Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Situ Påvisning av autoreaktive CD4 T-celler i hjernen og hjertet Bruke store histocompatibility komplekse klasse II Dextramers

Published: August 1, 2014 doi: 10.3791/51679
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 2, 1
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

Summary

Protokollen for å oppdage selvreaktive CD4 T-celler i hjernen og hjertet ved direkte farging med store histocompatibility komplekse klasse II dextramers har blitt beskrevet i denne rapporten. For fullstendig analyse, er en pålitelig metode for å nummerere frekvensene av antigen-spesifikke CD4 + T-celler in situ også utviklet.

Introduction

Bruken av store histocompatibility complex (MHC) klasse II-tetramerer for påvisning av antigen-spesifikke CD4-T-celler har vært en utfordring 1-7. For å forbedre følsomhet av MHC klasse II tetramers, har forskerteamet opprettet neste generasjons tetramers, betegnet "dextramers" 8. Dextramers inneholder dekstran-ryggrader i hvilke flere streptavidin-fluoroforen delene er konjugert, slik at flere peptid-bundet, biotinylerte MHC-monomerer kan være festet til ett molekyl dekstran 9.. Således kan store aggregater av MHC dextramers som inneholder flere MHC-peptid-komplekser kommunisere med flere T-celle-reseptorer (TCR).

Denne gruppen nylig generert dextramers for ulike selv-antigener og demonstrert at følsomhet for dextramers var omtrent fem ganger mer enn tetramers åtte. De eksperimentelle systemer inkluderer eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) indusert med proteolipid protein (PLP) 139-151 i SJL mus; EAE indusert med myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) 35-55 i C57BL / 6 mus; og eksperimentell autoimmun myokarditt (EAM) indusert med hjertestans myosin heavy kjede-α (Myhc) 334-352 i A / J mus. Denne studien viser bruken av PLP 139-151 - og Myhc 334-352 dextramers å påvise antigen-spesifikke CD4-T-celler in situ med spesifisitet ved å utvikle et direkte fargingsprotokoll, og dermed eliminere behovet for å forsterke signalene fra å bruke fluoroforen antistoffer, et nærme seg vanligvis blir anvendt ved bruk av tetramerer. I tillegg er det en omfattende fremgangsmåte for å evaluere vev har også blitt utviklet for å på en pålitelig måte å nummerere frekvensene av antigen-spesifikke CD4 T-celler in situ 10. Påvisning av antigen-spesifikke T-celler in situ tillater avgrensning av hendelser forårsaket av spesifikke antigene stimuli fra de som er forårsaket av bystander aktivering. Likeledes, den in situ teknikk også kundenees muligheter for å spore kinetikken av antigen-spesifikke T-celle-infiltrasjon i målorganene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk Uttalelse:

Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjer for Care og bruk av forsøksdyr, og godkjent av University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

En. Induksjon av EAE

  1. For å indusere EAE, klar peptidet / Freunds fullstendige adjuvans (CFA) emulsjonen som beskrevet i 11 med de følgende modifikasjoner: Trinn 1.1:. Forberede PLP 139-151 i en konsentrasjon på 1 mg / ml i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) Trinn 1.4:. bruke 200 pl av CFA emulsjon inneholdende 100 pg av PLP 139-151 per dyr Trinn 1.4.1: å immunisere ti dyr, forberede 2 ml av emulsjonen ved å blande 1 ml av PLP 139-151 (1 mg / ml i 1x . PBS), og et likt volum CFA Trinn 1.5: injisere 200 ul av emulsjon i splitt doser subkutant i de to inguinale områder (~ 75 mL hver) og sternal region (~ 50 mL) av fem-til-seks uker gamle FEMAle SJL / J mus. Trinn 1,7 og 1,8 er ikke aktuelt for induksjon av EAE.

