Summary
MHC kompleksi sınıf II dextramers ile direkt boyama ile beyin ve kalp kendinden reaktif CD4 T hücreleri algılamak için protokol bu raporda tarif edilmiştir. Kapsamlı bir analiz için in situ antijene özgü CD4 + T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için güvenilir bir yöntem de planlanmaktadır.
Introduction
Majör histokompatibilite kompleksinin kullanımı antijene özgü CD4 T hücrelerinin saptanması için (MHC) sınıf II tetramerler bir sorun 1-7 olmuştur. MHC sınıf II tetramerler algılama hassasiyetini artırmak için, araştırma ekibi belirlenen nesil tetramers, "dextramers" 8 yarattı. Dextramers örneğin birkaç peptide gergin, biyotinile edilmiş monomerler, bir MHC molekülüne dekstran 9 bağlı olabilir birden fazla streptavidin-fluorofor kısımları konjüge edildiği dekstran omurgalar içerir. Böylece, birkaç MHC-peptid komplekslerini içeren MHC dextramers büyük agrega çok T hücre reseptörleri (TCRler) ile etkileşime girebilir.
Bu grup, son zamanlarda çeşitli self-antijenlerine dextramers üretilir ve dextramers algılama hassasiyeti tetramerleri, yaklaşık 8 den fazla beş kat olduğu gösterilmiştir. Deney Sistemleri deneysel otoimmün ensefalomiyelit içerir (EAE) proteolipid protein (PLP) SJL farelerinde 139-151 ile indüklenen; EAE miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) C57BL / 6 farelerinde 35-55 ile indüklenen; ve deneysel otoimmün miyokardit (EAM), kardiyak miyosin ağır zincir-α (Myhc) A / J farelerinde 334-352 ile neden oldu. Bu çalışma, PLP 139-151 kullanımını gösterir - ve Myhc 334-352 böylece florofor antikorlar kullanılarak gelen sinyalleri yükseltmek için ihtiyacı ortadan kaldırarak, direkt bir boyama protokolü geliştirerek özgüllük ile in situ olarak antijene spesifik CD4 T hücrelerini tespit etmek için bir dextramers Yaygın bir yaklaşım tetramerleri kullanımı ile kullanılabilir. Buna ek olarak, doku değerlendirilmesi kapsamlı bir yöntem de güvenilir bir şekilde yerinde 10 antijene spesifik CD4 T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için tasarlanmış edilmiştir. In situ olarak antijen-spesifik T hücrelerinin aktivasyonunun tespiti seyirci neden olduğu belirli antijenik uyarıcılarla neden olduğu olaylar çizimi izin verir. Benzer şekilde, in situ tekniği de providhedef organ içinde antijen-spesifik T hücresi sızıntılar kinetiğini takip etmek için fırsatlar es.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Açıklama:
Bütün hayvan prosedürleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı kurallarına uygun olarak yapılmıştır ve Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
EAE 1. İndüksiyon
- Aşama 1.1: EAE neden olmak için, aşağıdaki modifikasyonlar ile 11 'de tarif edildiği gibi peptid / tam Freund adjuvanı (CFA) emülsiyonu hazırlamak. 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 1 mg / ml' lik bir konsantrasyonda PLP 139-151 hazırlanması Aşama 1.4:. hayvan başına PLP 139-151, 100 ug içeren CFA emülsiyonun 200 ul kullanımı 1.4.1 Adım: On hayvan bağışıklık 1 PLP 139-151 ml (1 mg / ml 1x karıştırılarak 2 ml emülsiyon hazırlamak . PBS) ve CFA eşit hacmi 1,5 Adım: Her iki kasık bölgesi (~ 75 ul her biri) ve beş ila altı haftalık eski sternal bölgede (~ 50 ul) içinde deri altından bölünmüş dozlarda emülsiyonun 200 ul enjekte female SJL / J fareler. 1.7 ve 1.8 EAE indüksiyonu için geçerli değildir adımları tekrarlayın.
EAE Fareler ve beyni arasında Hasat 2.. Klinik Skorlama
- Klinik bulguların görünümü için hayvanları izlemek, ve aşağıdaki gibi günlük 9 İmmünizasyondan günlük hastalık şiddetini puan: 0 - Sağlıklı; 1 - kuyruk veya arka bacak güçsüzlüğü, gevşek ama ikisini; 2 - kuyruk ve arka bacak güçsüzlüğü gevşek; 3 - arka bacaklarda kısmi felç; 4 - arka bacaklarda tam felç; 5 - can çekişen ya da 12 ölü.
