una scatola di diapositive a prova di luce a 4 ° C.
4. Induzione di EAM e la Raccolta di cuori
- Indurre EAM come descritto nel riferimento 11.
- Euthanize i topi al giorno 21 post-immunizzazione con camera pulita dotata di CO 2 bombola del gas, e immergere gli animali nel 70% di alcol. Immediatamente, collocare gli animali su un tampone assorbente e usando un paio di pinze e forbici esporre cuores tagliando attraverso la cavità toracica. Forare le orecchiette destra e profumato iniettando 10 ml di freddo 1x PBS nei ventricoli sinistro dei cuori. Raccogliere i cuori e posto in provette contenenti freddo 1x PBS.
5. In Situ colorazione di sezioni di cuore con MHC di classe II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers
- Preparare 4% PBS tamponata basso punto di fusione agarosio, sciogliere mediante riscaldamento a 50 ° C e lasciato in un 40 ° C a bagnomaria fino al momento dell'uso.
- Mettere il cuore in un usa e getta profondo stampo base di cassetta istologia tenuti in ghiaccio, e versare fuso 40 ° C agarosio fino a quando i tessuti sono completamente sommerse come descritto al punto 3.2.
- Seguire passo 3.3.
- Trim eccesso di agarosio da tutti i lati del tessuto incorporato e leggermente esporre la base del cuore. Spalmare vibratome blocco di tessuto con colla super e trasferire il tessuto agarosio-embedded sulla superficie incollata posizionando la superficie esposta delcuore sopra la colla. Non spostare il tessuto, una volta che il tessuto è impostato sul blocco.
- Posizionare il blocco vibratome contenente il tessuto agarosio-embedded su ghiaccio, e lasciare asciugare la colla per 15 min.
- Seguire i punti 3.5 e 3.6.
- Trasferire le sezioni cardiache utilizzando un pennello morbido acquerello nelle camere di tessuto collocati all'interno dei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Mantenere la piastra su ghiaccio fino sezionamento è completa per prevenire il degrado del tessuto. Nota: Seguire questa procedura per ottenere in totale, otto sezioni accoppiati dal vertice alla base del cuore (Figura 2). Mettere tutte le sezioni in camere di tessuto, assegnando fino a 3 sezioni per ogni camera. Una sezione di ciascuna coppia (in totale otto sezioni) è designato per colorazione con dextramers specifici (IA k / MyHC 334-352) e anti-CD4. Allo stesso modo, un altro gruppo di otto sezioni è designato per la colorazione con dextramers di controllo (IA k / RNase 43-56) e anti-CD4.
- Trasferire iltre camere di tessuto contenenti le sezioni designate per colorazione con dextramers specifici in tre pozzetti in una piastra da 24 pozzetti con una camera per pozzetto in cui, 300 ml di un cocktail contenenti APC-coniugati MyHC 334-352 dextramers (2,5 mcg / ml) e anti-CD4-PE (5 mg / ml) in soluzione bloccante è stato precedentemente aggiunto. Coprire i pozzetti con un coperchio.
- Analogamente, trasferire le tre camere di tessuto contenenti le sezioni designate per colorazione con dextramers controllo in tre pozzetti in una piastra da 24 pozzetti con una camera per pozzetto in cui, 300 ml di un cocktail contenente RNase APC coniugato 43-56 dextramers (2,5 mcg / ml) e anti-CD4-PE (5 mg / ml) in soluzione bloccante è stato precedentemente aggiunto. Coprire i pozzetti con un coperchio.
- Etichettare i pozzi, e avvolgere il piatto con un foglio di alluminio e posizionare la piastra su una piattaforma oscillante impostata su rotazioni dolci per 1,5 ore al buio a temperatura ambiente.
- Seguire i passaggi, 3,10-3,11
- Ripetere il lavaggio thrghiaccio come descritto al punto 3.10.
- Posizionare le sezioni colorate e fissi (fino a tre sezioni / diapositive) su un vetrino microscopico pulito con una spazzola morbida acquerello. Asciugare l'acqua in eccesso senza toccare le sezioni, e montare le sezioni utilizzando un mezzo di montaggio. Coprire con un vetrino microscopico e permettere ai vetrini si asciughino RT O / N in camera oscura.