2. Klinisk Scoring av EAE Mus og høsting av Cerebrums

  1. Overvåk dyrene for utseendet av kliniske tegn, og scorer sykdoms alvorlighetsgrad daglig fra dag 9 postimmunization som følger: 0 - sunt; 1 - halte hale eller hind lem svakhet, men ikke begge deler; 2 - slapp halen og hind lem svakhet; 3 - delvis lammelse av bakben; 4 - fullstendig lammelse av bakben; 5 - døende eller døde 12.
  2. Avlive mus når de når en nevrologisk score på 3 eller 4 ved bruk av CO 2. For å avlive mus, pre-fylle dødshjelp kammeret først med CO 2 ved å dreie regulatoren av CO 2 tank som ikke overstiger 6 psi og tillater dyr å bo i kammeret for ca 5 min for å oppnå komplett asfyksi. Bløtlegg avlives dyrene i 70% alkohol. Umiddelbart, plasseres dyrene på en absorberende pute, og ved hjelp av et par av sterilt isteinsopp og sakser eksponere hjerter ved å skjære gjennom brysthulen. Punktering de riktige auricles og perfuse ved å injisere 10 ml kald 1x PBS inn i venstre ventrikkel av hjertene.
  3. Grave skallen tene kraniet i en sirkulær måte ved hjelp av et par buede saks, og nøye, flip kraniet med tang. Høste hjernen ved stump disseksjon og bruk en ren skalpell, separat hjernen fra lillehjernen. Plasser cerebrum i et rør inneholdende kald 1 x PBS og la røret på is inntil behandling.

Tre. In Situ Farging av Cerebral Seksjoner med MHC klasse II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Forbered 4% PBS-buffer lav-smeltende agarose, smelte ved oppvarming ved 50 ° C og lar den stå i et 40 ° C vannbad inntil bruk.
  2. Plasser hjernen i en disponibel dyp bunn mold histologi kassett holdt over is, og hell smeltet (40 ° C) agarose. Umiddelbart, trykker storhjernen forsiktigmed tenger for å senke vevet. La kassetten på is i 15-20 minutter helt til størkningen er fullført.
  3. Fyll vibratome bad med kjølt 1x PBS. Fylle rommet rundt vibratome bad med isbiter for å opprettholde temperaturen i PBS mellom 0 og 2 ° C. Løs et rent barberblad inn i vibratome og sette bladvinkel til 15 °.
  4. Plassering av vev i vibratome. Trim skytende agarose fra alle sider av den innebygde tissue og litt eksponere den ventrale overflaten av storhjernen.
    1. Smør vibratome vevsblokk med super lim og overføre agarose-innebygde tissue over limt overflate ved å plassere den eksponerte ventrale overflaten av cerebrum over lim for tverrgående snitt. Beveg ikke vevet når vevet ligger over blokken.
    2. Plasser vibratome blokk inneholdende agarose-innebygde tissue på is, og la limet tørke i 15 min.
  5. I mellomtiden, plasserer vevet chammene en per brønn av en 24-brønns plate. Fyll brønnene inneholdende vev kamre med 1 ml kald 1 x PBS, og la platen på is.
    1. Forbered vevet kamre ved å feste en tynn nylon mesh til cut-enden av en 25 ml polypropylen pipette bruker superlim; etter trimming av overflødig mesh rundt pipette, kuttet pipetten til en lengde på 1 cm fra nettingen.
  6. Senk vibratome bladet til nivået for den øvre overflate av vev; sette vibratome hastighet til 0,22 mm / sek og starte seksjonering med en bevegelse fremover for å gjøre 200 mikrometer tykke seksjoner. Overfør en cerebral seksjon per brønn med vannfarge myk børste i vevet kamrene plassert i brønnene til en 24-brønns plate. Hold platen på is til seksjonering er fullført for å forhindre vev degradering. Merk: Følg disse trinnene for å oppnå totalt, tre sammenkoblede seksjoner fra tre ulike regioner av hjernen dorsal til ventral overflaten (figur 2). En del frahvert par (totalt tre seksjoner) plassert på tre individuelle vev kamre er utpekt for farging med spesifikke dextramers (IA s / PLP 139-151) og anti-CD4. Likeledes blir et annet sett av tre deler som er plassert i tre individuelle vev kamre utformet for farging med kontroll dextramers (IA s / TMEV 70-86), og anti-CD4.
  7. Overfør de tre vev kamre inneholdende seksjoner som er beregnet for farging med spesifikke dextramers i tre brønner i en 24-brønns plate med et kammer per brønn i hvor, 300 ul av en cocktail som inneholder allophycocyanin (APC)-konjugert PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) og anti-CD4-phycoerythrin (PE, 5 ug / ml) i blokkeringsoppløsning (1 x PBS med 2% normalt geiteserum) ble tidligere tilsatt. Dekk til brønnene med et lokk.
  8. Tilsvarende, overføre de tre vev kamre som inneholder de delene utpekt for farging med kontroll dextramers inn i tre brønner i en 24-brønns plate med ett kammer per vill hvori, ble 300 pl av en cocktail som inneholder APC-konjugert TMEV 70-86 dextramers (2,5 pg / ml) og anti-CD4-PE (5 ug / ml) i blokkeringsløsning tidligere er tilsatt. Dekk til brønnene med et lokk. Merk: Se Massilamany et al, 8 for utarbeidelse av dextramers, og dekstran molekyler å forberede dextramers var vennlig levert av Immudex, København, Danmark..
  9. Etiketten brønnene, og vikle den plate med aluminiumsfolie og plassere platen på en gyngende plattform satt til milde rotasjoner i 1,5 time i mørke ved RT.
  10. Etter inkubasjonsperioden, vaskes vevssnitt på vippeplattformen, ved å overføre vevet kamrene til en frisk brønn som inneholder 1 ml kald 1 x PBS, og unngå dribbling innholdet av en brønn inn i den andre. Gjenta vasking tre ganger, slik at i det minste 10 minutter per vask. Sørg for at vevsdelene ikke får tørket som de kan holde seg til sidene av kammeret.
  11. Fix seksjonene ved å overføre vev chammene til en frisk brønn i 24-brønners plate inneholdende 1 ml av filtrert PBS-4% bufret paraformaldehyd (pH 7,4) på ​​en gyngende plattform i 2 timer med forsiktig rotasjon.
  12. Gjenta vaske tre ganger som beskrevet i trinn 3.10.
  13. Plasser de fargede og faste deler på en ren mikroskopisk lysbilde ved hjelp av en akvarell myk børste. Tørk overflødig vann uten å berøre den delen, og montere den delen ved å bruke monteringsmedium. Dekk med et mikroskopisk dekkglass og la lysbildene tørke ved RT O / N i det mørke rommet.
  14. Oppbevar lysbildene i en lys-bevis lysbilde oppbevaringsboks ved 4 ° C.