- Onlar CO 2 kullanarak 3 veya 4 bir nörolojik puan ulaştığınızda fareler Euthanize. Fareler euthanize için değil, 6 psi aşan CO2 tankın düzenleyici çevirerek CO2 ilk ötenazi bölmeyi ön girip hayvanlar tam asfiksi elde etmek için yaklaşık olarak 5 dakika boyunca oda içinde durmasını sağlar. % 70 alkol ötenazi hayvanları bekletin. Hemen sonra, bir emici ped üzerindeki hayvanlar koyun ve steril bir çift ileceps ve makas göğüs boşluğu yoluyla keserek kalpleri maruz. Doğru kulakçıkları delinme ve kalplerin sol ventriküller içine soğuk 1x PBS 10 ml enjekte edilerek serpmek.
- Kavisli bir makas kullanarak dairesel bir şekilde kafatası kırpma tarafından kafatası kazı ve dikkatle, forseps ile kafatası kemikleri çevirin. Diseksiyonu künt ve temiz bir neşter, beyincik ayrı beyni kullanarak beyin hasat. Soğuk 1 x PBS içeren bir tüpe yerleştirin, beyni ve işleme kadar buz üzerinde tüpü terk.
3.. MHC Sınıf II (IA ler) / HUA 139-151 Dextramers ile Serebral Bölümlerin in situ boyama
- PBS% 4 tamponlu düşük erime noktalı agaroz, 50 ° C de ısıtılarak eritilmesi ve kullanılana kadar bir 40 ° C su banyosu içinde bırakın hazırlayın.
- Bir tek derin taban kalıp histoloji kaset beyni yerleştirin buz üzerinde tutulur ve erimiş (40 ° C) agaroz dökün. Hemen yavaşça beyni basınforseps doku batığın ile. Katılaşma işlemi tamamlanana kadar 15-20 dakika boyunca buz üzerinde kaseti bırakın.
- Soğutulmuş 1x PBS ile vibratome banyo doldurun. 0 ile 2 arasında PBS sıcaklığını korumak için buz küpleri ile vibratome çevresinde banyo boşluğu doldurmak ° C. Vibratome içine temiz bir jilet düzeltmek ve 15 ° bıçak açısını ayarlayın.
- Vibratom doku yerleştirme. Gömülü doku her iki aşırı agaroz Trim ve hafifçe beyin ventral yüzeyi maruz kalmaktadır.
- Süper yapışkan ile vibratome doku bloğu yayma ve enine kesit için yapıştırıcı üzerinde beyin açıktaki ventral yüzeyi yerleştirerek yapıştırılmış yüzey üzerinde agaroz-gömülü doku aktarın. Doku blok üzerinde bir kere ayarlandığında, doku hareket etmeyin.
- Buz üzerinde agaroz-gömülü doku içeren vibratome blok yerleştirin ve tutkal 15 dakika kurumasını bekleyin.
- Bu arada, doku Cham yerleştirinBir 24-yuvalı plaka içinde çukur başına bir Bers. Soğuk 1x PBS içinde 1 ml doku odaları içeren kuyu doldurun ve buz üzerinde plaka bırakın.
- Ince naylon süper yapıştırıcı kullanarak 25 ml polipropilen pipet kesme ucuna örgü takarak doku odaları hazırlayın; Pipet çevresinde aşırı örgü kırpma sonra, örgü 1 cm'lik bir uzunluğa pipet kesti.
- Doku üst yüzeyinin seviyesine vibratome Alt bıçak; 0.22 mm / sn vibratome hızını ayarlamak ve 200 mikron kalınlığında kesitler yapmak için bir ileri hareketi ile kesit başlar. Zamanda bir 24 oyuklu plakanın kuyu içine yerleştirilen doku bölmelerine bir sulu boya yumuşak bir fırçayla için bir beyin bölümü aktarın. Kesit dokusu bozulmasını önlemek tamamlanana kadar buz üzerinde plaka tutun. Not: ventral yüzeye beyin dorsal üç farklı bölgelerinde (Şekil 2) toplam üç eşli bölümlerde edinmek için aşağıdaki adımları izleyin. Dan bir bölümÜç ayrı bölmelerine yerleştirildi, doku (toplam üç bölüm içinde) her bir çift, spesifik dextramers ile lekeleme için belirlenmiş (IA s / PLP 139-151) ve anti-CD4 edilir. Aynı şekilde, üç ayrı doku odalarına yerleştirilir üç bölümden başka bir dizi kontrol dextramers ile lekeleme için belirlenmiş (IA s / TMEV 70-86) ve anti-CD4.