- Conservare i vetrini in una scatola di diapositive a prova di luce alle 4 ° C.
6. Analisi dei Dextramer + (DEXT +) CD4 + T Cells da microscopio confocale (LSCM) (comune ad entrambe le sezioni del cervello e del cuore)
- Utilizzare Nikon A1-Eclipse sistema di microscopia confocale 90i per la scansione di routine e l'acquisizione delle immagini. Per iniziare Fare clic aperta, il software NIS Elements AR (versione 4.13).
- Scegliere "TRITC" canali "Cy5" dal pannello. Le lunghezze d'onda di eccitazione / emissione rispettivamente per i canali TRITC e Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm e 640,7 nm / 663-738 nm appaiono per impostazione predefinita.
- Assegnare il pseudocolore "verde" e "rosso" per il (dextramer-APC) canali TRITC (CD4-PE) e Cy5, rispettivamente.
- Posizionare il vetrino da esaminare sul palco microscopico e mettere a fuoco manualmente sotto ingrandimento 100X. Impostare "HV" a 110 e offset a "0". Fare clic su "Focus" e regolare la "tensione" per ottimizzare i laser.
- Fare clic su "Focus"; scansione sezione dall'alto verso il basso, e impostare il livello 'Z' per l'acquisizione delle immagini. Fare clic su "serie CH" e acquisire la sequenza di immagini. Identificare dext + cellule T CD4 + che appaiono come cellule puntiformi giallo basato su co-localizzazione dei segnali generati sia dal rosso (dextramers) e verde (CD4) canali.
- Utilizzare Olympus FV500-BX60 microscopio confocale per un facile conteggio quantitativo di cellule + CD4 + T Dext. Per iniziareclicca aperto, il software FluoView (versione 4.3).
- Selezionare "Cy3" coloranti e "Cy5" dal menu a discesa, quindi fare clic su "Applica" per caricare i rispettivi laser. Nota: le lunghezze d'onda di eccitazione / emissione per Cy3 (543 nm / pseudocolored "verde"; CD4-PE), canali e Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocolored "rosso").
- Posizionare il vetrino da esaminare sulla diapositiva microscopica, e mettere a fuoco manualmente in basso ingrandimento (4X o 10X). Fare clic su "Focus", mentre il laser Cy3 è acceso, e focalizzare l'attenzione infiammatorio.
- Modificare l'obiettivo di ingrandimento 100X. Impostare la dimensione del file di "512/512" dal menu a discesa. Fare clic su "Focus" e regolare i valori di "PMT", "Gain" e "Offset" parametri per ottimizzare i laser separatamente per Cy3 e Cy5.
- Fare clic su "stage Z" e poi cliccare su "Focus", mentre entrambi i laser sono. Setlo spessore della "fase Z" cliccando "su" e "giù" frecce. Impostare l'intervallo "Z" a 2 micron.
- Fare clic su "Stop", e scegliere "Seq123". Quindi, fai clic su "XYZ" e cominciare ad acquisire le immagini della serie "Z" per l'area selezionata all'interno del focolaio infiammatorio. Salvare le "immagini di serie Z" come file AVI. Per salvare i file di immagine, selezionare l'immagine da "immagine di serie Z", e poi salvarli in formato "tiff".
- Esaminare tre sezioni accoppiate dal cervello, dove una serie di tre sezioni era macchiata di IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 e l'altra serie di tre sezioni con IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 per eseguire analisi quantitativa.
- Analogamente, analizzare otto sezioni accoppiati per il cuore, in cui, una serie di otto sezioni è stato colorato con IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 e un altro sét di otto sezioni con RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
- Esaminare 10-15 focolai infiammatori per sezione di cervello, ed in ogni fuoco, acquisire una serie di 15 a 25 immagini seriali in sequenza.