4. Induksjon av EAM og Collection of Hearts

  1. Fremkall EAM som beskrevet i referanse 11.
  2. Avlive mus på dag 21 postimmunization med rent kammer utstyrt med CO 2 gassflaske, og suge dyrene i 70% alkohol. Umiddelbart plassere dyrene på en absorberende pute og bruke en pinsett og saks utsette hjertets ved å skjære gjennom brysthulen. Punktering de riktige auricles og perfuse ved å injisere 10 ml kald 1x PBS inn i venstre ventrikkel av hjertene. Samle hjerter og sted i rør som inneholder kald 1x PBS.

5. In Situ Farging av Hjerte Seksjoner med MHC klasse II (IA k) / Myhc 334-352 Dextramers

  1. Forbered 4% PBS-buffer med lav smelte agarose, smelte ved oppvarming ved 50 ° C og lar den stå i en 40   ° C vannbad inntil bruk.
  2. Plasser hjertet i en disponibel fordypninger form histologi kassetten holdes på is, og helle smeltet ved 40 ° C agarose inntil vevet er fullstendig neddykket, som beskrevet i trinn 3.2.
  3. Følg trinn 3.3.
  4. Trim skytende agarose fra alle sider av den innebygde tissue og litt eksponere undersiden av hjertet. Smør vibratome vevsblokk med super lim og overføre agarose-innebygde tissue over limt overflate ved å plassere den eksponerte overflate avhjerte over limet. Beveg ikke vevet når vevet ligger over blokken.
    1. Plasser vibratome blokk inneholdende agarose-innebygde tissue på is, og la limet tørke i 15 min.
  5. Følg trinn 3,5 og 3,6.
  6. Overfør hjerteseksjoner ved hjelp av en vannfarge myk børste i vevet kamrene plassert i brønnene til en 24-brønns plate. Hold platen på is til seksjonering er fullført for å hindre nedbrytning av vev. Merk: Følg disse trinnene for å få tak i totalt åtte parede seksjoner fra toppen til bunnen av hjertet (figur 2). Legg alle delene i vev kamre, fordele opp til tre seksjoner pr kammer. En del fra hvert par (totalt åtte seksjoner) er utpekt for farging med spesifikke dextramers (IA k / Myhc 334-352) og anti-CD4. Likeledes er et annet sett av åtte seksjoner utpekt for farging med kontroll dextramers (IA k / RNase 43-56) og anti-CD4.
  7. Overførtre vev-kammere inneholdende seksjoner som er beregnet for farging med spesifikke dextramers i tre brønner i en 24-brønns plate med et kammer per brønn i hvor, 300 ul av en cocktail som inneholder APC-konjugerte Myhc 334-352 dextramers (2,5 pg / ml) og anti-CD4-PE (5 ug / ml) i blokkerende oppløsning ble tidligere tilsatt. Dekk til brønnene med et lokk.
    1. Likeledes overfører de tre vev kamre inneholdende seksjoner som er beregnet for farging med kontroll dextramers i tre brønner i en 24-brønns plate med et kammer per brønn i hvor, 300 ul av en cocktail som inneholder APC-konjugert RNase 43-56 dextramers (2,5 ug / ml) og anti-CD4-PE (5 ug / ml) i blokkerende oppløsning ble tidligere tilsatt. Dekk til brønnene med et lokk.
  8. Etiketten brønnene, og vikle den plate med aluminiumsfolie og plassere platen på en gyngende plattform satt til milde rotasjoner i 1,5 time i mørke ved RT.
  9. Følg trinn, 03.10 til 03.11
  10. Gjenta vasking thrisen som beskrevet i trinn 3.10.
  11. Plasser de fargede og faste seksjoner (opptil tre seksjoner / lysbilde) på en ren mikroskopisk lysbilde ved hjelp av en akvarell myk børste. Tørk overflødig vann uten å berøre deler, og montere de delene ved hjelp av monteringsmedium. Dekk med et mikroskopisk dekkglass og la lysbildene tørke ved RT O / N i det mørke rommet.
  12. Oppbevar lysbildene i en lys-bevis lysbilde oppbevaringsboks på fire ° C.