- Bir bölmeye sahip bir 24-çukurlu plaka içinde üç kuyu içine belirli dextramers ile lekeleme her kuyuda için belirlenmiş bölümler içeren üç bölmeyi doku transfer ki, alofikosiyanin içeren bir kokteylin 300 ul (APC) ile konjüge edilmiş PLP 139-151 dextramers (2.5 ug / ml) ve anti-CD4-fikoeritrin (PE;),% 2 normal keçi serumu çözeltisi (1 x PBS içinde bloke / ml 5 ug) daha ilave edildi. Bir kapak ile kuyuları kapsayacak.
- Benzer şekilde, her bir bölmeye sahip bir 24-çukurlu plaka içinde üç kuyu içine kontrol dextramers ile lekeleme için belirlenmiş bölümler içeren üç doku bölmeyi aktarmakll ki, APC-konjuge TMEV 70-86 dextramers (2.5 ug / ml) ile bloke etme çözeltisi olarak anti-CD4-PE (5 ug / ml) içeren bir kokteylin 300 ul, daha önce ilave edildi. Bir kapak ile kuyuları kapsayacak. Not: Massilamany Bakınız ve arkadaşları, 8 dextramers hazırlanması ve dextramers nazik Immudex, Kopenhag, Danimarka firması tarafından sağlanan hazırlamak için dekstran molekülleri için..
- Kuyu etiketleyin ve alüminyum folyo ile plaka sarın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1.5 saat boyunca yumuşak devir için ayarlanmış bir sallanan platform üzerinde plaka yerleştirilir.
- İnkübasyon süresinden sonra, iyi soğuk 1 x PBS içinde 1 ml ihtiva eden bir taze için doku odaları aktararak, sallanan bir platform üzerinde doku bölümleri yıkama, ve de diğer içine bir içeriğini sürme kaçının. Yıkama başına en az 10 dakika izin veren, üç kez yıkama tekrarlayın. Bu odacığın yanlarına yapışmaya gibi doku kesitleri, kurutuldu kalmadığından emin olun.
- Doku cham aktararak bölümleri Fixhafif bir döndürme ile 2 saat için bir sallanan platform üzerinde süzüldü 4% paraformaldehid, PBS-tampon (pH 7.4) içinde 1 ml içeren 24 oyuklu bir plaka içerisinde yeni bir oyuğuna yle.
- Adım 3.10 tarif edildiği gibi üç kez yıkama tekrarlayın.
- Bir suluboya yumuşak bir fırça kullanarak temiz bir mikroskop lamı üzerinde lekeli ve sabit bölümleri yerleştirin. Bölümüne dokunmadan fazla suyu silin, ve montaj orta kullanarak montaj bölümünü. Mikroskobik bir lamel ile kaplayın ve slaytlar karanlık odada RT O / N kurumaya bırakın.
- 4 ° C'de bir ışık geçirmez slayt saklama kutusunda slaytlar saklayın
Hearts EAM ve Koleksiyonu 4. İndüksiyon
- Referans 11'de anlatıldığı gibi EAM neden.
- CO 2 gazı silindir ile donatılmış temiz odasını kullanarak günlük 21 İmmünizasyondan üzerinde fareler Euthanize, ve% 70 alkol hayvanları ıslatın. Hemen, bir emici ped hayvanlar koyun ve forseps ve bir makas kullanarak kalp maruzgöğüs boşluğu yoluyla keserek s. Doğru kulakçıkları delinme ve kalplerin sol ventriküller içine soğuk 1x PBS 10 ml enjekte edilerek serpmek. Soğuk 1x PBS içeren tüplerde kalpleri ve yeri toplayın.
