Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Snabb Isolering och rening av Mitokondrier För Transplantation Av vävnadsdissociering Och Differential Filtration

Published: September 6, 2014 doi: 10.3791/51682

ERRATUM NOTICE

Summary

En metod för snabb isolering av mitokondrier från däggdjurs vävnadsbiopsier beskrivs. Råtta lever eller skelettmuskelpreparat homogeniserades med en kommersiell vävnads dissociator och mitokondrier isolerades genom differentiell filtrering genom nylon mesh filter. Mitochondrial isoleringstiden är <30 minuter jämfört med 60 - 100 minuter med hjälp av alternativa metoder.

Abstract

Tidigare beskrivna mitokondriella isoleringsmetoder som använder differentiell centrifugering och / eller Ficoll gradientcentrifugering kräver 60-100 minuter att slutföra. Vi beskriver en metod för snabb isolering av mitokondrier från däggdjurs biopsier med en kommersiell vävnads dissociator och differential filtrering. I detta protokoll är manuell homogenisering ersätts med vävnaden dissociator standardiserade homogenisering cykel. Detta möjliggör enhetlig och konsekvent homogenisering av vävnad som inte är lätt att uppnå med manuell homogenisering. Efter vävnadsdissociering är homogenatet filtreras genom nylonnät filter som eliminerar repetitiva centrifugeringssteg. Som ett resultat kan mitokondrie isolering utföras på mindre än 30 min. Denna isolering protokoll ger ca 2 x 10 10 livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier från 0,18 ± 0,04 g (våtvikt) vävnadsprov.

Introduction

Mitokondrier finns i varje cell i kroppen utom röda blodkroppar och är involverade i ett stort antal viktiga cellulära och metaboliska processer 1-4. På grund av dessa många funktioner, kan mitokondriell skada ha skadliga effekter 3. För att undersöka mitokondriell funktion och dysfunktion flera mitokondriella isoleringsmetoder har beskrivits. De tidigaste publicerade räkenskaper mitokondriell isolering datum till 1940-talet 5-8. Den första dokumenterade försök visat mitokondriell isolering genom slipning levervävnad i en mortel, följt av centrifugering i en saltlösning vid låg hastighet 5,8. Senare, andra grupper kompletterats det ursprungliga förfarandet och visade vävnadsfraktione baserad på differentiell centrifugering 6-8. Dessa tidiga metoder legat till grund för aktuella tekniker som ofta innehåller homogenisering, och / eller differentialcentrifugering 9-15. Antalet homogenizatipå och centrifugeringssteg varierar bland protokoll. Dessa repetitiva steg öka tiden för mitokondriell isolering och slutligen minska lönsamheten. Dessutom kan manuell homogenisering orsaka mitokondriell skada och inkonsekventa resultat om den inte kontrolleras 10,16.

Nyligen använde vi homogenisering och differentialcentrifugering för att isolera mitokondrier för transplantation till hjärtmuskelvävnaden 17,18. Denna långa isoleringsförfarande krävs ca 90 min och den kliniska tillämpningen av denna metod var därför begränsad. För att möjliggöra akut terapeutisk användning i klinisk och kirurgisk behandling har vi utvecklat en snabb mitokondriell isoleringsförfarande som kan utföras på mindre än 30 minuter.

De stora fördelarna med detta protokoll är att standardiserad vävnadsdissociering möjliggör enhetlig och konsekvent homogenisering av vävnad som inte är lätt att uppnå med manuell homogenisering. I addition, användning av differentialfiltrering i stället för differentialcentrifuge eliminerar tidskrävande och repetitiva centrifugeringssteg som möjliggör snabbare isolering av renade, livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier.

Förmågan att isolera livskraftiga och andnings kompetenta mitokondrier på mindre än 30 minuter möjliggör klinisk tillämpbarhet. Denna isolering protokoll har potential att användas i koronar bypass-kirurgi kirurgi (CABG) och andra terapeutiska förfaranden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Framställning

  1. Bered en M K-HEPES-stamlösning (pH-justering till 7,2 med KOH).
  2. Förbered 0,5 M K-EGTA stamlösning (justera pH till 8,0 med KOH).
  3. Bered 1 M KH 2 PO 4 Stock Solution.
  4. Bered en M MgCl 2 förrådslösning.
  5. Förbered homogeniseringsbuffert (pH 7,2) 300 mM sackaros, 10 mM K-HEPES och 1 mM K-EGTA. Förvara vid 4 ° C.
  6. Förbered Respiration Buffert 250 mM sackaros, 2 mM KH 2 PO 4, 10 mM MgCl2, 20 mM K-HEPES-buffert (pH 7,2) och 0,5 mM K-EGTA (pH 8,0). Förvara vid 4 ° C.
  7. Förbered 10x PBS stamlösning genom upplösning av 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, och 2,4 g KH 2 PO 4 in 1 L dubbeldestillerat H2O (pH 7,4).
  8. Förbered 1x PBS genom att pipettera 100 ml 10x PBS i 1 L dubbelt destillerat H2O
  9. Förbered subtilisin A Lager genom att väga upp 4 mg subtilisin A itill ett 1,5 ml mikrofugrör. Förvara vid -20 ° C fram till användning.
  10. Förbered BSA lager genom att väga upp 20 mg av BSA i ett 1,5 ml mikrofugrör. Förvara vid -20 ° C fram till användning.