6. Analyse av Dextramer + (dext +) CD4 + T celler ved Laser Scanning konfokalmikroskop (LSCM) (felles for både hjernen og hjertet Seksjoner)

  1. Bruk Nikon A1-Eclipse 90i konfokal mikroskop system for rutinemessig skanning og kjøp av bilder. For å starte Klikk åpen, NIS Elements AR programvaren (versjon 4.13).
    1. Velg "TRITC" og "Cy5" kanaler fra panelet. De eksitasjon / utslipp bølgelengder henholdsvis for TRITC og Cy5 kanaler, 561,5 nm / 553-618 nm og 640,7 nm / 663-738 nm vises som standard.
    2. Tildele pseudocolors "grønn" og "rød" for TRITC (CD4-PE) og Cy5 (dextramer-APC) kanaler, henholdsvis.
    3. Plasser lysbildet for å bli undersøkt på mikroskopisk scene og fokusere manuelt i henhold 100X forstørrelse. Still "HV" til 110 og utlignet til "0". Klikk på "Focus" og juster "spenning" for å optimalisere lasere.
    4. Klikk på "Focus"; skanne-delen fra topp til bunn, og sette 'Z' nivå for bildeopptak. Klikk på "CH-serien" og hente bildet sekvensielt. Identifiser dext + CD4 + T celler vises som gule punctate celler basert på samlokalisering av signaler generert fra både den røde (dextramers) og grønn (CD4) kanaler.
  2. Bruk Olympus FV500-BX60 konfokalmikroskop for enkel kvantitativ opplisting av Dext + CD4 + T celler. Til å begynneklikk åpen, FLUOVIEW programvaren (versjon 4.3).
    1. Velg fargestoffer "Cy3" og "Cy5" fra rullegardinmenyen, og klikk "Apply" for å laste de respektive lasere. Merk: eksitasjon / utslipp bølgelengder for Cy3 (543 nm / pseudocolored "grønn"; CD4-PE) og Cy5 (633 nm / pseudocolored "rød"; dextramer-APC) kanaler.
    2. Plasser lysbildet for å bli undersøkt på mikroskopisk lysbilde, og fokusere det manuelt under lavt forstørrelse (4X eller 10X). Klikk på "Focus" mens Cy3 laser er på, og fokusere inflammatorisk fokus.
    3. Endre målet å 100X forstørrelse. Sett filstørrelsen til "512/512" fra rullegardinmenyen. Klikk på "Focus" og justere verdiene på "PMT", "Gain" og "Offset" parametere for å optimalisere lasere separat for Cy3 og Cy5.
    4. Klikk på "Z scenen", og klikk deretter på "Focus" mens både lasere er på. Settykkelsen av "Z stadium" ved å klikke på "opp" og "ned"-pil. Still "Z" intervallet til to mikrometer.
    5. Klikk på "Stop", og velg "Seq123". Deretter klikker du på "XYZ" og begynne å anskaffe "Z" serie bilder for det valgte området innenfor den inflammatoriske fokus. Redd "Z seriebilder" som AVI-filer. For å lagre bildefiler, velger du bildet fra "Z serie image", og deretter lagre som "tiff" format.
  3. Undersøke tre sammenkoblede seksjoner fra storhjernen, der ett sett av tre deler ble farget med IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 og det andre settet med tre seksjoner med IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 å utføre kvantitativ analyse.
    1. Tilsvarende analyser åtte sammenkoblede seksjoner for hjerte, hvor ble et sett på åtte seksjonene farget med IA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 og en annen set av åtte seksjoner med RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Undersøke 10 til 15 inflammatorisk fokus per seksjon i cerebrum, og i hvert fokus, skaffe et sett med 15 til 25 serie bilder i sekvens.