5.. MHC Sınıf II (IA k) / Myhc 334-352 Dextramers ile Kalp Bölümlerin in situ boyama
- Hazırlama 4% düşük ısıda eriyen agaroz, 50 ° C'de ısıtılarak eritilir ve 40 dakika içinde bırakın PBS tamponlu Kullanıma kadar C su banyosu °.
- Buz üzerinde tutulan bir tek derin taban kalıp histoloji kaset olarak, kalbin yerleştirin ve aşama 3.2 'de tarif edildiği gibi dokular tamamen gömülü olduğu kadar erimiş agaroz 40 ° C dökün.
- Adımı 3.3 izleyin.
- Gömülü doku her iki aşırı agaroz Trim ve hafif kalbin tabanı ortaya. Süper yapıştırıcı ile vibratome doku blok smear ve açıkta kalan yüzeyini koyarak yapıştırılmış yüzey üzerinde agaroz gömülü doku transferitutkal üzerinde kalp. Doku blok üzerinde bir kere ayarlandığında, doku hareket etmeyin.
- Buz üzerinde agaroz-gömülü doku içeren vibratome blok yerleştirin ve tutkal 15 dakika kurumasını bekleyin.
- Adımları 3.5 ve 3.6 izleyin.
- , 24 oyuklu plakanın kuyu içine yerleştirilen doku bölmelerine bir sulu boya yumuşak bir fırçayla kalp bölümleri aktarın. Kesit doku bozulmasını önlemek için tamamlanana kadar buz üzerinde plaka tutun. Not:, kalbin tabanına apeks sekiz eşleştirilmiş kesitler (Şekil 2) toplam edinmek için aşağıdaki adımları izleyin. Odasının başına 3 bölüme kadar tahsis, doku odalarına tüm bölümleri yerleştirin. (Toplam sekiz bölümlerde) her çifti gelen bir bölüm özel dextramers (IA k / Myhc 334-352) ve anti-CD4 ile boyanma belirlenmiştir. Aynı şekilde, sekiz bölümden başka bir set kontrol dextramers (IA k / RNaz 43-56) ve anti-CD4 ile boyanma belirlenmiştir.
- Transferiin oyuk başına bir odası olan bir 24-çukurlu plaka içinde üç kuyu içine belirli dextramers ile lekeleme için belirlenmiş bölümler ihtiva eden üç doku haznelerinin, 300 APC-konjuge Myhc 334-352 dextramers (2.5 ug / ml) içeren bir kokteylin ul ve Bloke etme çözeltisi olarak anti-CD4-PE (5 ug / ml), daha önce ilave edildi. Bir kapak ile kuyuları kapsayacak.
- Aynı şekilde, oyuk başına bir odası olan bir 24-çukurlu plaka içinde üç kuyu içine kontrol dextramers ile lekeleme için belirlenmiş bölümler içeren üç doku bölmeyi transferi ettiği, 43-56 dextramers (2.5 ug APC-konjuge RNaz içeren bir kokteylin 300 ul Bloke etme çözeltisi / ml) ve anti-CD4-PE (5 ug / ml), daha önce ilave edildi. Bir kapak ile kuyuları kapsayacak.
- Kuyu etiketleyin ve alüminyum folyo ile plaka sarın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1.5 saat boyunca yumuşak devir için ayarlanmış bir sallanan platform üzerinde plaka yerleştirilir.
- Adımları, 3,10-3,11 izleyin
- Tekrar yıkama thrAdım 3.10 tarif edildiği gibi buz.
- Bir suluboya yumuşak bir fırça kullanarak temiz bir mikroskop lamı üzerinde lekeli ve sabit bölümleri (en fazla üç bölüm / slayt) yerleştirin. Bölümleri dokunmadan fazla suyu silin, ve montaj orta kullanarak bölümleri monte edin. Mikroskobik bir lamel ile kaplayın ve slaytlar karanlık odada RT O / N kurumaya bırakın.
- 4 bir ışık geçirmez slayt saklama kutusunda slaytlar saklayın ° C.
6.. Dextramer + Analizi (Beyin ve Kalp Bölümleri ikisi için ortak) Lazer tarama konfokal mikroskop (LSCM) tarafından (dext +) CD4 + T Hücreleri
- Rutin tarama ve görüntü edinimi için Nikon A1-Eclipse 90i konfokal mikroskop sistemi kullanın. Başlatmak açık Tıklayın, NIS Elements AR yazılımı (sürüm 4.13).
