Summary
Protokollet för att upptäcka självreaktiva CD4 T-celler i hjärna och hjärta genom direkt färgning med MHC klass II dextramers har beskrivits i denna rapport. För omfattande analys, är en tillförlitlig metod för att räkna upp de frekvenser av antigen-specifika CD4 + T-celler på plats också fram.
Introduction
Användningen av större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass Il-tetramerer för detektion av antigen-specifika CD4 T-celler som har varit en utmaning 1-7. För att öka känsligheten för MHC klass II tetramers upptäckt, har forskargruppen skapat nästa generations tetramers, betecknade "dextramers" 8. Dextramers innehålla dextran huvudkedjor i vilka multipla streptavidin-fluorofor-grupper är konjugerade, exempelvis att flera peptid tjudrad, biotinylerade MHC-monomerer kan bindas till en dextranmolekyl 9. Sålunda kan stora aggregat av MHC dextramers som innehåller flera MHC-peptidkomplex interagera med flera T-cellreceptorer (TCR).
Denna grupp nyligen genererade dextramers för olika självantigener och visat att känsligheten hos dextramers detektion var ca fem gånger mer än tetramerer 8. De experimentella system innefattar experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) inducerades med proteolipidprotein (PLP) 139-151 i SJL-möss; EAE inducerad med myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) 35-55 i C57BL / 6 möss; och experimentell autoimmun myokardit (EAM) framkallad med hjärt myosin tung kedja-α (Myhc) 334-352 i A / J-möss. Denna studie demonstrerar användningen av PLP 139-151 - och Myhc 334-352 dextramers att detektera antigen-specifika CD4 T-celler in situ med specificitet genom att utveckla en direktfärgningsprotokollet, varigenom man eliminerar behovet av att förstärka signalerna från användning av fluorofor-antikroppar, en närma vanligtvis används med användning av tetramerer. Dessutom har en omfattande metod för att utvärdera vävnader också tagits fram för att på ett tillförlitligt sätt räkna upp de frekvenser av antigen-specifika CD4 T-celler på plats 10. Detektion av antigen-specifika T-celler in situ medger avgränsning av händelser som orsakas av specifika antigena stimuli från de som orsakas av bystander-aktivering. Likaså in situ teknik också provides möjligheter att spåra kinetiken av antigen-specifika T-cell infiltration i målorganen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande:
Alla djurförsök har utförts i enlighet med de riktlinjer för skötsel och användning av försöksdjur och godkänts av University of Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.
1. Induktion av EAE
- För att inducera EAE, framställa peptid / komplett Freunds adjuvans (CFA)-emulsion, såsom beskrivs i 11 med följande modifikationer: Steg 1.1:. Förbereda PLP 139-151 vid en koncentration av 1 mg / ml i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) Steg 1.4:. använda 200 l av CFA-emulsion som innehåller 100 mikrogram av PLP 139-151 per djur Steg 1.4.1: att vaccinera tio djur, förbereda 2 ml emulsion genom att blanda 1 ml av PLP 139-151 (1 mg / ml i 1x . PBS) och en lika stor volym av CFA Steg 1.5: injicera 200 | il av emulsionen i delade doser subkutant i de två inguinala regioner (~ 75 | il vardera) och sternala regionen (~ 50 | il) av den fem-till-sex veckor gamla FEMAle SJL / J-möss. Steg 1.7 och 1.8 är inte tillämpliga för induktion av EAE.
2. Klinisk Scoring av EAE-möss och Skörd av Cerebrums
- Övervaka djuren för uppkomsten av kliniska tecken, och gör det sjukdoms svårighetsgrad dagligen från dag 9 efter immunisering enligt följande: 0 - friska; 1 - slapp svans eller bakbenssvaghet men inte båda; 2 - limp svansen och bakbenen svaghet; 3 - partiell förlamning av bakbenen; 4 - fullständig förlamning av bakbenen; 5 - döende eller döda 12.
