Summary
El protocolo para detectar células autorreactivas T CD4 en el cerebro y el corazón mediante tinción directa con complejo mayor de histocompatibilidad de clase II dextramers se ha descrito en el presente informe. Para el análisis integral, un método fiable para enumerar las frecuencias de células T CD4 + específicas de antígeno in situ también se ideó.
Introduction
El uso de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II tetrámeros para la detección de las células CD4 T específicas de antígeno ha sido un reto 1-7. Para aumentar la sensibilidad de detección de MHC de clase II tetrámeros, el equipo de investigación ha creado tetrámeros de próxima generación, denominados "dextramers" 8. Dextramers contienen cadenas principales de dextrano en el que se conjugan múltiples restos de estreptavidina-fluoróforo, de manera que varios monómeros, MHC-péptido biotinilados atado se pueden unir a una molécula de dextrano 9. Por lo tanto, grandes agregados de dextramers MHC que contienen varios complejos de MHC-péptido pueden interactuar con múltiples receptores de células T (TCR).
Este grupo recientemente generada dextramers para diversos antígenos propios y demostró que la sensibilidad de detección de dextramers fue aproximadamente cinco veces más que los tetrámeros 8. Los sistemas experimentales incluyen encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida con proteína proteolípido (PLP) 139-151 en ratones SJL; EAE inducida con glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG) 35-55 en ratones C57BL / 6; y miocarditis autoinmune experimental (EAM) inducida con miosina cardíaca cadena pesada-α (MyHC) 334-352 en ratones A / J. Este estudio demuestra el uso de PLP139b151 - y MyHC 334-352 dextramers para detectar células T CD4 específicas de antígeno in situ con especificidad por el desarrollo de un protocolo de tinción directa, eliminando así la necesidad de amplificar las señales del uso de anticuerpos de fluoróforo, una enfoque empleado comúnmente con el uso de tetrámeros. Además, un método integral de evaluación de los tejidos también se ha ideado para enumerar de forma fiable las frecuencias de células T CD4 específicas de antígeno in situ 10. La detección de células T específicas de antígeno in situ permite la delineación de eventos causados por estímulos antigénicos específicos de las causadas por la activación espectador. Del mismo modo, la técnica de in situ en también providES oportunidades para realizar un seguimiento de la cinética de infiltraciones de células T específicas de antígeno en los órganos diana.
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Protocol
Declaración de Ética:
Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con las directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por la Universidad de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.
1. Inducción de la EAE
- Para inducir la EAE, preparar la emulsión péptido / adyuvante completo de Freund (CFA) como se describe en 11 con las siguientes modificaciones: Paso 1.1:. Preparar PLP139b151 a una concentración de 1 mg / ml en 1x tampón fosfato salino (PBS) Paso 1.4:. utilizar 200 l de CFA de emulsión que contiene 100 g de PLP139b151 por animal Paso 1.4.1: para inmunizar a diez animales, preparar 2 ml de emulsión mediante la mezcla de 1 ml de PLP139b151 (1 mg / ml en 1x . de PBS) y un volumen igual de CFA Paso 1.5: inyectar 200 l de emulsión en dosis divididas por vía subcutánea en las dos regiones inguinales (~ 75 l cada uno) y región esternal (~ 50 l) de cinco a seis semanas de edad femalos ratones le SJL / J. Los pasos 1.7 y 1.8 no son aplicables para la inducción de la EAE.
2. Puntuación clínica de ratones con EAE y recolección de cerebros
- Monitorear los animales para la aparición de signos clínicos, y la puntuación de la enfermedad-la gravedad todos los días de 9 días después de la vacunación de la siguiente manera: 0 - saludable; 1 - cojera cola o posterior debilidad de las extremidades, pero no tanto; 2 - cojera cola y posterior debilidad de las extremidades; 3 - parálisis parcial de las extremidades posteriores; 4 - parálisis completa de las extremidades posteriores; 5 - moribundos o muertos 12.