- "TRITC" ve panelinden "Cy5'in" kanal seçin. TRITC ve Cy5 kanalları sırasıyla uyarma / emisyon dalga boyları, 561,5 nm / 553-618 nm ve varsayılan olarak görünür nm 640,7 nm / 663-738.
- Sırasıyla, TRITC (CD4-PE) ve Cy5 (dextramer-APC) kanalları için pseudocolors "yeşil" ve "kırmızı" atayın.
- Mikroskopik sahnede incelenecek slayt yerleştirin ve 100X büyütme altında manuel olarak odaklayın. 110 "HV" Set ve "0" ofset. "Odak" tıklayın ve lazerler optimize etmek için "gerilim" ayarlayın.
- "Odak" üzerine tıklayın; yukarıdan aşağıya bölümü tarama ve görüntü elde etmek için 'Z' seviyesini ayarlamak. "CH serisi" tıklayın ve görüntü sırayla kazanır. Dext tespit + CD4 + T hücreleri, kırmızı (dextramers) ve yeşil (CD4) kanallarının her ikisi de elde edilen sinyallerin eş-lokalizasyonu dayalı olarak sarı noktalı hücreleri görünen.
- Dext + CD4 + T hücrelerinin kolay nicel sayımı için Olympus BX60 FV500-konfokal mikroskop kullanın. Öncelikletıklatın açık Fluoview yazılımı (versiyon 4.3).
- Açılır menüden boyalar "Cy3" ve "Cy5" seçin ve ilgili lazerler yüklemek için "geçerli" tıklayın. Not: Cy3 için uyarma / emisyon dalga boyları (543 nm / "yeşil" yalancı, CD4-PE) ve Cy5 (633 nm / "kırmızı" yalancı, dextramer-APC) kanalları.
- Mikroskopik slayt üzerinde incelenecek slayt yerleştirin, ve düşük büyütme (4X veya 10X) altında elle odaklanır. Cy3 lazer açıkken "Odak" tıklayın ve inflamatuar odak odak.
- 100X büyütme hedefi değiştirin. Açılır menüden için "512/512" dosya boyutunu ayarlayın. "Odak" tıklayın ve "PMT", "kazanç" için değerleri ayarlayın ve Cy3'e ve Cy5 için ayrı ayrı lazerler optimize parametreler "Offset".
- "Z sahne" tıklayın ve lazerler hem de iken daha sonra "Odak" tıklayın. Set"yukarı" ve "aşağı" okları tıklayarak "Z sahne" kalınlığı. 2 um "Z" aralığını ayarlayın.
- "Dur" tıklayın ve "Seq123" seçin. Sonra, "XYZ" tıklayın ve inflamatuar odak içinde seçilen alan için "Z" serisi görüntüleri elde başlar. AVI dosyaları olarak "Z seri görüntüler" kaydedin. , Görüntü dosyaları kaydetmek "Z seri görüntü" dan görüntü seçin ve ardından "tiff" formatında kaydetmek için.
- Üç bölümden bir set IA s / HUA 139-151 dextramers/anti-CD4 ve IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 gerçekleştirmek için üç bölümden diğer seti ile boyandı serebrumda üç eşli bölümleri inceleyin nicel analizi.
- Benzer şekilde, hangi, sekiz bölümden bir set IA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 ve başka se ile boyandı, kalp için sekiz eşleştirilmiş bölümleri analizRNaz 43-56 dextramers/anti-CD4 ile sekiz bölümden t.
- Serebrumda bölüm başına 10 ila 15 inflamatuar odaklar incelemek ve her odak, 15 ila 25 seri görüntüler sırayla bir dizi kazanır.
- Kalbin tüm sekiz kesimden ve her odak 20 enflamatuvar odakların toplam incelemek sıralı 10-15 seri görüntü kazanır. Aynı odak içinde 'Z' serisinin tekrarı önlenir, böylece bir 'yatay-dikey up-yatay-dikey' aşağı hareketinde slaytlar tarayarak 'Z' seri görüntü alabilir.
- 'Z' seri görüntüler yakalandığında, slayt numaralarını, bölümlerin adı ve alınan 'Z' seri görüntülerin sayısını belirleyerek dosyaları isim.