- Esaminare un totale di 20 focolai infiammatori da tutte le otto sezioni di cuore e da ogni fuoco acquisire 10 a 15 immagini seriali in sequenza. Prendete le immagini di serie 'Z' attraverso la scansione dei vetrini in un movimento 'orizzontale-verticale-up orizzontale-verticale down' in modo da evitare la ripetizione di serie 'Z' all'interno della stessa attenzione.
- Una volta che le immagini seriali 'Z' vengono catturati, denominare i file individuando i numeri di diapositiva, il nome delle sezioni e il numero di 'Z' immagini seriali scattate.
- Utilizzare software 'ImageJ' per contare le cellule T CD4 + Dext in relazione al numero totale di cellule T CD4 +. Selezionare il 'tipo di contatore' in 'ImageJ, controllare e# 8216; mostra tutto 'e iniziare a contare cliccando il centro di ogni cella e continuare a contare in diversi' 'immagini seriali Z utilizzando le frecce laterali. Dopo aver contato tutte le cellule T CD4, scegliere un altro tipo di contatore e conta CD4 + DEXT + cellule T. Fare clic sulla scheda dei risultati per ottenere il numero totale di cellule contate con i due contatori diversi.
- Per ottenere il numero totale, aggiungere il numero di cellule in tutte le 'Z' immagini seriali che rappresentano tutte le tre sezioni cerebrali o tutte le otto sezioni cardiache.
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Representative Results
In questo rapporto, nella rilevazione in situ di antigene-specifiche, autoreattivi cellule T CD4 di colorazione diretto con MHC di classe II dextramers è descritto. Sezioni cerebrali appena tagliato sono state derivate da topi EAE e colorate con cocktail contenenti PLP 139-151 (controllo) dextramers e anti-CD4 (specifico) o TMEV 70-86. I primi pannelli in figura 1 mostra l'analisi LSCM di sezioni cerebrali costained con PLP 139-151 dextramers (rosso) e di anticorpi CD4 (verde), in cui le cellule doppio positive apparse giallo. Tale caratteristica era assente in sezioni colorate con TMEV 70-86 (controllo) dextramers (pannelli in basso). I (Dext + CD4 +), le cellule hanno mostrato costained punti puntiformi intorno alla periferia. Analisi quantitativa di cellule T specifiche per PLP nelle sezioni cerebrali coinvolti i seguenti passaggi (Figura 2): 1) Una sezione di tre coppie sono state effettuate, e una sezione di ciascuna coppia era macchiato individualmente con anti-CD4 e PLP 139-151 dextramers. Analogamente, un altro gruppo di tre sezioni sono state colorate con dextramers anti-CD4 e controllo (TMEV 70-86). 2) Da una data sezione, focolai infiammatori (10 a 15) sono stati identificati sulla base di anti-CD4 colorazione. 3) Una serie di immagini seriali 'Z' (15 a 25) sono stati prelevati da ciascun fuoco in sequenza dall'alto verso il basso con un intervallo di 2 micron tra ogni. In sostanza, da 10 a 15 insiemi simili di immagini in serie 'Z' che rappresentano un numero uguale di focolai infiammatori sono stati analizzati in ogni sezione. 4) le singole immagini, le cellule CD4 + (verde), le cellule positive per entrambi dextramers (rosso) e CD4 (verde), che apparivano le cellule puntiformi di colore giallo sono stati enumerati da loro marcatura individualmente utilizzando il software open source, ImageJ, e, infine, un totale complessivo è stato ottenuto per ciascuna sezione aggiungendo il numero di cellule contate in tutte le immagini seriali 'Z'. Dato che le cellule sono state marcate, la possibilità di raccontare le cellule in molteplici immagini che sonosovrapposizione è stato eliminato. Così, enumerazione affidabile Dext cellule + rispetto al numero totale di cellule che esprimono CD4 può essere raggiunto.