- La eutanasia a los ratones cuando alcanzan una puntuación neurológica de 3 o 4 utilizando CO 2. Para practicar la eutanasia a los ratones, pre-llenar la cámara de eutanasia primero con CO 2 girando el regulador del tanque de CO 2 no superior a 6 psi y permitir que los animales se queden dentro de la cámara durante aproximadamente 5 minutos para lograr la asfixia completa. Remojar los animales sacrificados en el 70% de alcohol. Inmediatamente, colocar los animales en una almohadilla absorbente y el uso de un par de estéril paraceps y tijeras exponen los corazones por el corte a través de la cavidad torácica. Perforar las aurículas derecha e perfundir inyectando 10 ml de frío 1 × PBS en los ventrículos izquierdos de los corazones.
- Excavar el cráneo al cortar el cráneo en forma circular con un par de tijeras curvas, y con cuidado, voltear los huesos del cráneo con unas pinzas. Se recoge el cerebro mediante disección roma y el uso de un bisturí limpio, cerebro separado del cerebelo. Coloque el cerebro en un tubo que contiene el frío 1 × PBS y dejar el tubo en hielo hasta su procesamiento.
3. In Situ La tinción de secciones cerebrales con MHC de clase II (IA s) / PLP139b151 Dextramers
- Preparar 4% tamponada con PBS bajo punto de fusión de agarosa, se funden por calentamiento a 50 ° C y se deja en un 40 ° C baño de agua hasta su uso.
- Coloque el cerebro en un cassette histología molde de base profunda desechable mantuvieron sobre hielo y vierta fundido (40 ° C) de agarosa. Inmediatamente, presione suavemente el cerebrocon unas pinzas para sumergir el tejido. Deje el cartucho en hielo durante 15-20 minutos hasta que la solidificación es completa.
- Llene la bañera con vibratome refrigerada 1x PBS. Llenar el espacio alrededor de vibratome baño con cubitos de hielo para mantener la temperatura de PBS entre 0 y 2 ° C. Fijar una hoja de afeitar limpia en el vibratome y ajuste el ángulo de la hoja a 15 °.
- Colocación del tejido en vibratome. Recorte el exceso de agarosa de todos los lados del tejido incrustado y exponer ligeramente la superficie ventral del cerebro.
- Unte vibratome bloque de tejido con pegamento y transferir el tejido e inmovilizado sobre la superficie encolada mediante la colocación de la superficie ventral expuesta del cerebro sobre el pegamento para la sección transversal. No mueva el tejido, una vez que el tejido se fija sobre el bloque.
- Coloque el bloque vibratome que contiene el tejido agarosa incrustados en el hielo, y permitir que el pegamento se seque durante 15 minutos.
- Mientras tanto, coloque la cámara de tejidoBers uno por pocillo de una placa de 24 pocillos. Llenar los pocillos que contienen las cámaras de tejido con 1 ml de PBS 1x frío, y dejar la placa en hielo.
- Preparar las cámaras de tejido uniendo una fina malla de nylon para el corte final de una pipeta de 25 ml de polipropileno utilizando pegamento; después de recortar el exceso de malla alrededor de la pipeta, cortar la pipeta a una longitud de 1 cm de la malla.
- Bajar la hoja vibrátomo al nivel de la superficie superior del tejido; establecer la velocidad vibratome a 0,22 mm / seg y empezar a cortar con un movimiento hacia adelante para hacer 200 micras de espesor secciones. Transferir una sección cerebral por pocillo usando un cepillo suave acuarela en las cámaras de tejidos colocados dentro de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Guarde la placa de hielo hasta el seccionamiento es completo para evitar la degradación de los tejidos. Nota: Siga estos pasos para obtener en tres secciones, el total de pares de tres regiones diferentes del cerebro dorsal a la superficie ventral (Figura 2). Una sección decada par (en total tres secciones) colocados en tres cámaras de tejido individuales se designan para la tinción con dextramers específicos (IA s / PLP 139-151) y anti-CD4. Del mismo modo, otro grupo de tres secciones que se colocan en tres cámaras de tejido individuales se designan para la tinción con dextramers control (IA s / TMEV 70-86) y anti-CD4.
- Transferencia de las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers específicos en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por pocillo en el que, 300 l de un cóctel que contiene aloficocianina (APC)-conjugados PLP139b151 dextramers (2,5 g / ml) y anti-CD4-ficoeritrina (PE; se añadió previamente 5 g / ml) en solución de bloqueo (1x PBS con 2% de suero normal de cabra). Cubrir los pocillos con una tapa.