    1. Undersøk totalt 20 inflammatoriske foci fra alle åtte deler av hjertet og fra hver fokus skaffe 10 til 15 serie bilder i rekkefølge. Ta 'Z' seriebilder ved å skanne lysbilder i en horisontal-vertikal up-horisontal-vertikal ned "bevegelse, slik at gjentakelse av" Z "-serien i løpet av den samme fokus unngås.
    2. Når 'Z' serie bildene er tatt, navngi filer ved å identifisere lysbildenumre, navn av seksjonene, og tallet på "Z" seriebilder tatt.
      1. Bruk 'ImageJ "programvare for å telle Dext + CD4 +-T-celler i forhold til det totale antall CD4 +-T-celler. Velg "type disk 'i' ImageJ, sjekk &# 8216; vis alle "og begynner å telle ved å klikke på midten av hver celle og fortsette å telle i ulike 'Z' seriebilder ved å bruke side piler. Etter å telle alle CD4 T-celler, velg en annen type teller og teller CD4 + dext + T celler. Klikk kategorien resultater for å få det totale antall celler telles med de to forskjellige tellere.
      2. For å oppnå det totale antall, tilsett antallet celler i alle 'Z' serie bilder som representerer alle de tre deler eller cerebrale alle åtte hjerteseksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne rapporten, in situ påvisning av antigen-spesifikke CD4, autoreaktive T-celler ved direkte farging med MHC klasse II-dextramers er beskrevet. Nyklipt cerebrale deler ble hentet fra EAE mus og farget med cocktails inneholder PLP 139-151 (bestemt) eller TMEV 70-86 (kontroll) dextramers og anti-CD4. Den øverste panelene i figur 1 viser LSCM analyse av cerebral seksjoner costained med PLP 139-151 dextramers (rød) og CD4 antistoff (grønn), hvor de doble-positive celler dukket gul. En slik funksjon var fraværende i seksjoner farget med TMEV 70-86 (kontroll) dextramers (nederst paneler). De costained (Dext + CD4 +-celler) viste punctate prikker rundt periferien. Kvantitativ analyse av PLP-spesifikke T-celler i de cerebrale seksjoner involvert følgende trinn (figur 2): 1) Deler av tre par var gjort, og en del av hvert par var farget med hver anti-CD4-og PLP 139-151 dextramers. Likeledes ble det et annet sett av tre deler farget med anti-CD4 og kontroll (TMEV 70-86) dextramers. 2) fra en gitt seksjon, ble identifisert inflammatoriske foci (10 til 15), basert på anti-CD4-farging. 3) Et sett med "Z" serie bilder (15 til 25) ble tatt fra hvert fokus i rekkefølge fra topp til bunn med et intervall på 2 mikrometer mellom hver. I hovedsak ble 10 til 15 tilsvarende sett med 'Z' seriebilder som representerer like mange inflammatoriske foci analysert i hver seksjon. 4) I enkeltbilder, CD4 + celler (grønn), cellene positive for begge dextramers (rød) og CD4 (grønn) som dukket opp som gule punctate celler ble nummerert ved å markere dem individuelt ved hjelp av åpen kildekode, ImageJ, og til slutt, en totalsum ble oppnådd for hver seksjon ved tilsetning av antall celler telles i alle 'Z' serie bilder. For at cellene var merket, muligheten for å fortelle cellene i flere bilder som eroverlapp ble eliminert. Dermed oppnås pålitelig telling av Dext +-celler i forhold til det totale antall av celler som uttrykker CD4.