- CD4 + T hücrelerinin toplam sayısı ile ilgili olarak dext + CD4 + T hücreleri saymak 'ImageJ' yazılımı kullanın. ImageJ 'de' sayaç türü 'seçmek, kontrol ve# 8216; tümünü göstermek 've her hücrenin merkezini tıklayarak saymaya başlar ve farklı sayım devam' yan okları kullanarak Z 'seri görüntüler. Tüm CD4 T hücrelerini sayma sonra, sayacın başka türünü seçin ve + T hücreleri CD4 + Dext sayılır. Iki farklı sayaçları ile sayılan hücrelerin toplam sayısını almak için sonuçlar sekmesini tıklatın.
- Toplam sayısını elde etmek için, her üç beyin bölümleri ya da her sekiz kalp bir kesitini temsil eden tüm 'Z' seri görüntülerde hücrelerin sayısını ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu raporda, MHC sınıf II ile doğrudan dextramers lekelemesi ile antijen spesifik, oto-reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti tarif edilmektedir. Taze kesilmiş beyin kesitleri EAE farelerden türetilen ve (kontrol) dextramers ve anti-CD4 (özel) veya TMEV 70-86 PLP 139-151 içeren kokteyller ile boyandı. Şekil 1 'de üst paneller Çift pozitif hücreler, sarı çıktı PLP 139-151 dextramers (kırmızı) ve CD4 antikoru (yeşil) ile costained beyin bölümlerinin LSCM analizini göstermektedir. Bu tip bir özellik TMEV 70-86 (kontrol) dextramers (alt panel) ile boyandı bölümlerde mevcut değildi. Costained (dext + CD4 +) hücreleri, çevresi etrafında noktalı noktalar göstermiştir. Beyin bölümlerinde PLP-spesifik T hücrelerinin kantitatif analizi için aşağıdaki adımları (Şekil 2) yer alan: 1) üç çift Bölümleri yapılmış ve her bir çifti, bir kısmı, anti-CD4 ve PLP 139-15 ile ayrı ayrı boyanmıştır1 dextramers. Aynı şekilde, üç bölümden başka bir dizi anti-CD4 ve kontrol (TMEV 70-86) dextramers ile boyandı. 2) belirli bir bölümünden, enflamatuvar odakları (10-15), anti-CD4 boyama göre tespit edilmiştir. 3) 'Z' seri görüntüler (15-25) bir dizi her biri arasında 2 um'lik bir aralık ile yukarıdan aşağıya doğru her bir odaklama sırayla alındı. Aslında, enflamatuvar odakların eşit sayısını temsil eden 'Z' seri görüntülerin 10-15 benzer setleri her bölümde analiz edilmiştir. 4) bireysel görüntüleri CD4 + hücreler (yeşil), hem dextramers (kırmızı) ve CD4 gibi sarı benekli hücreleri nihayet açık kaynak yazılım, ImageJ kullanarak bunları tek tek işaretleyerek numaralandırılan ve belirdi (yeşil) için pozitif hücreler, büyük bir toplam, tüm 'Z' seri görüntülerde sayılan hücrelerin sayısı ekleyerek, her bölüm için elde edilmiştir. Birden çok görüntülerde hücreleri anlatırken hücreleri işaretli olduğu, olasılığı nedeniyleörtüşen elimine edildi. Bu nedenle, CD4 ifade eden hücrelerin toplam sayısına göre dext + hücrelerinin güvenilir numaralandırma elde edilebilir.