- Del mismo modo, transferir las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers de control en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por nosotrosll en el cual, se añadió previamente 300 l de un cóctel que contiene TMEV APC-conjugado 70-86 dextramers (2,5 mg / ml) y anti-CD4-PE (5 mg / ml) en solución de bloqueo. Cubrir los pocillos con una tapa. Nota: Consulte Massilamany et al 8, para la preparación de dextramers, y las moléculas de dextrano para preparar dextramers fueron amablemente proporcionados por Immudex, Copenhague, Dinamarca..
- Etiquetar los pozos, y envolver el plato con papel de aluminio y coloque la placa en una plataforma oscilante fijado a las rotaciones suaves durante 1,5 horas en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Después del período de incubación, lavar las secciones de tejido en la plataforma oscilante, mediante la transferencia de las cámaras de tejido a un nuevo pocillo que contenía 1 ml de PBS 1x frío, y evitar el goteo los contenidos de un pocillo en el otro. Repita el lavado tres veces, dejando al menos 10 min por lavado. Asegúrese de que las secciones de tejido no se les secan, ya que pueden pegarse a las paredes de la cámara.
- Fijar las secciones mediante la transferencia de la cámara de tejidobros en un pozo fresco en placa de 24 pocillos que contenía 1 ml de filtrada paraformaldehído al 4% tamponada con PBS (pH 7,4) en una plataforma de agitación durante 2 horas con rotaciones suaves.
- Repita el lavado tres veces como se describe en el paso 3.10.
- Coloque las secciones teñidas y fijadas en un portaobjetos limpio con un cepillo suave acuarela. Limpie el exceso de agua sin tocar la sección, y montar la sección utilizando medio de montaje. Cubra con el cubreobjetos microscópica y deje que los portaobjetos se sequen a TA O / N en el cuarto oscuro.
- Almacenar los portaobjetos en una caja de almacenamiento de diapositivas a prueba de luz a 4 ° C.
4. Inducción de EAM y Colección de corazones
- Inducir EAM como se describe en la referencia 11.
- La eutanasia a los ratones en el día 21 después de la vacunación utilizando la cámara limpia equipado con CO 2 cilindro de gas, y disfrutar de los animales en el 70% de alcohol. Inmediatamente, colocar los animales en una almohadilla absorbente y utilizando un par de pinzas y tijeras exponer el corazóns cortando a través de la cavidad torácica. Perforar las aurículas derecha e perfundir inyectando 10 ml de frío 1 × PBS en los ventrículos izquierdos de los corazones. Recoge los corazones y lugar en tubos que contienen frío 1 × PBS.
5. In Situ La tinción de las secciones de corazón con MHC de clase II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers
- Preparar 4% PBS-tampón bajo punto de fusión de agarosa, se funden por calentamiento a 50 ° C y se deja en un 40 ° C baño de agua hasta su uso.
- Coloque el corazón en un casete desechable profunda histología molde de base se mantuvo en hielo, y se vierte fundida 40 ° C agarosa hasta que los tejidos estén completamente sumergidos como se describe en el paso 3.2.
- Siga el paso 3.3.
- Recorte el exceso de agarosa de todos los lados del tejido incrustado y exponer ligeramente la base del corazón. Frotis de vibratome bloque de tejido con pegamento y transferir el tejido de agarosa-incrustado sobre la superficie pegada, mediante la colocación de la superficie expuesta de lacorazón sobre el pegamento. No mueva el tejido, una vez que el tejido se fija sobre el bloque.
- Coloque el bloque vibratome que contiene el tejido agarosa incrustados en el hielo, y permitir que el pegamento se seque durante 15 minutos.
- Siga los pasos 3.5 y 3.6.
- Transferir las secciones del corazón usando un cepillo suave acuarela en las cámaras de tejidos colocados dentro de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Mantener la placa en hielo hasta el seccionamiento es completa para prevenir la degradación del tejido. Nota: Siga estos pasos para obtener en total, ocho secciones emparejadas desde el vértice hasta la base del corazón (Figura 2). Coloque todas las secciones de cámaras de tejido, la asignación de hasta 3 secciones por cámara. Una sección de cada par (un total de ocho secciones) se designa para la tinción con dextramers específicos (IA K / MyHC 334 a 352) y anti-CD4. Del mismo modo, otro conjunto de ocho secciones se designa para la tinción con dextramers control (IA k / RNasa 43-56) y anti-CD4.
- Transferir eltres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers específicos en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por pocillo en el que, 300 l de un cóctel que contiene APC-conjugados MyHC 334-352 dextramers (2,5 g / ml) y anti-CD4-PE (5 g / ml) en solución de bloqueo se añadió previamente. Cubrir los pocillos con una tapa.
- Del mismo modo, transferir las tres cámaras de tejido que contienen las secciones designadas para la tinción con dextramers de control en tres pozos en una placa de 24 pocillos con una cámara por pocillo en el que, 300 l de un cóctel que contiene RNasa APC-conjugado 43-56 dextramers (2,5 microgramos / ml) y anti-CD4-PE (5 g / ml) en solución de bloqueo se añadió previamente. Cubrir los pocillos con una tapa.
- Etiquetar los pozos, y envolver el plato con papel de aluminio y coloque la placa en una plataforma oscilante fijado a las rotaciones suaves durante 1,5 horas en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Siga los pasos, 3.10 a 3.11
- THR lavado Repitahielo, como se describe en el paso 3.10.
- Coloque las secciones teñidas y fijos (hasta tres secciones / diapositivas) en un portaobjetos de microscopio limpio con un cepillo suave acuarela. Limpie el exceso de agua sin tocar las secciones, y montar las secciones utilizando medio de montaje. Cubra con el cubreobjetos microscópica y deje que los portaobjetos se sequen a TA O / N en el cuarto oscuro.
- Almacenar los portaobjetos en una caja de almacenamiento de diapositivas a prueba de luz a las 4 ° C.
6. Análisis de Dextramer + (Dext +) las células T CD4 + por láser confocal de barrido microscopio (LSCM) (común a las dos secciones del cerebro y del corazón)
- Utilice Nikon A1-Eclipse sistema de microscopía confocal 90i para el escaneo de rutina y adquisición de imágenes. Para iniciar haga clic en Abrir, el software NIS Elementos AR (versión 4.13).
- Elija "TRITC" y canales "Cy5" del panel. Las longitudes de onda de excitación / emisión, respectivamente, para los canales de TRITC y Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm y 640,7 nm / 663-738 nm aparece de forma predeterminada.
- Asigne la pseudocolors "verde" y "rojo" para el TRITC (CD4-PE) y Cy5 (dextramer-APC) canales, respectivamente.
- Coloque la diapositiva para ser examinado en la fase microscópica y enfoque manualmente bajo un aumento de 100X. Ajuste el "HV" para 110 y compensar a "0". Haga clic en "Focus" y ajuste el "voltaje" para optimizar los lasers.
- Haga clic en "Focus"; escanear la sección de arriba a abajo, y ajuste el nivel 'Z' para la adquisición de imágenes. Haga clic en "serie CH" y adquirir la secuencia de imágenes. Identificar Dext + células T CD4 + que aparece como células puntiformes de color amarillo sobre la base de co-localización de las señales generadas a partir de tanto los canales rojo (dextramers) y verde (CD4).
- Utilice Olympus FV500-BX60 microscopio confocal para la enumeración cuantitativa fácil de las células T CD4 + + DEXT. Para empezarhaga clic en abierto, el software Fluoview (versión 4.3).
- Seleccione el tintes "Cy3" y "Cy5" en el menú desplegable, y haga clic en "Aplicar" para cargar los respectivos láseres. Nota: las longitudes de onda de excitación / emisión para Cy3 (543 nm / pseudocoloreada "verde"; CD4-PE); canales y Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocoloreada "rojo").
- Coloque la diapositiva para ser examinado en el portaobjetos de microscopio y se enfoque de forma manual a baja magnificación (4X o 10X). Haga clic en "Focus", mientras que el láser Cy3 está encendido, y se centran el foco inflamatorio.
- Cambie el objetivo de un aumento de 100X. Ajuste el tamaño del archivo a "512/512" en el menú desplegable. Haga clic en "Focus" y ajuste los valores para "PMT", "ganancia" y "Offset" parámetros para optimizar los láseres por separado para Cy3 y Cy5.
- Haga clic en "fase Z" y luego haga clic en "Focus", mientras tanto los láseres están encendidas. Conjuntoel espesor de la "etapa Z" haciendo clic en las flechas "abajo" "arriba" y. Establezca el intervalo de "Z" a 2 micras.
- Haga clic en "Stop", y seleccione "Seq123". A continuación, haga clic en "XYZ" y comenzar la adquisición de imágenes de la serie "Z" para el área seleccionada en el foco inflamatorio. Guarde los "Z imágenes en serie" como archivos AVI. Para guardar archivos de imágenes, seleccione la imagen de la "Z imagen de serie", y luego guardarlo en formato "tiff".
- Examine tres secciones emparejadas del cerebro donde se tiñó de un conjunto de tres secciones con IA s / PLP139b151 dextramers/anti-CD4 y el otro conjunto de tres secciones con IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 realizar análisis cuantitativo.
- Del mismo modo, analizar ocho secciones emparejadas para el corazón, en el cual, un conjunto de ocho secciones se tiñeron con IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 y otro sít de ocho secciones con RNasa 43-56 dextramers/anti-CD4.
- Examine 10 a 15 focos inflamatorios por sección en cerebro, y en cada foco, adquirir un conjunto de 15 a 25 imágenes en serie secuencialmente.
- Examine un total de 20 focos inflamatorios de todas las ocho secciones de corazón y de cada foco adquirir de 10 a 15 imágenes en serie secuencialmente. Tome los 'Z' imágenes en serie mediante el escaneo de las diapositivas en un movimiento "horizontal-vertical-up horizontal-vertical hacia abajo" de manera que se evite la repetición de la serie 'Z' dentro del mismo enfoque.
- Una vez que las imágenes de serie 'Z' son capturados, el nombre de los archivos mediante la identificación de los números de diapositiva, el nombre de las secciones y el número de los 'Z' imágenes seriadas tomadas.
- Utilice el software 'ImageJ' para contar las células T CD4 + + DEXT en relación con el número total de células T CD4 +. Seleccione la opción "tipo de contador 'en' ImageJ, comprobar y# 8216; mostrar todos 'y empezar a contar haciendo clic en el centro de cada célula y seguir contando en diferentes' Z 'imágenes en serie utilizando las flechas laterales. Después de contar a todas las células T CD4, elige otro tipo de contador y contar el + en las células T CD4 + Dext. Haga clic en la ficha de resultados para obtener el número total de células contadas con los dos contadores diferentes.
- Para obtener el número total, agregue el número de células en todos los 'Z' imágenes en serie que representan a todas las tres secciones cerebrales o las ocho secciones del corazón.
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Representative Results
En este informe, la detección in situ de antígeno-específica, autoreactive células T CD4 por tinción directa con MHC de clase II dextramers se describe. Secciones cerebrales Corte recientemente se obtuvieron a partir de ratones con EAE y se tiñeron con cócteles que contienen PLP139b151 (control) dextramers y anti-CD4 (específica) o TMEV 70-86. Los paneles superiores de la Figura 1 muestra el análisis de secciones cerebrales LSCM costained con PLP 139-151 dextramers (rojo) y de anticuerpos CD4 (verde), donde aparecieron amarillo las células doble positivas. Esta característica estuvo ausente en las secciones teñidas con TMEV 70-86 dextramers (control) (paneles inferiores). Las células costained (DEXT + CD4 +) mostraron puntos puntiformes alrededor de la periferia. El análisis cuantitativo de las células T-PLP específica en las secciones cerebrales implicado las siguientes etapas (Figura 2): 1) Se hicieron secciones de tres pares, y una sección de cada par se tiñeron de forma individual con anti-CD4 y PLP 139-151 dextramers. Del mismo modo, otro conjunto de tres secciones se tiñeron con dextramers anti-CD4 y control (TMEV 70-86). 2) A partir de una sección dada, focos inflamatorios (10 a 15) se identificaron basándose en la tinción anti-CD4. 3) Un conjunto de imágenes 'Z' de serie (de 15 a 25) se tomaron de cada uno secuencialmente enfoque de arriba hacia abajo con un intervalo de 2 m entre cada una. En esencia, se analizaron 10 a 15 conjuntos similares de imágenes en serie 'Z' representan a igual número de focos inflamatorios en cada sección. 4) En las imágenes individuales, células CD4 + (verde), las células positivas para ambos dextramers (rojo) y CD4 (verde), que aparecieron células puntiformes como amarillos fueron enumerados marcando cada uno individualmente utilizando el software de código abierto, ImageJ, y finalmente, un gran total se obtuvo para cada sección sumando el número de células contadas en todas las 'Z' imágenes en serie. Debido a que las células fueron marcadas, la posibilidad de contar las células en múltiples imágenes que estánsuperposición fue eliminado. Por lo tanto, la enumeración fiable de DEXT + células en relación con el número total de células que expresan CD4 se puede lograr.