- Euthanize mössen när de når en neurologisk poäng på 3 eller 4 med hjälp av CO2. Att avliva möss, pre-fylla dödshjälp kammaren först med CO 2 genom att vrida regulator av CO2 tank högst 6 psi och låta djuren att stanna i kammaren i ca 5 minuter för att uppnå fullständig syrebrist. Blötlägg euthanized djur i 70% alkohol. Omedelbart, placera djuren på en absorberande dyna och använda ett par av steril förceps och saxar utsätta hjärtan genom att skära genom brösthålan. Punktera rätt flikar och BEGJUTA genom att injicera 10 ml kall 1x PBS in i vänster kammare i hjärtat.
- Gräv skallen genom att klippa kraniet på ett cirkulärt sätt med hjälp av ett par av böjd sax, och försiktigt, vända skallben med pincett. Skörda hjärnan genom trubbig dissektion och med en ren skalpell, separat hjärnan från lillhjärnan. Placera cerebrum i ett rör innehållande kall 1 x PBS och lämna röret på is fram till bearbetning.
3. In Situ Färgning av Cerebral Sektioner med MHC klass II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers
- Förbered 4% PBS-buffrad lågsmältande agaros, smält genom upphettning vid 50 ° C och lämnar den i ett 40 ° C vattenbad fram till användning.
- Placera hjärnan i en engångs djup basform histologi kassett förvaras över is och häll smält (40 ° C) agaros. Omedelbart trycker hjärnan försiktigtmed pincett för att nedsänka vävnaden. Lämna kassetten på is under 15-20 min tills solidifiering är avslutat.
- Fyll vibratome bad med kyld 1x PBS. Fyll utrymmet runt vibratome bad med isbitar för att hålla temperaturen i PBS mellan 0 och 2 ° C. Fäst en ren rakblad i vibratome och ställa bladvinkeln till 15 °.
- Placering av vävnad i vibratome. Trim överskott agaros från alla sidor av den inbäddade vävnaden och något exponera den ventrala ytan av storhjärnan.
- Smear vibratome vävnadsblock med superlim och överföra agarosen inbäddade vävnaden över den limmade ytan genom att placera den exponerade ventrala ytan av cerebrum över limmet för tvärsektionering. Flytta inte vävnaden, när vävnaden är satt över blocket.
- Placera vibratome fältet med agaros-inbäddad vävnad på is, och låta limmet torka i 15 min.
- Under tiden placerar vävnaden chammarna en per brunn i en 24-brunnsplatta. Fyll brunnarna innehållande vävnads kammare med en ml kall 1 x PBS, och lämnar plattan på is.
- Förbered silkespapperkammarna genom att fästa ett tunt nylonnät till cut-änden av en 25 ml polypropylen pipett med hjälp av superlim; efter trimning överskottet mesh runt pipetten, skär pipetten till en längd av 1 cm från nätet.
- Sänk vibratome bladet till nivån av den övre ytan av vävnad; ställa vibratome hastigheten till 0,22 mm / sek och börja sektionering med en rörelse framåt för att göra 200 nm tjocka sektioner. Överför en cerebral avsnitt per brunn med användning av en vattenfärg mjuk borste i vävnaden kamrarna placeras i brunnarna på en 24-brunnsplatta. Håll plattan på is tills sektionering är klar för att förhindra vävnadsnedbrytning. Obs: Följ de här stegen för att få totalt tre parade delar från tre olika regioner i hjärnan rygg till ventrala ytan (Figur 2). Ett avsnitt frånvarje par (totalt tre sektioner) placerades i tre enskilda vävnadskamrar är betecknade för färgning med specifika dextramers (IA s / PLP 139-151) och anti-CD4. På samma sätt är en annan uppsättning av tre delar som är placerade i tre enskilda vävnadskammare utsetts för färgning med kontroll dextramers (IA s / TMEV 70-86) och anti-CD4.
- Överför de tre vävnadskamrar som innehåller de avsnitt som är avsedda för färgning med specifika dextramers in i tre brunnar i en 24-brunnsplatta med en kammare per brunn, i vilken, 300 pl av en cocktail innehållande allofykocyanin (APC)-konjugerade PLP 139-151 dextramers (2,5 ig / ml) och anti-CD4-fykoerytrin (PE, 5 pg / ml) i blockeringslösning (1 x PBS med 2% normalt getserum) har tidigare sattes. Täck brunnarna med ett lock.