Denne studien ble ytterligere utvidet for å demonstrere bruken av dextramer reagensene for påvisning av antigen-sensibiliserte T-celler in situ i EAM indusert med Myhc 334-352 i A / J-mus, som også er en T-celle-mediert sykdom 13,14. Åtte sammenkoblede hjerteseksjoner ble erholdt, hver 200 mikrometer tykt, fra EAM mus (figur 2). Fra hvert par, ble en del (med totalt 8 seksjoner) farget med Myhc 334-352 dextramers og anti-CD4, mens et annet sett med seksjoner (8 totalt) ble farget med RNase 43-56 dextramers (kontroll) og anti -CD4. For tyve sett av 'Z' seriebilder svarende til at mange inflammatoriske foci som representerer alle åtte deler ble avsøkt sekvensmessig som ovenfor (fig. 2). I hovedsak et gitt sett med 'Z' serie imaldre besto av 10 til 15 individuelle representerte en enkelt inflammatorisk fokus. Analyse av disse bildene av LSCM viste tilstedeværelse av cellene positive for Myhc 334-352 dextramers (rød), og CD4 (grønn) og ventet, cellene bundet med begge dextramers og CD4 dukket opp som gule punctate celler (Figur 3, topplater) . Bakgrunnen farging for kontroll dextramers var ubetydelig (Figur 3, bunnplater). Det totale antall av Dext + CD4 + T-celler og det totale antall CD4 + T-celler ble bestemt for hver seksjon, og tellinger fra alle deler ble lagt sammen for å utlede det totale antall for hver undergruppe (Dext + CD4 +-T-celler, CD4 + T-celler).

Figur 1
Figur 1. Påvisning av PLP-spesifikke CD4 T-celler ved in situ farging med PLP 139-151 dextramers. EAE ble indusert i SJL mus ved immuniserer dyrene med PLP 139-151 i CFA. Ved opphør, ble cerebrums innhentet fra EAE mus innebygd i 4% agarose, og delene ble gjort ved hjelp vibratome. Etter farging med cocktails som inneholder enten PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 eller TMEV 70-86 dextramers (kontroll) / anti-CD4 og feste med 4% PBS-bufret paraformaldehyde, ble deler vasket og montert for undersøkelse av LSCM. Topp paneler: to separate seksjoner farget med PLP 139-151 dextramers/anti-CD4. Bunnplater: to separate seksjoner farget med TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. Venstre panel: CD4, grønn; Midtre panelet: dextramers, rød; Høyre panel: fusjonert (piler, Dext + CD4 + T celler). Original forstørrelse 1000 X (vedtatt:.. Massilamany et al, 2014 Direkte Farging med store histocompatibility komplekse klasse II Dextramers Tillater Påvisning av antigen-spesifikke, autoreaktive CD4 T Cells In Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
Figur 2. En tilnærming til å kvantifisere Dext + celler i hjernen og hjertet. Sammenkoblede delene er laget av cerebrum eller øremuslingen-utskårede hjerte som vist (Panel 1). En del fra hvert par som tilsvarer de angitte organer ble utpekt for farging med spesifikke dextramers (hjernen, PLP 139-151 dextramers, hjerte, Myhc 334-352 dextramers), og det andre settet med seksjoner for kontroll dextramers (cerebrum, TMEV 70 - 86, hjerte, RNase 43-56). Etter festing og montering, ble delene undersøkt for å finne inflammatorisk fokus basert på farging med CD4 etter LSCM (original magnification, 40X) (Faggruppe 2). Hver inflammatorisk fokus som visualisert i tredimensjonale (3D) visning (panel 3) ble underkastet et sett med "Z" serie bilder i rekkefølge (Panel 4). I alle bildene, ble cellene positive for både spesifikk eller kontroll dextramers og CD4, eller CD4 alene telles ved hjelp av 'ImageJ' programvare (vedtatt:.. Massilamany et al, 2014 Direkte Farging med store histocompatibility komplekse klasse II Dextramers Tillater Påvisning av Antigen- Spesifikk, autoreaktive CD4 T-celler i Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3. Påvisning av kardiale myosin-spesifikke CD4-T-celler ved in situ + CD4 + (vedtatt:.. Massilamany et al, 2014 Direkte Farging med store histocompatibility komplekse klasse II Dextramers Tillater Påvisning av antigen-spesifikke, autoreaktive CD4 T-celler i Situ PLoS ONE 9 (1):. E87519). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I motsetning til MHC klasse I tetramers, fortsetter bruken av MHC klasse II tetramers til rutinearbeid å være utfordrende, spesielt for å nummerere forløper frekvenser av lav affinitet autoreaktive CD4 T-celler, delvis på grunn av deres aktivisering avhengighet 6,15-17. Nylig, ble dette problemet omgås ved å lage den neste generasjon av tetramerer, kalt "dextramers", tillater oss å påvise antigen-spesifikke CD4 T-celler for en rekke autoantigener, slik som PLP 139-151, MOG 35-55 og Myhc 334 - 352 8. I denne rapporten, for første gang, nytten av MHC klasse II dextramers å oppdage og kvantifisere selvreaktive CD4 T-celler in situ er påvist ved hjelp av hjerne seksjoner fra EAE mus og hjerte seksjoner fra EAM mus. På en reaksjons basis, dextramers tilbyr fordelen av å kreve en liten mengde av MHC / peptid-komplekser. I denne protokollen, krever bare 0,75 ug MHC / peptid monomerer hver reaksjon. I tillegg er staining med dextramers er en ett-trinns reaksjon, siden dextramers er coincubated med anti-CD4, og hele prosedyren, fra vev seksjonering mot flekker, kan være ferdig på mindre enn en dag. I kontrast, de publiserte protokoller for in situ farging med konvensjonelle tetramers ofte involverer forsterkning prosedyrer der fluorescerende signalene blir forsterket ved hjelp av sekundære antistoffer for fluorophores. Som et resultat av dette kan fargingsprosedyrer ta opp til tre dager for å fullføre 18-20.