Este estudio se amplió para demostrar el uso de reactivos dextramer para la detección de células T antígeno sensibilizado in situ en inducida con MyHC 334-352 en ratones A / J, que es también una enfermedad mediada por células T 13,14 EAM. Se obtuvieron ocho secciones del corazón emparejados, cada 200 m de espesor, a partir de ratones EAM (Figura 2). De cada par, una sección (con un total de 8 secciones) se tiñó con MyHC 334-352 dextramers y anti-CD4, mientras que otro conjunto de secciones (8 en total) se tiñó con RNasa 43-56 dextramers (control) y contra -CD4. Veinte conjuntos de imágenes en serie 'Z' correspondientes a que muchos focos inflamatorios que representa las ocho secciones fueron adquiridos secuencialmente que la anterior (Figura 2). En esencia, un conjunto dado de im serie 'Z'edades consistieron de 10 a 15 individuo representado un solo foco inflamatorio. El análisis de estas imágenes por LSCM mostró la presencia de células positivas para MyHC 334-352 dextramers (rojo), y CD4 (verde) y como era de esperar, las células unidas con ambas dextramers y CD4 apareció células puntiformes como amarillo (Figura 3, paneles superiores) . La tinción de fondo para dextramers de control fue insignificante (Figura 3, paneles inferiores). Los números totales de células T CD4 + + DEXT y el número total de células T CD4 + se determinaron para cada sección y los recuentos de todas las secciones se añadieron juntos para obtener el número total de cada subconjunto (células T CD4 + + DEXT; CD4 + células T).
Figura 1. La detección de células específicas de PLP-T CD4 por in situ tinción con PLP139b151 dextramers. Se indujo EAE en ratones SJL mediante la inmunización de los animales con PLP139b151 en CFA. A la terminación, cerebros obtenidos de los ratones EAE fueron incorporados en 4% de agarosa, y las secciones se hicieron usando vibrátomo. Después de la tinción con cócteles que contienen ya sea PLP139b151 dextramers/anti-CD4 o TMEV 70-86 dextramers (de control) / anti-CD4 y la fijación con paraformaldehído al 4% tamponada con PBS, las secciones se lavaron y se montaron para su examen por LSCM. Paneles superiores: dos secciones separadas teñidas con PLP139b151 dextramers/anti-CD4. Los paneles inferiores: dos secciones separadas teñidas con TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. Panel izquierdo: CD4, verde; El panel medio: dextramers, rojo; Panel derecho: se ha unido (células flechas, DEXT + T CD4 +). Magnificación original X 1000 (adoptado:.. Massilamany et al, 2014 La tinción directa con el mayor de histocompatibilidad de clase II Dextramers permite la detección de antígeno-específica, Autoreactive CD4 de células Ts In Situ PLOS ONE 9 (1):.. e87519) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Secciones Figura 2. Un método para cuantificar las células DEXT + en el cerebro y el corazón. Vinculados se hicieron a partir de cerebro o el corazón aurícula-extirpados como se muestra (Grupo 1). Una sección de cada par correspondiente a los órganos indicados fue designado para la tinción con dextramers específicos (cerebro, PLP139b151 dextramers; corazón, MyHC 334-352 dextramers), y el otro conjunto de secciones para dextramers de control (cerebro, TMEV 70 - 86; corazón, RNasa 43-56). Después de la fijación y el montaje, se examinaron las secciones para localizar focos inflamatorios basado en la tinción con CD4 por LSCM (MAG originalesnification, 40X) (Grupo 2). Cada foco inflamatorio como se visualiza en tres dimensiones vista (3D) (Grupo 3) se sometió a una serie de imágenes en serie secuencial 'Z' (Grupo 4). En todas las imágenes, las células positivas tanto para el control específico o dextramers y CD4 o linfocitos CD4 solo se contaron usando software 'ImageJ' (adoptada:.. Massilamany et al, 2014 La tinción directa con el Mayor de Histocompatibilidad Dextramers clase II permite la detección de antígeno- Específico, células autorreactivas T CD4 In Situ PLOS ONE 9 (1):.. e87519) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Detección de las células cardíacas-miosina específica T CD4 por in situ
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Discussion
A diferencia de tetrámeros de MHC de clase I, el uso de MHC de clase II tetrámeros para aplicaciones de rutina sigue siendo un reto, especialmente para enumerar las frecuencias precursoras de baja afinidad autorreactivos células T CD4, debido en parte a su dependencia de activación 6,15-17. Recientemente, este problema se evitó mediante la creación de la próxima generación de tetrámeros, llamado "dextramers," que nos permite detectar células T CD4 específicas de antígeno para un número de autoantígenos, como PLP139b151, MOG 35-55 y MyHC 334 - 352 8. En este informe, por primera vez, la utilidad de MHC de clase II dextramers para detectar y cuantificar células autorreactivas T CD4 in situ se ha demostrado utilizando secciones de cerebro de ratones con EAE, y las secciones de corazón de los ratones EAM. Sobre una base de reacción, dextramers ofrecen la ventaja de que requiere una pequeña cantidad de complejos de MHC / péptido. En este protocolo, cada reacción requiere sólo 0,75 g de monómeros de MHC / péptido. Además, stanando con dextramers es una reacción de un solo paso, ya que dextramers se coincubaron con anti-CD4, y todo el procedimiento, a partir de tejido de seccionamiento de la tinción, se puede terminar en menos de un día. En contraste, los protocolos publicados para tinción in situ con tetrámeros convencionales comúnmente implican procedimientos de amplificación en la que las señales fluorescentes se amplificó usando anticuerpos secundarios para fluoróforos. Como resultado, los procedimientos de tinción pueden tomar hasta tres días para terminar 18-20.
Además, el uso de dextramers en secciones cerebrales permite la detección de células T específicas de antígeno de profundidad en las secciones de tejido, incluso hasta 50 micras. Se señaló que se encontraron PLP 139-151 DEXT + células CD4 + que se encuentra tanto perivascularmente y también dentro del parénquima. Además, la intensidad de las señales generadas a partir de MyHC 334-352 dextramers fue baja en las secciones cardiacas en comparación con los PLP139b151 dextramers en seg cerebrones (Figura 1), y dicha variación puede reflejar las características propias de cada órgano. Una de estas variables es el contenido de lípidos que está presente en altas cantidades en el tejido cerebral en comparación con el tejido cardiaco que contiene fibras musculares estriadas principalmente que potencialmente pueden restringir fácil difusión de dextramers en el foco inflamatorio. En apoyo de esta idea, MyHC 334-352 células DEXT + sólo se detectaron a una profundidad de hasta 20 m en la mayoría de las secciones cardiacas. Además, MyHC 334-352 células DEXT + estaban presentes dispersos a lo largo del miocardio que sugiere la naturaleza difusa de infiltrados inflamatorios en lesiones miocárdico.
Generalmente, dos factores principales pueden influir negativamente en la detección de células T específicas de antígeno in situ por LSCM. En primer lugar, las señales emitidas por la insuficiencia de fluoróforos pueden conducir a la necesidad de amplificar las señales utilizando anticuerpos fluoróforo. En segundo lugar, una mancha tan indirectación puede socavar la especificidad, como la tinción de fondo para los reactivos de control también puede aumentar proporcionalmente 18,19. Estas limitaciones se eludieron mediante tinción directa con los dextramers. Aunque, la detección de las células T CD4 se ha demostrado con éxito con secciones frescas, el uso de reactivos dextramer en tejidos congelados requiere estudios adicionales, que pueden ser un reto, ya la retención de tejido integridad puede ser difícil debido a la tendencia de los tejidos para obtener desintegrado durante varios pasos tinción 18,19.
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Disclosures
Se declararon no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Miocardiopatía la Fundación del Niño (SDG2462390204001) American Heart Association y, y los Institutos Nacionales de Salud (HL114669). CM es un beneficiario de una beca de investigación postdoctoral concedida por la Fundación La miocarditis, NJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4 °C |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4 °C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4 °C |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4 °C |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 °C |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4 °C |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4 °C | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
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