Bu çalışma ayrıca, aynı zamanda, bir T hücre-aracılı hastalık 13,14 A / J fareleri, 334-352 Myhc ile uyarılan EAM in situ antijene duyarlı T hücrelerinin bulgulanması için dextramer reaktiflerin kullanımını göstermek için uzatılmıştır. Sekiz eşleştirilmiş kalp bölümler EAM fareler (Şekil 2), her bir 200 mikron kalınlığında elde edilmiştir. Bölümlerde (toplam 8) başka bir set RNaz 43-56 dextramers (kontrol) ve anti ile boyandı oysa her çifti, (8 bölümden toplam) bir bölümü, Myhc 334-352 dextramers ve anti-CD4 ile boyandı -CD4. Sekiz bir kesitini temsil eden birçok enflamatuvar odakların tekabül eden 'Z' seri görüntülerin yirmi ardışık olarak bebekler üzerinde (Şekil 2) elde edildi. Esasen, 'Z' seri im verilen bir diziyaşları tek inflamatuar odak temsil 10-15 bireyin oluşuyordu. LSCM bu görüntülerin analizi Myhc 334-352 dextramers (kırmızı) için pozitif hücrelerin varlığını gösterdi ve CD4 (yeşil) ve beklenebileceği gibi dextramers ve CD4 hem de bağlı olan hücreleri (Şekil 3, üst paneller) ve san benekli hücreleri ortaya . Kontrol dextramers için plan boyama (Şekil 3, alt paneller) ihmal edilebilir. Dext + CD4 + T hücrelerinin toplam sayısı ve CD4 + T hücrelerinin toplam sayısı tüm bölümlerin her bölümü ve sayıları için belirlenmiştir, her alt-(dext + CD4 + T hücreleri için toplam sayısını elde etmek için birbirine eklenir; CD4 + T hücreleri).
Şekil 1. Yerinde ile PLP-özgü CD4 T hücrelerinin saptanması rong>. EAE CFA içinde PLP 139-151 ile immünize hayvanlar ile SJL farelerinde PLP 139-151 dextramers ile lekeleme sağlandı. Her birinden, EAE farelerden toplanan beyni% 4 agaroz gömülü olan ve bölümleri vibratome kullanılarak yapılmıştır. PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 veya TMEV 70-86 dextramers (kontrol) / anti-CD4 ve PBS% 4 tamponlu paraformaldehid ile tespit ya da ihtiva eden kokteyl ile boyandıktan sonra kesitler yıkanmış ve LSCM ile inceleme için monte edilmiştir. Üst paneller: PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 ile boyanmış iki ayrı bölüm. Alt paneller: TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 ile boyanmış iki ayrı bölüm. Sol panel: CD4, yeşil; Orta paneli: dextramers, kırmızı; Sağ paneli: (oklar, dext + CD4 + T hücreleri) birleşti. Orijinal büyütme 1,000 X (benimsemiştir:.. Majör Histokompatibilite Kompleksi Sınıf II Dextramers ile Massilamany ve ark, 2014 Direk Boyama Antijen-Özgül, reaktif CD4 T Hücre Algılama İzinleri. Yerinde PLoS ONE 9 s (1):. e87519) , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
(Panel 1) gösterildiği gibi Şekil 2.. Beyinlerinde ve yüreklerinde dext + hücrelerini ölçmek için bir yaklaşım. Eşli bölümleri serebrumda veya kulak kepçesi-kesilmiştir kalp yapılır. Belirtilen organlara tekabül eden her bir çiftin ikinci bir bölümü, özel dextramers (beyin, PLP 139-151 dextramers, kalp, Myhc 334-352 dextramers) ile lekeleme için tayin edildi ve kontrol dextramers için bölme diğer ayarlamak (beyin, TMEV 70 - 86, kalp, RNaz 43-56). Sabitleme ve montaj sonra, bölümler LSCM tarafından CD4 ile boyanarak dayalı iltihaplı odaklar (orijinal mag bulmak için incelendinification, 40X) (Panel 2). Üç boyutlu (3D) (Panel 3) gösterildiği gibi, her enflamatuar odak 'Z' seri görsel sırayla (Panel 4) bir dizi tabi tutulmuştur. Bütün görüntülerde, yalnız belirli veya kontrol dextramers ve CD4 veya CD4 ikisi için pozitif hücreler benimsenen 'ImageJ' yazılımını kullanarak (sayıldı:.. Massilamany ve diğerleri, 2014 Majör Histokompatibilite Kompleksi Sınıf II Dextramers ile doğrudan Boyama Antijen-Algılama İzinleri Özgül, Yerinde PLoS ONE 9 otoreaktif CD4 T hücreleri (1):.. e87519) , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
In situ kardiyak miyosin spesifik CD4 T hücrelerinin Şekil 3. Algılama