- På samma sätt överför de tre vävnadskammare som innehåller de avsnitt som är avsedda för färgning med kontroll dextramers i tre brunnar i en 24-brunnar med en kammare per vill, i vilken var 300 pl av en cocktail innehållande APC-konjugerad TMEV 70-86 dextramers (2,5 | ig / ml) och anti-CD4-PE (5 | ig / ml) i blockerande lösning som tidigare tillsatts. Täck brunnarna med ett lock. Obs: Se Massilamany et al, 8 för beredning av dextramers, och de dextranmolekyler att förbereda dextramers var vänligen av Immudex, Köpenhamn, Danmark..
- Märk brunnarna, och linda plattan med aluminiumfolie och placera plattan på en gungande plattform inställd på mjuka rotationer i 1,5 timmar i mörker vid rumstemperatur.
- Efter inkubationsperioden, tvätta vävnadssnitt på den svängbara plattformen, genom att överföra de vävnadskamrar till en färsk brunn innehållande 1 ml kall 1 x PBS, och undvika dribbling innehållet i en väl in i den andra. Upprepa tvätt tre gånger, så att minst 10 min per tvätt. Se till att vävnadssnitt inte få torkade eftersom de kan klibba fast vid sidorna av kammaren.
- Fäst delarna genom att överföra vävnaden chammarna i en färsk brunn i 24-brunnsplatta innehållande 1 ml filtrerad 4% PBS-buffrad paraformaldehyd (pH 7,4) på en gungande plattform under 2 timmar med varsam rotation.
- Upprepa tvätt tre gånger enligt beskrivningen i steg 3.10.
- Placera de färgade och fixerade avsnitt om ett rent objektglas med hjälp av en akvarell mjuk borste. Torka överflödigt vatten utan att röra avsnittet, och montera sektionen med hjälp av monteringsmedel. Täck med en mikroskopisk täckglas och låta bilderna torka vid RT O / N i det mörka rummet.
- Förvara glasen i en ljustät slide förvaringslåda vid 4 ° C.
4. Induktion av EAM och Collection of Hearts
- Inducera EAM såsom beskrivs i referens 11.
- Euthanize mössen på dag 21 efter immunisering med rent kammare med CO2 gas cylinder, och dra djuren i 70% alkohol. Omedelbart placera djuren på en absorberande dyna och användning av en pincett och sax exponera hjärtats genom att skära genom brösthålan. Punktera rätt flikar och BEGJUTA genom att injicera 10 ml kall 1x PBS in i vänster kammare i hjärtat. Samla hjärtan och lägg i rör som innehåller kall 1x PBS.
5. In Situ Färgning av Heart Sektioner med MHC klass II (IA k) / Myhc 334-352 Dextramers
- Förbered 4% PBS-buffrad lågsmältande agaros, smälta genom upphettning vid 50 ° C och lämna den i en 40 ° C vattenbad fram till användning.
- Placera hjärtat i en engångs djup bas mögel histologi kassett förvaras på is, och häll smält 40 ° C agaros tills vävnaderna är helt under vatten enligt beskrivningen i steg 3.2.
- Följ steg 3.3.
- Trim överskott agaros från alla sidor av den inbäddade vävnaden och något utsätta basen av hjärtat. Smear vibratome vävnadsblock med superlim och överföra agarosen inbäddade vävnaden över den limmade ytan genom att placera den exponerade ytan avhjärta över limmet. Flytta inte vävnaden, när vävnaden är satt över blocket.
- Placera vibratome fältet med agaros-inbäddad vävnad på is, och låta limmet torka i 15 min.
- Följ stegen 3.5 och 3.6.
- Överför de hjärtsektioner med användning av en vattenfärg mjuk borste i vävnaden kammare placerade inuti brunnarna på en 24-brunnsplatta. Håll plattan på is tills sektionering är klar för att förhindra nedbrytning av vävnad. Anm: Gör så här för att få totalt åtta parade sektioner från toppen till botten av hjärtat (figur 2). Placera alla avsnitt i vävnadskammare, fördela upp till 3 sektioner per kammare. En sektion från varje par (totalt åtta avsnitt) är avsedd för färgning med specifika dextramers (lA k / Myhc 334-352) och anti-CD4. På samma sätt är en annan uppsättning av åtta sektioner avsedda för färgning med kontroll dextramers (IA k / RNas 43-56) och anti-CD4.