Questo studio è stato ulteriormente esteso per dimostrare l'uso di reagenti dextramer per rilevare cellule T antigene-sensibilizzati in situ in EAM indotto con MyHC 334-352 in topi A / J, che è anche un cellulo-mediata malattia T 13,14. Otto sezioni cardiaca associato stati ottenuti, ciascuno spessore 200 micron, da EAM topi (Figura 2). Da ogni coppia, una sezione (con un totale di 8 sezioni) è stato colorato con MyHC 334-352 dextramers e anti-CD4, mentre un altro gruppo di sezioni (8 in totale) è stato colorato con RNase 43-56 dextramers (controllo) e contro -CD4. Venti set di immagini seriali 'Z' corrispondenti a che molti focolai infiammatori rappresentano tutte le otto sezioni sono stati acquisiti sequenzialmente come sopra (Figura 2). Essenzialmente, un dato insieme di im seriale 'Z'età consisteva di 10-15 individuo rappresentato un unico focolaio infiammatorio. L'analisi di queste immagini di LSCM ha mostrato la presenza di cellule positive per MyHC 334-352 dextramers (rosso), e CD4 (verde) e da aspettarsi, le cellule legate con entrambi dextramers e CD4 apparso cellule puntiformi di colore giallo (Figura 3, pannelli superiori) . La colorazione di fondo per dextramers controllo era trascurabile (Figura 3, pannelli inferiori). Il numero totale di cellule T CD4 + + Dext e il numero totale di cellule T CD4 + sono stati determinati per ogni sezione e conteggi di tutte le sezioni sono stati aggiunti insieme per ricavare il numero totale per ogni sottoinsieme (Dext cellule + CD4 + T; CD4 + cellule T).
Figura 1. Rilevamento di PLP-specifiche cellule T CD4 da in situ colorazione con PLP 139-151 dextramers. EAE è stata indotta in topi SJL immunizzando gli animali con PLP 139-151 in CFA. Alla cessazione, cervelli raccolti da topi EAE sono stati incorporati nel 4% agarosio, e le sezioni sono state effettuate utilizzando vibratome. Dopo la colorazione con cocktail contenenti o PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 o TMEV 70-86 dextramers (controllo) / anti-CD4 e fissaggio con 4% paraformaldeide tamponata con PBS, le sezioni sono state lavate e montati per l'esame da LSCM. Pannelli superiori: due sezioni distinte colorati con PLP 139-151 dextramers/anti-CD4. Pannelli di fondo: due sezioni distinte colorati con TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. A sinistra: CD4, verde; Pannello centrale: dextramers, rosso; Pannello destro: unite (cellule frecce, Dext + CD4 + T). Ingrandimento originale 1.000 X (approvati:.. Massilamany et al, 2014 colorazione diretta con il maggiore di istocompatibilità di classe II Dextramers Consente Rilevamento di Antigen-Specific, Autoreattivi CD4 T cellulares In Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Sezioni Figura 2. Un approccio per quantificare le cellule Dext + nel cervello e nel cuore. Associati sono realizzati cervello o il cuore padiglione auricolare-escisse come indicato (gruppo 1). Una sezione da ciascuna coppia corrispondente agli organi indicati è stato designato per la colorazione con dextramers specifici (cervello, PLP 139-151 dextramers, cuore, MyHC 334-352 dextramers), e l'altra serie di sezioni per dextramers di controllo (cervello, TMEV 70 - 86, il cuore, RNase 43-56). Dopo il fissaggio e il montaggio, le sezioni sono state esaminate per individuare focolai infiammatori sulla base di colorazione con CD4 da LSCM (mag originalenification, 40X) (gruppo 2). Ogni focolaio infiammatorio come visualizzato in tridimensionale (3D) Vista (Pannello 3) è stato sottoposto a un insieme di 'Z' immagini seriali in sequenza (gruppo 4). In tutte le immagini, le cellule positive per entrambi dextramers specifiche o di controllo e CD4, o CD4 da solo sono stati contati utilizzando il software 'ImageJ' (approvato:.. Massilamany et al, 2014 colorazione diretta con il maggiore di istocompatibilità di classe II Dextramers Permessi Rilevamento di Antigen- Specifico, Autoreattivi CD4 cellule T In Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Rilevamento di cellule cardiache specifica-miosina CD4 T da in situ
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Discussion
A differenza di tetrameri MHC di classe, l'uso di MHC classe II tetrameri per applicazioni di routine continua ad essere impegnativo, soprattutto per enumerare le frequenze precursori di cellule T CD4 autoreattivi bassa affinità, dovute in parte alla loro dipendenza di attivazione 6,15-17. Recentemente, questo problema è stato aggirato con la creazione della prossima generazione di tetrameri, chiamati "dextramers," ci permette di rilevare le cellule antigene-specifiche CD4 T per un certo numero di antigeni, come il PLP 139-151, MOG 35-55 e MyHC 334 - 352 8. In questa relazione, per la prima volta, l'utilità di MHC classe II dextramers per individuare e quantificare le cellule autoreattive T CD4 in situ è stata dimostrata utilizzando sezioni di cervello di topi EAE, e sezioni del cuore di topi EAM. Su una base di reazione, dextramers offrono il vantaggio di richiedere una piccola quantità di complessi MHC / peptide. In questo protocollo, ogni reazione richiede solo 0,75 mg di monomeri MHC / peptide. Inoltre, staining con dextramers è una reazione a fase unica, poiché dextramers sono coincubated con anti-CD4, e l'intera procedura, dal tessuto sezionamento alle macchie, può essere finito in meno di un giorno. Al contrario, i protocolli pubblicati in situ per colorazione con tetrameri convenzionali comunemente coinvolgono procedure di amplificazione in cui i segnali fluorescenti vengono amplificati usando anticorpi secondari per fluorofori. Come risultato, le procedure di colorazione possono richiedere fino a tre giorni per completare 18-20.
Inoltre, l'uso di dextramers in sezioni cerebrali permette il rilevamento di cellule T antigene-specifiche profonde nelle sezioni di tessuto, anche fino a 50 pm. È stato osservato che PLP 139-151 Dext + cellule CD4 + sono stati trovati per essere collocata sia perivascolare e anche all'interno del parenchima. Inoltre, l'intensità dei segnali generati dal MyHC 334-352 dextramers era basso in sezioni cardiache rispetto ai PLP 139-151 dextramers in sec cervellozioni (Figura 1), e tale variazione può riflettere le caratteristiche uniche per ogni organo. Una tale variabile è il contenuto lipidico che è presente in elevate quantità nel tessuto cerebrale rispetto a tessuto cardiaco che contiene fibre muscolari striate principalmente che possono potenzialmente limitare facile diffusione di dextramers nel focolaio infiammatorio. A sostegno di questa nozione, MyHC 334-352 Dext + cellule sono state rilevate solo ad una profondità fino a 20 micron di maggioranza delle sezioni cardiache. Inoltre, MyHC 334-352 Dext + cellule erano presenti sparsi per tutto il miocardio che suggerisce la natura diffusa di infiltrati infiammatori nelle lesioni myocarditic.
Generalmente, due fattori principali possono influenzare negativamente la rilevazione di cellule T antigene-specifiche in situ da LSCM. In primo luogo, i segnali emessi dai fluorofori insufficienti possono portare alla necessità di amplificare i segnali utilizzando anticorpi fluoroforo. In secondo luogo, una macchia tale indirettaing può minare la specificità, come la colorazione di fondo per i reagenti di controllo può anche aumentare proporzionalmente 18,19. Queste limitazioni sono state eluse colorazione diretto con le dextramers. Sebbene, rilevamento di cellule T CD4 è stato dimostrato con successo con sezioni freschi, l'uso di reagenti dextramer nei tessuti congelati richiede ulteriori studi, che può essere una sfida la conservazione di tessuto-integrità può essere difficile a causa della tendenza per i tessuti di ottenere disintegrato durante le varie colorazione passi 18,19.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi sono stati dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association e dei Bambini Cardiomiopatia Foundation (SDG2462390204001), e il National Institutes of Health (HL114669). CM è un destinatario di una borsa di assegno di ricerca post-dottorato assegnato dalla Fondazione miocardite, NJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4 °C |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4 °C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4 °C |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4 °C |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 °C |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4 °C |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4 °C | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
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