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MHC sınıf I tetramerleri farklı olarak, rutin uygulamalar için MHC sınıf II tetramerleri kullanımı özellikle aktivasyon bağımlılık 6,15-17 kısmen nedeniyle düşük-yakınlık oto-reaktif CD4 T hücrelerinin, bir ön-madde frekansları numaralandırmak için, zor olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda, bu sorun, PLP'ye 139-151, MOG 35-55 ve Myhc 334 gibi Otoantijenler, bir dizi için antijen-spesifik CD4 T hücreleri algılamak için bize izin ", dextramers" denilen tetramerler nesil oluşturarak atlatılabilirdi - 352 8. Bu raporda, ilk kez olarak, in situ kendiliğinden reaktif CD4 T hücrelerini tespit etmek ve ölçmek için MHC sınıf II dextramers en yarar EAE farelerin beyin bölümleri ve EAM farelerden kalp bölümleri kullanılarak gösterilmiştir. Bir reaksiyon temelde, dextramers MHC / peptid komplekslerinin küçük bir miktar gerekmesi gibi özellikleri bulunmaktadır. Bu protokol, her bir reaksiyon, sadece 0.75 mg MHC / peptid monomerlerinin gerektirir. Ayrıca, sta içindedextramers ile ining dextramers, anti-CD4 ile coincubated beri, bir tek basamaklı olup, ve tüm prosedürü, doku boyama kesit gelen, bir günden daha az bitmiş olabilir. Bunun aksine, geleneksel bir tetramerleri ile in situ boyama için yayımlanmış protokoller genellikle floresan sinyalleri florofor için ikincil antikorlar kullanılarak amplifiye edildiği amplifikasyon prosedürleri içerir. Sonuç olarak, boyama işlemleri 18-20 tamamlamak için üç gün kadar sürebilir.
Bundan başka, beyin bölümlerinde dextramers kullanımı da 50 um kadar, doku kesitlerinde in derin antijen-spesifik T hücrelerin tespit edilmesini mümkün kılar. Bu PLP 139-151 dext + CD4 + hücreleri, her ikisi de ve aynı zamanda perivascularly parankimi içinde yer bulunmuştur kaydedildi. Beyin saniyede PLP 139-151 dextramers ile karşılaştırıldığında Ayrıca, Myhc 334-352 dextramers üretilen sinyallerin yoğunluğu kalp bölümlerde düşükyerlerine (Şekil 1) ve bu tür bir değişiklik, her bir organa özgü özelliklerini yansıtabilir. Böyle bir değişken, potansiyel olarak enflamatuvar odağa dextramers kolayca yayılmasını kısıtlamak esas olarak çizgili kas lifleri içeren kalp dokusuna karşı beyin dokusunda yüksek miktarlarda mevcut olan lipid içeriğidir. Bu kavramı destek olarak, Myhc 334-352 dext + hücreleri sadece kardiyak bölümlerde çoğunda 20 um bir derinlik up tespit edildi. Ayrıca, Myhc 334-352 dext + hücreler, tüm myocarditic lezyonlar inflamatuar infiltratlarının yayılmış doğasını akla miyokardiyumun dağılmış mevcuttu.
Genel olarak, iki ana faktör negatif LSCM in situ antijen-spesifik T hücrelerin saptanmasını etkileyebilir. İlk olarak, florofor yaydığı sinyaller yetersiz florofor antikorlar kullanılarak sinyalleri yükseltmek için ihtiyaç yol açabilir. İkinci olarak, bu dolaylı bir lekekontrol reaktifler için plan boyama da orantılı 18,19 artırabilir gibi ing, özgüllük sarsar. Bu sınırlamalar dextramers ile direkt boyama ile atlatılabilir edildi. CD4 T hücrelerinin başarılı bir şekilde tespiti taze bölümleri ile gösterilmiştir rağmen, dondurulmuş dokuda dextramer reaktiflerin kullanımı için dokular elde etmek için eğilim zor olabilir dokuya bütünlüğünün muhafaza gibi bir sorun olabilir ek çalışmalar gerektirir Çeşitli boyama esnasında dağıldı 18,19 adımlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Herhangi bir çıkar çatışması ilan edildi.
Acknowledgments
Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği ve Çocuk Kardiyomiyopati Vakfı (SDG2462390204001) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL114669) tarafından desteklenmiştir. CM Miyokardit Vakfı, NJ tarafından verilen doktora sonrası araştırma bursu hibe bir alıcı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4 °C |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4 °C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4 °C |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4 °C |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 °C |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4 °C |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4 °C | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
- Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
- Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
- Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
- Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
- Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
- Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
- Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
- Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
- Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
- Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
- Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
- Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
- Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).