- Överförtre vävnadskamrar som innehåller de avsnitt som är avsedda för färgning med specifika dextramers in i tre brunnar i en 24-brunnsplatta med en kammare per brunn, i vilken, 300 pl av en cocktail innehållande APC-konjugerade Myhc 334-352 dextramers (2,5 | ig / ml) och anti-CD4-PE (5 pg / ml) i blockerande lösningen var tidigare sattes. Täck brunnarna med ett lock.
- På samma sätt överför de tre vävnadskammare som innehåller de avsnitt som är avsedda för färgning med kontroll dextramers i tre brunnar i en 24-brunnar med en kammare per väl där, 300 l av en cocktail innehållande APC-konjugerad RNas 43-56 dextramers (2,5 mikrogram / ml) och anti-CD4-PE (5 pg / ml) i blockerande lösningen var tidigare sattes. Täck brunnarna med ett lock.
- Märk brunnarna, och linda plattan med aluminiumfolie och placera plattan på en gungande plattform inställd på mjuka rotationer i 1,5 timmar i mörker vid rumstemperatur.
- Följ steg, från 3,10 till 3,11
- Upprepa tvätt thris som beskrivs i steg 3.10.
- Placera de färgade och fixerade sektioner (upp till tre sektioner / bildspel) på ett rent objektglas med hjälp av en akvarell mjuk borste. Torka överflödigt vatten utan att vidröra sektioner och montera sektionerna med hjälp av monteringsmedel. Täck med en mikroskopisk täckglas och låta bilderna torka vid RT O / N i det mörka rummet.
- Förvara glasen i en ljustät slide förvaringslåda på 4 ° C.
6. Analys av Dextramer + (dext +) CD4 + T celler på laserskanning konfokalmikroskop (LSCM) (gemensam för både hjärna och hjärta §)
- Använd Nikon A1-Eclipse 90i konfokalmikroskop system för rutinmässig scanning och förvärv av bilder. För att starta Klicka öppen, NIS Elements AR-programvara (version 4.13).
- Välj "TRITC" och "Cy5" kanaler från panelen. Excitation / emissionsvåglängder för respektive TRITC och Cy5 kanaler, 561,5 nm / 553-618 nm och 640,7 nm / 663-738 nm visas som standard.
- Tilldela pseudocolors "gröna" och "röd" för TRITC (CD4-PE) och Cy5 (dextramer-APC) kanaler, respektive.
- Placera bilden för att prövas enligt den mikroskopiska scenen och fokusera manuellt i 100 gångers förstoring. Ställ in "HV" till 110 och offset till "0". Klicka på "Fokus" och justera "spänning" att optimera lasrar.
- Klicka på "Fokus"; skanna avsnittet från toppen till botten, och ställ in "Z" nivå för bildtagning. Klicka på "CH-serien" och hämta bilden sekventiellt. Identifiera dext + CD4 + T-celler som förekommer som gula punktat celler baserat på co-lokalisering av signaler som genereras från både röda (dextramers) och grönt (CD4) kanaler.
- Använd Olympus FV500-BX60 konfokalmikroskop för enkel kvantitativ räkning av DEXT + CD4 + T-celler. Till att börjaklicka öppen, FluoView programvaran (version 4.3).
- Välj färgämnen "Cy3" och "Cy5" från rullgardinsmenyn och klicka på "Apply" för att ladda respektive lasrar. OBS: excitation / emissionsvåglängder för Cy3 (543 nm / pseudocolored "grön", CD4-PE) och Cy5 (633 nm / pseudocolored "red", dextramer-APC) kanaler.
- Placera objektglaset som skall undersökas på objektglaset, och fokusera manuellt i låg förstoring (4X eller 10X). Klicka på "Fokus" medan Cy3 lasern är på, och fokusera den inflammatoriska fokus.
- Ändra målet till 100 gångers förstoring. Ställ filstorleken till "512/512" från rullgardinsmenyn. Klicka på "Fokus" och justera värdena för "PMT", "Gain" och "Offset" parametrar för att optimera de lasrar separat för Cy3 och Cy5.
- Klicka på "Z stadiet" och klicka sedan på "Fokus", medan de båda lasrarna är på. Settjockleken på "Z-scenen" genom att klicka på "upp" och "ner" pilar. Ställ in "Z" intervall till 2 pm.
- Klicka på "Stop", och välj "Seq123". Klicka sedan på "XYZ" och börja skaffa "Z" serie bilder för det valda området inom inflammatoriska fokus. Spara "Z seriebilder" som AVI-filer. För att spara bildfiler markerar du bilden från "Z-seriebild", och sedan spara som "tiff" format.
- Undersök tre hopkopplade sektioner från storhjärnan, där en uppsättning av tre sektioner färgades med IA s / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 och den andra uppsättningen av tre sektioner med IA s / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 att utföra kvantitativ analys.
- På samma sätt, analysera åtta parade sektioner för hjärta, där, var en uppsättning av åtta sektioner färgas med IA k / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 och en annan se-t av åtta sektioner med RNas 43-56 dextramers/anti-CD4.
- Undersök 10 till 15 inflammatoriska härdar per avsnitt i storhjärnan, och i varje inriktning, skaffa en uppsättning av 15 till 25 seriebilder i följd.
- Undersök totalt 20 inflammatoriska härdar från alla de åtta avsnitten i hjärta och från varje inriktning förvärvar 10 till 15 seriebilder i följd. Ta de "Z" seriebilder genom att skanna bilderna i en "horisontell-vertikal up-horisontal-vertikal ned" rörelsen, så att upprepning av "Z" serie inom samma fokus undviks.
- När 'Z' serie bilderna tas, namnge filerna genom att identifiera bildnummer, namn på de sektioner och antalet "Z" serie bilder tagna.
- Använd 'ImageJ' programvara för att räkna DEXT + CD4 + T-celler i förhållande till det totala antalet av CD4 + T-celler. Välj "typ av disk" i "ImageJ, kolla &# 8216, visar alla "och börja räkna genom att klicka i mitten av varje cell och fortsätter att räkna i olika" Z "serie bilder genom att använda pilarna sida. Efter att ha räknat alla CD4-T-celler genom att välja en annan typ av räknare och räkna CD4 + dext +-T-celler. Klicka på fliken resultat för att få det totala antalet räknade celler med två olika räknare.
- För att få det totala antalet, till antalet celler i alla de "Z" seriebilder som representerar alla de tre hjärn sektioner eller alla åtta hjärtsektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna rapport, in situ bestämning av antigenspecifika, autoreaktiva CD4 T-celler genom direkt färgning med MHC klass II dextramers beskrivs. Nyklippt cerebrala avsnitt härrör från EAE-möss och färgas med cocktails som innehåller PLP 139-151 (specifik) eller TMEV 70-86 (kontroll) dextramers och anti-CD4. Den översta panelerna i Figur 1 visar LSCM analys av cerebrala sektioner costained med PLP 139-151 dextramers (röd) och CD4-antikropp (grön), där de dubbel positiva celler verkade gul. En sådan funktion var frånvarande i sektioner färgade med TMEV 70-86 (kontroll) dextramers (bottenplåtar). De costained (DEXT + CD4 +) celler visade punktat prickar runt periferin. Kvantitativ analys av PLP-specifika T-celler i de cerebrala sektionerna involverade följande steg (figur 2): 1) Sektioner av tre par gjordes, och en sektion från varje par färgades separat med anti-CD4-och PLP 139-151 dextramers. På samma sätt har en annan uppsättning av tre sektioner färgas med anti-CD4 och kontroll (TMEV 70-86) dextramers. 2) Från en given sektion, var inflammatoriska foci (10 till 15) identifieras baserat på anti-CD4-färgning. 3) En uppsättning av "Z" seriebilder (15 till 25) togs från varje fokus sekventiellt från topp till botten med ett intervall på 2 ^ m mellan varje. I huvudsak var 10 till 15 liknande uppsättningar av "Z" seriebilder som representerar lika många inflammatoriska härdar analyseras i varje avsnitt. 4) I enskilda bilder, CD4 + celler (gröna), cellerna positiva för båda dextramers (röd) och CD4 (grön) som verkade som gula punktat celler räknades genom att markera dem individuellt med hjälp av programvara med öppen källkod, ImageJ, och slutligen, en totalsumma erhölls för varje avsnitt genom att lägga till antalet celler räknades i samtliga 'Z'-seriella bilderna. Eftersom att cellerna var märkta, möjligheten att sammanfatta de celler i flera bilder som äröverlappning eliminerades. Sålunda kan man uppnå tillförlitlig räkning av DEXT +-celler i förhållande till det totala antalet celler som uttrycker CD4.
Denna studie har utvidgats ytterligare för att demonstrera användningen av dextramer reagens för detektering av antigen-sensibiliserade T-celler in situ i EAM inducerades med Myhc 334-352 i A / J-möss, som är också en T-cell-förmedlad sjukdom 13,14. Åtta parade hjärtsektioner erhölls, var och en 200 ^ m tjock, från EAM-möss (Figur 2). Från varje par, var ett avsnitt (med totalt 8 avsnitt) färgades med Myhc 334-352 dextramers och anti-CD4, medan en annan uppsättning av sektioner (8 totalt) färgades med RNas 43-56 dextramers (kontroll) och anti -CD4. Tjugo uppsättningar av "Z" seriebilder som motsvarar att många inflammatoriska härdar som representerar samtliga åtta avsnitt förvärvades i tur och ordning som ovan (figur 2). I huvudsak en given uppsättning av "Z" seriell imåldrar bestod av 10 till 15 enskilda representerade en enda inflammatorisk fokus. Analys av dessa bilder genom LSCM visade närvaron av celler positiva för Myhc 334-352 dextramers (röd), och CD4 (grön) och oväntat, de celler bundna med både dextramers och CD4 verkade som gula punktat celler (Figur 3, krönskivor) . Bakgrunden färgning för kontroll dextramers var försumbar (Figur 3, bottenpaneler). Det totala antalet DEXT + CD4 + T-celler och det totala antalet av CD4 + T-celler bestämdes för varje sektion och räkningen från alla sektionerna sattes samman för att erhålla det totala antalet för varje delmängd (DEXT + CD4 + T-celler, CD4- + T-celler).
Figur 1. Detektering av PLP-specifika CD4 T-celler genom in situ- färgning med PLP 139-151 dextramers. EAE inducerades i SJL möss genom immunisering av djuren med PLP 139-151 i CFA. Vid uppsägning var cerebrums samlats in från EAE-möss inbäddade i 4% agaros, och avsnitten gjordes med vibratome. Efter färgning med cocktails som innehåller antingen PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 eller TMEV 70-86 dextramers (kontroll) / anti-CD4 och fastställande med 4% PBS-buffrad paraformaldehyd, fick sektionerna tvättas och monteras för undersökning med LSCM. Top paneler: två separata sektioner färgade med PLP 139-151 dextramers/anti-CD4. Botten paneler: två separata sektioner färgade med TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4. Vänster panel: CD4, grönt; Middle panel: dextramers, red; Höger panel: fusione (pilar, DEXT + CD4 + T-celler). Ursprunglig förstoring 1000 X (som antogs:.. Massilamany et al, 2014 Direkt infärgning med MHC klass II Dextramers Tillåter Detektion av antigen-specifika, autoreaktiva CD4 T Cells In Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. En metod för att kvantifiera DEXT + celler i hjärnan och hjärtan. Kopplade sektionerna är gjorda av storhjärnan eller ytteröra-utskurna hjärtan som visas (panel 1). Ett avsnitt från varje par som motsvarar de angivna organ utsågs för färgning med specifika dextramers (storhjärnan, PLP 139-151 dextramers, hjärta, Myhc 334-352 dextramers), och den andra uppsättningen av sektioner för kontroll dextramers (cerebrum, TMEV 70 - 86, hjärta, RNas 43-56). Efter fixering och montering, var sektionerna undersöktes för att lokalisera inflammatoriska härdar baserat på färgning med CD4 genom LSCM (original magstorings, 40X) (panel 2). Varje inflammatorisk fokus som visualiseras i tredimensionella (3D) syn (panel 3) utsattes för en uppsättning av "Z" seriebilder i följd (panel 4). I alla bilderna, var cellerna positiva för både specifik eller kontroll dextramers och CD4 eller CD4 enbart räknas med hjälp av 'ImageJ "programvara (antagen:.. Massilamany et al, 2014 Direkt färgning med MHC klass II Dextramers Tillåter detektion av antigen- Specifika, autoreaktiva CD4 T-celler i Situ PLoS ONE 9 (1):.. e87519) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Detektion av hjärtmyosin-specifika CD4 T-celler genom in situ-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Till skillnad från MHC klass I tetramers, fortsätter användningen av MHC klass II tetramers för rutinmässiga tillämpningar att vara en utmaning, särskilt för att räkna upp utgångsfrekvenserna för låg affinitet autoreaktiva CD4 T-celler, delvis på grund av deras aktivering beroende 6,15-17. Nyligen har detta problem kringgås genom att skapa nästa generationen av tetramerer, kallade "dextramers", tillåter oss att detektera antigen-specifika CD4 T-celler för ett antal autoantigener, t.ex. PLP 139-151, MOG 35-55 och Myhc 334 - 352 8. I denna rapport, för första gången, nyttan av MHC klass II dextramers att detektera och kvantifiera självreaktiva CD4 T-celler in situ har visats med hjälp av hjärnsektioner från EAE-möss, och hjärtsektioner från EAM möss. På en reaktion basis, dextramers erbjuder fördelen att kräva en liten mängd MHC / peptidkomplex. I detta protokoll, kräver att varje reaktion endast 0,75 pg av MHC / peptid monomerer. Dessutom STAining med dextramers är en enstegsreaktion, eftersom dextramers är saminkuberades med anti-CD4, och hela proceduren, från vävnad sektione till färgning, kan vara klar på mindre än en dag. I motsats till de publicerade protokollen för in situ-färgning med konventionella tetramerer involverar vanligen amplifieringsförfaranden i vilka de fluorescerande signalerna förstärks med användning av sekundära antikroppar för fluoroforer. Som ett resultat kan färgningsförfaranden ta upp till tre dagar att slutföra 18-20.
Vidare har användningen av dextramers i cerebrala sektioner medger detektion av antigenspecifika T-celler djupt i de vävnadssnitt, till och med upp till 50 | im. Det antecknades att PLP 139-151 DEXT + CD4 + celler befanns vara placerad både perivaskulärt och även inom parenkymet. Vidare, var intensiteten av signaler som alstras från Myhc 334-352 dextramers lågt i hjärtsektioner i jämförelse med de PLP 139-151 dextramers i hjärn sekningar (Figur 1), och en sådan variation kan återspegla de egenskaper som är unika för varje organ. En sådan variabel är lipidinnehållet som finns i stora mängder i hjärnvävnad i motsats till hjärtvävnad som innehåller huvudsakligen tvärstrimmiga muskelfibrer som kan potentiellt begränsar lätt diffusion av dextramers i det inflammatoriska fokus. Till stöd för denna uppfattning var Myhc 334-352 DEXT + celler detekterades endast till ett djup upp till 20 | im i majoriteten av hjärtsektioner. Dessutom Myhc 334-352 DEXT + celler var närvarande utspridda genom hjärtmuskeln vilket tyder på det diffusa karaktären av inflammatoriska infiltrat i myocarditic lesioner.
I allmänhet kan två viktiga faktorer negativt påverka detekteringen av antigen-specifika T-celler in situ genom LSCM. För det första kan inte tillräckliga signaler som utsänds av fluoroforer leda till behovet av att förstärka signalerna med användning av fluorofor-antikroppar. För det andra, såsom en indirekt fläckning kan undergräva specificitet, som bakgrundsfärgning för kontrollreagens också kan öka proportionellt 18,19. Dessa begränsningar kringgicks genom direkt färgning med dextramers. Även om, detektion av CD4 T-celler har framgångsrikt visat med färska avsnitt, användning av dextramer reagenser i frusna vävnader kräver ytterligare studier, som kan vara en utmaning att bevara vävnads-integritet kan vara svårt på grund av tendensen för vävnader att få upplöstes under olika färgning steg 18,19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklarerades.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av American Heart Association och Barnens Kardiomyopati Foundation (SDG2462390204001) och National Institutes of Health (HL114669). CM är en mottagare av en postdoktoral forskning stipendium bidrag som beviljas av Myokardit Foundation, NJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4 °C |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4 °C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4 °C |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4 °C |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 °C |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4 °C |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4 °C |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 °C | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4 °C | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4 °C | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
- Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
- Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
- Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
- Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
- Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
- Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
- Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
- Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
- Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
- Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
- Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
- Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
- Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).