Videre, bruk av dextramers i cerebrale seksjoner tillater påvisning av antigen-spesifikke T-celler dypt i vevssnitt, og med opp til 50 mikrometer. Det ble bemerket at PLP 139-151 Dext + CD4 +-celler ble funnet å være lokalisert både perivascularly og også inne i parenkym. Videre intensiteten av signaler generert fra Myhc 334-352 dextramers var lav i hjerte seksjoner sammenlignet med PLP 139-151 dextramers i hjernen seksjoner (figur 1), og en slik variasjon kan gjenspeile egenskapene som er unike for hvert organ. En slik variabel er lipidinnholdet som er til stede i store mengder i hjernevevet i motsetning til hjertevevet som inneholder hovedsakelig tverrstripet muskelfibre som potensielt kan begrense lett diffusjon av dextramers inn i inflammatorisk fokus. Til støtte for denne oppfatningen, ble Myhc 334-352 Dext + celler oppdages bare til en dybde opp til 20 mikrometer i flertallet av hjerte seksjoner. I tillegg Myhc 334-352 Dext + celler var tilstede spredt gjennom hjertemuskelen som tyder på diffust natur inflammatoriske infiltrater i myocarditic lesjoner.

Generelt kan to hovedfaktorer negativt påvirke påvisningen av antigen-spesifikke T-celler in situ ved LSCM. For det første kan ikke tilstrekkelige signaler som sendes ut fra fluoroforer føre til behovet for å forsterke signalene ved hjelp av fluoroforen antistoffer. For det andre, for eksempel en indirekte flekking kan undergrave spesifisitet, som bakgrunn farging for kontroll reagenser også kan øke proporsjonalt 18,19. Disse begrensningene ble omgått ved direkte farging med dextramers. Selv om påvisning av CD4-T-celler har blitt vist med friske seksjoner, bruken av dextramer reagenser i frosne vev krever ytterligere studier, som kan være en utfordring som retensjonen av vev-integritet kan være vanskelig på grunn av tendensen for vev for å komme oppløst under ulike flekker trinn 18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter ble erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association og Barnas Kardiomyopati Foundation (SDG2462390204001), og National Institutes of Health (HL114669). CM er en mottaker av en postdoktor stipendet deles ut av Myokarditt Foundation, NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4 °C
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4 °C
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4 °C
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4 °C
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 °C
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4 °C
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4 °C
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4 °C
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4 °C
Dextran conjugated SA-APC Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4 °C
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).

Tags

Immunologi dextramers; MHC klasse II;
<em>In Situ</em> Påvisning av autoreaktive CD4 T-celler i hjernen og hjertet Bruke store histocompatibility komplekse klasse II Dextramers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Massilamany, C., Gangaplara, A.,… More

Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter