ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא <30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.
Abstract
שיטות בידוד המיטוכונדריה שתוארו קודם לכן באמצעות צנטריפוגה ההפרש ו / או צנטריפוגה שיפוע Ficoll דורשות 60 עד 100 דקות כדי להשלים. אנו מתארים שיטה לבידוד המהיר של המיטוכונדריה מביופסיות של יונקים באמצעות Dissociator רקמה מסחרי וסינון ההפרש. בפרוטוקול זה, הומוגניזציה ידנית הוחלפה במחזור הומוגניזציה הסטנדרטי של Dissociator הרקמה. זה מאפשר למדים ולתפעול עקבי של רקמה שאינה מושגת בקלות עם הומוגניזציה ידנית. בעקבות ניתוק רקמות, homogenate מסונן דרך מסנני רשת ניילון, אשר מבטלים צעדי צנטריפוגה חוזר על עצמו. כתוצאה מכך, בידוד המיטוכונדריה יכול להתבצע בפחות מ 30 דקות. פרוטוקול בידוד זה תשואה של כ 2 x 10 10 מיטוכונדריה מוסמכת קיימא ונשימה מ0.18 ± 0.04 גרם דגימת רקמה (משקל רטובה).
Introduction
מיטוכונדריה קיימת בכל תא ותא בגוף מלבד תאי דם אדומים ומעורבים במספר רב של תהליכים תאיים וחילוף חומרים חשובים 1-4. בגלל פונקציות רבות אלה, נזק המיטוכונדריה יכול להיות השפעות מזיקות 3. על מנת לחקור מספר שיטות בידוד המיטוכונדריה פונקציה ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה תוארו. החשבונות הראשונים שפורסמו ממועד בידוד המיטוכונדריה ל1940s 5-8. הניסיון המתועד הראשון הפגין בידוד המיטוכונדריה על ידי שחיקה רקמת כבד במכתש ואחריו צנטריפוגה בתמיסת מלח במהירות נמוכה 5,8. מאוחר יותר, קבוצות אחרות הרחיבו בעניין ההליך המקורי והפגינו חלוקה רקמות מבוססת על צנטריפוגה ההפרש 6-8. שיטות המוקדמות אלה היוו את הבסיס לטכניקות הנוכחיות אשר לעתים קרובות לשלב הומוגניזציה, ו / או צנטריפוגה ההפרש 9-15. מספר homogenizatiובצנטריפוגה צעדים משתנה בין פרוטוקולים. צעדים חוזרים ונשנים אלה להגדיל את הזמן לבידוד המיטוכונדריה וסופו של דבר להפחית את הכדאיות. בנוסף, הומוגניזציה ידנית יכולה לגרום לתוצאות נזק ועולה בקנה אחד המיטוכונדריה אם לא מבוקרת 10,16 כראוי.
לאחרונה, השתמשנו צנטריפוגה הומוגניזציה וההפרש לבודד את המיטוכונדריה להשתלה לרקמת שריר לב 17,18. הליך בידוד ממושך זה נדרש כ 90 דקות והיישום הקליני של שיטה זו היה אפוא מוגבל. כדי לאפשר שימוש טיפולי אקוטי בטיפול קליני וכירורגים שפיתחנו הליך בידוד המיטוכונדריה מהיר שניתן לבצע בפחות מ 30 דקות.
היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם כי ניתוק רקמה סטנדרטי מאפשר למדים ולתפעול עקבי של רקמה שאינה מושגת בקלות עם הומוגניזציה ידנית. בadditיון, השימוש בסינון ההפרש במקום של צנטריפוגה ההפרש מבטל זמן רב וצעדי צנטריפוגה חוזר על עצמו ומאפשרים לבידוד מהיר יותר של מיטוכונדריה המוסמכת נקיה במיוחד, בת קיימא ונשימה.
היכולת לבודד מיטוכונדריה המוסמכת קיימא ונשימה בפחות מ 30 דקות מאפשרת ליישום קליני. יש פרוטוקול בידוד זה פוטנציאל לשימוש בניתוח מעקפי השתלה (CABG) ונהלים טיפוליים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הכנה
- הכן 1 M K-HEPES מלאי פתרון (כדי להתאים את pH 7.2 עם KOH).
- הכן 0.5 M K-EGTA מניות פתרון (כדי להתאים את pH 8.0 עם KOH).
- הכן 1 M KH 2 PO 4 פתרון מניות.
- הכן 1 M MgCl 2 מניות פתרון.
- הכן homogenizing מאגר 300 סוכרוז מ"מ, 10 מ"מ K-HEPES, ו1 מ"מ K-EGTA (pH 7.2). חנות ב 4 ° C..
- הכן סוכרוז 250 מ"מ נשימת הצפת, 2 מ"מ KH 2 PO 4, 10 מ"מ MgCl 2, 20 מ"מ K-HEPES חוצץ (pH 7.2) ו0.5 מ"מ K-EGTA (pH 8.0). חנות ב 4 ° C..
- הכן 10x PBS מלאי פתרון על ידי המסת 80 גרמו של NaCl, 2 גרם של KCl, 14.4 גרם של Na 2 HPO 4, ו2.4 גרם של KH 2 PO 4 לH 1 ליטר מזוקק פעמיים 2 O (pH 7.4).
- הכן PBS 1x ידי pipetting 10x מ"ל 100 PBS לתוך H 1 ליטר מזוקק פעמיים 2 O.
- הכן מלאי Subtilisin על ידי שקילת 4 מ"ג של Subtilisin בלצינור 1.5 מ"ל microfuge. אחסן ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- הכן מלאי BSA על ידי שקילת 20 מ"ג של BSA לתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge. אחסן ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
בידוד מיטוכונדריאלי (איור 1)
- מייד לפני הבידוד, לפזר Subtilisin ב 1 מ"ל של homogenizing הצפת.
- מייד לפני הבידוד, לפזר BSA ב 1 מ"ל של homogenizing הצפת.
- לאסוף שתי דגימות רקמה טריות באמצעות אגרוף 6 מ"מ דגימת ביופסיה וחנות ב1x PBS בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
- העבר את שני 6 האגרופים מ"מ של רקמה לצינור C ניתוק המכיל 5 מ"ל של קר כקרח homogenizing הצפת.
- Homogenize הרקמות על ידי התאמת צינור C ניתוק על Dissociator הרקמה ובחר את המחזור שנקבע מראש המיטוכונדריה הבידוד (60 הומוגניזציה שניות).
- הסר את צינור C הניתוק לדלי קרח.
- הוסף 250 μl של Subtilisin מלאי פתרון לhomogenate, מערבב על ידי היפוך ודגירת homogenate על קרח עבור 10 דקות.
- מניחים מסנן רשת 40 מיקרומטר על צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ומראש רטוב המסנן עם homogenizing הצפת ולסנן homogenate לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
- הוסף 250 μl של מוכן טרי BSA מלאי פתרון לתסנין ומערבבים על ידי היפוך.
הערה: השמט שלב זה אם נדרש נחישות חלבון המיטוכונדריה. - מניחים מסנן 40 מיקרומטר על צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ומראש רטוב המסנן עם homogenizing הצפת ולסנן homogenate לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
- מניחים מסנן 10 מיקרומטר על צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ומראש רטוב המסנן עם homogenizing הצפת ולסנן homogenate לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח.
- העבר את התסנין לשני 1.5 מ"ל צינורות microfuge מראש צונן צנטריפוגות ב 9,000 XG 10 דקות ב4 ºC.
- הסר supernatant מחדש להשעות ולשלב כדורים ב 1 מ"ל של קרח נשימת מאגר קר.
ATP Assay
הערה: כדי לקבוע את הפעילות המטבולית של מיטוכונדריה המבודדת assay הארה ATP יכול להתבצע באמצעות ערכת assay ATP. הפרוטוקול, חומרים כימיים ותקנים סופקו בערכת assay. סיכום של ההליך מתואר להלן.
- לאזן ריאגנטים ערכה לRT.
- הכן 10 מ"מ ATP מלאי פתרון על ידי המסת גלולה ATP lyophilized ב1,170 μl מים מזוקקים פעמיים. לאחסן ATP פתרון סטנדרטי צילומים ודגימות של המיטוכונדריה מוכנות על קרח.
- הוסף 5 מ"ל של תמיסת מצע הצפת לבקבוקון של פתרון מצע lyophilized. מערבבים בעדינות ומניח בחושך.
- הוספה של נשימת הצפת 100 μl לכל הבארות של חלק תחתון שחור, אטום, 96 צלחת גם.
- הוסף 10 μl של המיטוכונדריה מהדגימות מוכנות היטב כל oשחור fa, תחתון אטום, 96 צלחת גם. הערה: דוגמאות הם מצופים בשלושה עותקים. כולל שורה לסטנדרטים ושלוש בארות לביקורת השלילית (נשימת הצפת).
- הוסף 50 μl של פתרון תמוגה תא של יונקים לכל הבארות, לרבות תקנים ובקרות.
- דגירה את הצלחת על 37 ºC למשך 5 דקות על שייקר מסלולית ב125 סל"ד.
- במהלך הדגירה להכין סטנדרטים ATP בריכוזים של 0.1 מ"מ, 0.05 מ"מ, 0.01 מ"מ, 0.005 מ"מ, 0.001 מ"מ, ו0.0001 מ"מ ATP מ10 מ"מ ATP מלאי הפתרון. סטנדרטים חנות על קרח.
- לאחר הדגירה, להוסיף 10 μl של תקני ATP למתאימים בארות כמצוין במפת הצלחת. הערה: תקנים מבוצעים בשני עותקים.
- הוסף 50 μl של פתרון המצע מחדש היטב כל אחד.
- דגירה את הצלחת על 37 ºC בייקר מסלולית במשך 5 דקות ב125 סל"ד.
- תוכנה פתוחה Gen5 1.11 במחשב מקושר עם ספקטרופוטומטר.
- תחת "צור פריט חדש ", לחץ על" ניסוי ".
- לחץ על "פרוטוקול ברירת מחדל". לחץ על "אישור".
- בעמודה השמאלית, בחר באפשרות "פרוטוקול", ואז "סדר דין".
- בחר "עיכוב". הגדר ל0:10:00. לחץ על "אישור".
- בחר "קראו". בחר "הארה" מתפריט הנפתח. התאם את הגדרות אחרות לפעולות הבאות: קראו סוג Endpoint, אינטגרציה שעת 0: 01.00 MM: SS.ss, סינון סטי 1, פליטת חור, אופטיקה מיקום עליון, רגישות 100, למעלה Probe אנכי אופסט 1.00 מ"מ.
- כאשר הצלחת מוכנה להיות מנותח, לחץ על הסמל "קרא פלייט" בשורה העליונה. לחץ על "קרא". כאשר ספקטרופוטומטר נפתח, למקם את הצלחת למגש עם גם A1 בפינה השמאלית העליונה. תיבה עם הטמפרטורה תיפתח. לחץ על "קרא". הערה: ערכים גבוהים יותר לתאם עם רמות ATP מוגברות ופעילות המטבולית גבוהה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דמות מתארת את הצעדים פרוצדורליים בבידוד של המיטוכונדריה באמצעות ניתוק רקמות וסינון ההפרש מוצגת באיור 1. זמן פרוצדורליים סה"כ הוא פחות מ 30 דקות.
דגימות רקמה התקבלו באמצעות ביופסית 6 מ"מ. משקל רקמה היה 0.18 ± 0.04 g (משקל רטוב). מספר המיטוכונדריה מבודדת כפי שנקבע על ידי ספירת חלקיקים בגודל היה 2.4 x 10 10 ± 0.1 x 10 10 מיטוכונדריה לשרירי שלד ו2.75 x 10 10 ± 0.1 x 10 10 מיטוכונדריה להכנות כבד (איור 2 א). כדי לאפשר למספר המיטוכונדריה השוואה נקבע גם על ידי hemocytometer. מספר מיטוכונדריאלי היה לזלזל כפי שנקבע על ידי hemocytometer כ0.11 x 10 10 ± 0.04 x 10 10 מיטוכונדריה לשרירי שלד ו0.34 x 10 10 ± 0.09 x 10 10 מיטוכונדריה להכנות כבד (F2A igure). קוטר מיטוכונדריאלי, כפי שנקבע על ידי מונה חלקיקים בגודל מבוסס מוצג באיור 2. מעקב הנציג מציג את המיטוכונדריה המבודדת מותאמת לשפה מקומית תחת לשיא אחד עם קוטר ממוצע של 0.38 ± 0.17 מיקרומטר בהסכם עם דיווחים קודמים 7.
חלבון מיטוכונדריאלי / g (משקל רטוב) החל רקמה כפי שנקבע על ידי חומצת assay Bicinchoninic (BCA) היה 4.8 ± 2.9 מ"ג / g (משקל רטוב) ו7.3 ± 3.5 מ"ג / g (משקל רטוב) לשרירי שלד ודגימות כבד, בהתאמה (איור 2C).
טוהר מיטוכונדריאלי נקבע על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הולכה ומוצג באיור 2 ד. המיטוכונדריה מוצג לאלקטרונים צפופים עם פחות מ 0.01% שבורים או פגום. זיהום על ידי חלקיקים שאינן המיטוכונדריה הוא פחות מ 0.001%.
כדאיות מיטוכונדריאלי נקבעה על ידי MitoTracker האדום כדה בעברתואר 17,18. התוצאות שלנו מראות כי מיטוכונדריה המבודדת לשמור (איורים 3 א - ג) קרום פוטנציאליים.
ATP נקבע באמצעות ערכת assay זורח. מפת צלחת עבור assay ATP מוצגת באיור 4. הסטנדרטים ATP היו מצופים בשני עותקים. דגימות מיטוכונדריאלי ובקרות שליליות היו מצופים בשלושה עותקים. תוכן ATP היה 10.67 ± 4.38 nmol / חלבון מ"ג המיטוכונדריה ו14.83 ± 4.36 nmol / חלבון המיטוכונדריה מ"ג לשריר שלד ודגימות כבד בהתאמה (איור 3D).
נשימה המיטוכונדריאלי הוערכה באמצעות אלקטרודה סוג קלארק כפי שתואר קודם לכן 17,18. שיעור צריכת חמצן מיטוכונדריאלי היה 178 O 2 / דקות / חלבון ± 17 ננומטר מ"ג המיטוכונדריה לשרירי שלד ו176 ± 23 2 / דקות / חלבון המיטוכונדריה מ"ג O ננומטר להכנות כבד. מדד שליטה בדרכי הנשימה ערכים (RCI) היו 2.45 ± 0.34ד 2.67 ± 0.17 לשרירי שלד והכנות מדגם כבד בהתאמה (3E איור). תוצאות אלו דומות לאלו שדווחו במחקרים הקודמים שלנו באמצעות יצירת הומוגניות ידנית וצנטריפוגה ההפרש לבודד את המיטוכונדריה 17-18.
איור סכימה .1 לבידודה של המיטוכונדריה באמצעות ניתוק רקמות וסינון ההפרש. העברה () שני אגרופים דגימת ביופסיה 6 מ"מ עד 5 מ"ל של homogenizing מאגר בצינור C הניתוק וhomogenize הדגימות באמצעות תכנית הומוגניזציה 1 דקות של Dissociator הרקמה. (B) הוסף 250 μl Subtilisin פתרון מניות לhomogenate בדיסוציאציה צינור C ולדגור על קרח למשך 10 דקות. (C) סינון homogenate דרך מראש -wetted 40 מסנן רשת מיקרומטר בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח ולאחר מכן להוסיף 250 μl של פתרון מניות BSA לתסנין. (ד ') מחדש מסנן התסנין דרך מסנן רשת חדש-רטוב מראש 40 מיקרומטר ב50 מ"ל צנטריפוגות חרוטי על קרח. (E) Re-מסנן התסנין דרך מסנן חדש ולח מראש 10 מיקרומטר רשת בצינור צנטריפוגות 50 מ"ל חרוטי על קרח. (F) העבר את התסנין ל1.5 מ"ל צינורות microfuge ו צנטריפוגות ב 9,000 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C.. (G) הסירו את supernatant מחדש להשעות ולשלב את כדורים של המיטוכונדריה ב1 מ"ל נשימת הצפת. זמן הליך כולל הוא פחות מ 30 דקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ד / 51,682 / "width =" 51682fig2highres.jpg 600 "/>
איור 2 תשואה וטוהר מיטוכונדריאלי. חלבון מיטוכונדריאלי (ג) (א) מספר המיטוכונדריה hemocytometer ודלפק גודל חלקיקים מבודד מ0.18 ± 0.04 גרם רקמה (משקל רטוב) לשריר ובכבד שלד. גודל מיטוכונדריאלי (מ"ג / g) החלוקה כפי שזוהה על ידי דלפק גודל חלקיקים (ב '). משקל מ"ג / גרם רקמה רטוב לשריר ובכבד שלד. (D) מיקרוסקופי אלקטרונים חודרי תמונה של מיטוכונדריה המבודדת. סרגל קנה מידה הוא 100 ננומטר. חצים מצביעים על זיהום אפשרי על ידי חלקיקי המיטוכונדריה שאינה ומיטוכונדריה הפגומה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
< br /> איור 3 כדאיות מיטוכונדריאלי. photomicrographs נציג של מיטוכונדריה המבודדת () תחת תאורה בניגוד שלב ו( B, C) תחת הקרינה, עם המיטוכונדריה שכותרתו עם MitoTracker האדום CMXRos. ברים סולם הם 25 מיקרומטר (A, B) ו5 מיקרומטר (C). תמונות אלה מצביעים על כך שהמיטוכונדריה נשמרה פוטנציאל הממברנה. חצים מצביעים על מיטוכונדריה חסרות חלבון קרום פוטנציאלי או פסולת (ד ') ATP תוכן nmol / מ"ג המיטוכונדריה, כפי שנקבע על ידי assay ATP ו( E) RCI (מדינה 3/4 מדינה) כפי שנקבע על ידי אלקטרודה קלארק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
עומס / 51,682 / 51682fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. איור מפת .4 פלייט עבור assay ATP מפת הצלחת זו ממחישה כיצד להגדיר את הסטנדרטים (A1 - A12), דגימות מיטוכונדריה (B1 - C6), ובקרות שליליים (C7 - C9) עבור assay ATP. במהלך assay, של נשימת הצפת 100 μl, 50 μl של פתרון תמוגה תאים יונקים ו50 μl של פתרון מצע מחדש מתווספים לכל הבארות (A1 - C9).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לבודד בהצלחה מיטוכונדריה תוך שימוש בפרוטוקול זה הוא חיוני כדי לשמור על כל הפתרונות ודגימות רקמה על קרח כדי לשמור על יכולת קיום של המיטוכונדריה. גם כאשר שמר על קרח, מיטוכונדריה המבודדת תפגין ירידה בפעילות תפקודית לאורך זמן 19. אנו ממליצים שכל הפתרונות והתוספות להיות מוכנים מראש. אנחנו טרום לשקול ולאחסן Subtilisin ב4 aliquots מ"ג ב1.5 מ"ל צינורות microfuge ולאחסן אותם ב-20 מעלות צלזיוס. באופן דומה BSA נשקל מראש ולאחסן ב20 aliquots מ"ג ב1.5 מ"ל צינורות microfuge שניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. רק לפני שימוש הצינורות יוסרו מ-20 מעלות צלזיוס וSubtilisin וBSA מומסים ב 1 מ"ל של homogenizing מאגר לשימוש בהליך בידוד המיטוכונדריה.
שני אגרופים ביופסיה מרקמת שריר שלד שהושגו באמצעות ביופסית 6 מ"מ לספק מיטוכונדריה מספיקה לשימוש בהליכים קליניים וכירורגית להתערבויות טיפוליות 17-18. כדי לאמוד את מספר המיטוכונדריה שהשתמשנו בשתי שיטות, ספירת גודל hemocytometer וחלקיקים. השימוש בספירת חלקיקים בגודל מומלץ. דלפק גודל החלקיקים משתמש עכבה חשמלית למדידת הנפח של חלקיקים עוברים דרך צמצם של גודל מוגדר. דלפק גודל חלקיקים הוא יקר אבל מספק אומדנים מדויקים ואמינים והוא משתמש עצמאי. מספר מיטוכונדריאלי שהוערך על ידי hemocytometry הוא חסכוני יותר. המחקרים שלנו הראו כי בשיטה זו מספקת אומדנים משתנים, כי הם כ סדר גודל אחד פחות מזה שהושג באמצעות דלפק גודל חלקיקים. יש לנו גם לציין כי ספירה מתקבלת על ידי hemocytometer תלויה מאוד במשתמש. אנו מציעים כי על מנת להבטיח הערכות עקביות כל סעיפי האישום באמצעות hemocytometer צריך להתבצע על ידי אדם אחד.
מצאנו ערכות assay ATP להיות שימושי לקביעת פונקציה של המיטוכונדריה. ההערכה כולל את כל r ההכרחיeagents ומספק שיטה פשוטה ומהירה לקביעת הפעילות המטבולית של מיטוכונדריה מבודדת. Assay ATP מספק תוצאות דומות לאלה שהושגו באמצעות אלקטרודה קלארק סוג ולכן הוא תואם עם ניתוח נתונים קודם 20-21.
יתרון עיקרי של פרוטוקול בידוד המיטוכונדריה שלנו הוא שהיא מאפשרת לבידודה של תשואה גבוהה של מיטוכונדריה קיימא, הנשימה המוסמכת ללא זיהום בפחות מ 30 דקות. סינון ההפרש במקום של צנטריפוגה ההפרש מפחית באופן משמעותי זמן הליך. פרוטוקולים אחרים לשלב כמה צעדי צנטריפוגה עם זמן בידוד כולל להיות 60 דקות ל100 דקות 13-17. יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא שהומוגניות הרקמה טופל. Dissociator הרקמה המסחרי מספק מחזור סטנדרטי ומניב תוצאות עקביות לשחזור. זאת בניגוד להומוגניות במדריך זה כפוף לשינויים ומשתמשיםחוסר עקביות. השיטה שלנו לבידוד המהיר של המיטוכונדריה באמצעות ניתוק רקמות וסינון ההפרש מספקת מסגרת זמן בידוד תואמת להתערבות טיפולית קלינית וכירורגית 17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
טופלו כל בעלי החיים בהתאם להנחיות מוסדיות הנוכחיות. אין לנו אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי לאומי ללב, ריאות ודם מכון גרנט HL- 103,542, וTrailblazer פרס נכבד BCH הרדמת המחקר של הקרן לCAP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma Aldrich | 84100 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Substilsin A | Sigma Aldrich | P5380 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P5379 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S6191 | |
| KCl | Fisher Scientific | P2173 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| ATPlite Luminescence Assay System, 1,000 Assay Kit |
Perkin Elmer | 6016941 | |
| 50 ml Conical Tubes | BD | 352098 | |
| 40 μm Nylon Filters | BD | 352340 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyl Biotech | 120-005-331 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 mm biopsy punch | Miltex | 33-36 | |
| 10 μm Pluristrainer | Pluriselect | 43-500-10-03 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415C | Marshall Scientific | EP-5415C | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotech | 130-093-235 | |
| 96-well plates, tissue culture treated | VWR | 82050-732 | |
| Rotomax 120 orbital shaker | Heidolph | 544-41200-00 | |
| Synergy H4 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader |
BioTek | ||
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | |
| Oxytherm System | Hansatech Instruments | ||
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
References
- van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
- Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
- Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
- Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
- Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
- Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
- Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
- Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
- McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
- Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
- Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
- Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
Tags
ביולוגיה תאית גיליון 91 ניתוחים ניתוח טכניקות חקירה מיטוכונדריה בידוד סינון homogenate ניתוק רקמה השתלהErratum
Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016.
Citeable Link.
A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.