Mitokondriell Isolation (figur 1)

  1. Omedelbart före isolering, lös Subtilisin A i en ml homogeniseringsbuffert.
  2. Omedelbart före isolering, upplösa BSA i 1 ml homogeniseringsbuffert.
  3. Samla två färska vävnadsprover med hjälp av en 6 mm biopsiprov stans och butik i 1x PBS i en 50 ml koniskt centrifugrör på is.
  4. Överför de båda 6 mm stansar av vävnad till en dissociation C rör som innehåller 5 ml iskall homogeniseringsbuffert.
  5. Homogeni vävnaden genom att montera dissociation C röret på vävnaden dissociator och välj den förinställda mitokondriell isoleringscykel (60 sek homogenisering).
  6. Avlägsna dissociation C röret till en ishink.
  7. Lägg 250 l av subtilisin En stamlösning tillhomogenatet, blanda genom inversion och inkubera homogenatet på is under 10 min.
  8. Placera en 40 | am mesh-filter på en 50 ml koniskt centrifugrör på is och pre-våt filtret med homogeniseringsbuffert och filtrera homogenatet i 50 ml koniskt centrifugrör på is.
  9. Lägg 250 l av nygjord BSA stamlösning till filtratet och blanda genom inversion.
    Obs: Utelämna detta steg om mitokondriell proteinbestämning krävs.
  10. Placera en 40 pm filter på en 50 ml koniskt centrifugrör på is och pre-våt filtret med homogeniseringsbuffert och filtrera homogenatet i 50 ml koniskt centrifugrör på is.
  11. Placera en 10 pm filter på en 50 ml koniskt centrifugrör på is och pre-våt filtret med homogeniseringsbuffert och filtrera homogenatet i 50 ml koniskt centrifugrör på is.
  12. Överför filtratet till två för-kyld 1,5 ml mikrofugrör och centrifugera vid 9000 xg under 10 minuter vid4 ° C.
  13. Avlägsna supernatanten och slamma och kombinera pellets i 1 ml iskall Respiration buffert.

ATP-analys

OBS: För att bestämma den metaboliska aktiviteten hos isolerade mitokondrier en ATP luminiscens-analys kan utföras med hjälp av en ATP-analys-kit. Protokollet, reagenser och standarder levererades i analyssatsen. En sammanfattning av det förfarande som beskrivs nedan.

  1. Jämvikta kitreagenser till RT.
  2. Förbered 10 mM ATP stamlösning genom att lösa lyofiliserad ATP pelleten i 1170 | il dubbeldestillerat vatten. Förvara ATP standard stamlösning och förberedda mitokondriella prover på is.
  3. Tillsätt 5 ml substratbuffert-lösning till en flaska med lyofiliserad substratlösning. Blanda försiktigt och placera i mörkret.
  4. Lägg 100 pl av respiration buffert till alla brunnar i en svart, opakt botten, 96 brunnar.
  5. Tillsätt 10 l av mitokondrier från de preparerade proverna till varje brunn ofa svart, ogenomskinlig botten, 96 brunnar. Observera: Prover klädd i tre exemplar. Inkludera en rad för standarder och tre brunnar för den negativa kontrollen (Respiration Buffer).
  6. Tillsätt 50 l av däggdjursceller lys lösning på alla brunnar, inklusive standarder och kontroller.
  7. Inkubera plattan vid 37 ° C under 5 min på en orbital skakapparat vid 125 rpm.
  8. Under inkubationen förbereda ATP standarder koncentrationer av 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM, 0,005 mM, 0,001 mM, och 0,0001 mM ATP från 10 mM ATP stamlösning. Lagra standarder på is.
  9. Efter inkubationen till 10 pl ATP standarder till motsvarande brunnar som anges på skylten kartan. Not: Standarder utförs i duplikat.
  10. Tillsätt 50 l av den beredda substratlösning till varje brunn.
  11. Inkubera plattan vid 37 ° C på orbitalskak under 5 minuter vid 125 rpm.
  12. Öppna Gen5 1.11 programvaran på en dator kopplad med spektrofotometer.
  13. Under "Skapa ett nytt objekt ", klicka på" Experiment ".
  14. Klicka på "Default Protocol". Klicka på "OK".
  15. I den vänstra kolumnen, välj "protokollet", sedan "Tillvägagångssätt".
  16. Välj "Delay". Ställ in på 0:10:00. Klicka på "OK".
  17. Välj "Läs". Välj "Luminescens" från rullgardinsmenyn. Justera andra inställningar på följande: Läs typ Endpoint, Integration Tid 0: 01.00 MM: ss.ss, Filter Använder 1, Emission Hole, Optik Position Top, Känslighet 100, Top Probe Vertical Offset 1.00 mm.
  18. När plattan är klar att analyseras, klicka på "Läs Plate" ikonen på den översta raden. Klicka på "Läs". När spektrofotometer öppnas, placera plattan i facket med väl A1 i det övre vänstra hörnet. En låda med temperaturen kommer att öppnas. Klicka på "Läs". Obs: Högre värden korrelerar med ökade ATP-nivåer och högre metabolisk aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En siffra som beskriver de processuella åtgärder i isolering av mitokondrier använder vävnadsdissociering och differentialfiltrering visas i figur 1. Total processtiden är mindre än 30 min.

Vävnadsprover erhölls genom att använda en 6 mm biopsistans. Tissue vikten var 0,18 ± 0,04 g (våt vikt). Antalet mitokondrier isolerade bestämt med partikelstorleksräkning var 2,4 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitokondrier för skelettmuskel och 2,75 x 10 10 ± 0,1 x 10 10 mitokondrier för preparat lever (Figur 2A). För att möjliggöra jämförelse mitokondrie antal bestämdes också genom hemocytometer. Mitochondrial antal underskattades bestämt med hemocytometer som 0,11 x 10 10 ± 0,04 x 10 10 mitokondrier för skelettmuskel och 0,34 x 10 10 ± 0,09 x 10 10 mitokondrier för tillredningar lever (FIGUR 2A). Mitokondriell diameter som bestäms av storleken baserad partikelräknare är visad i figur 2B. Företrädaren spårning visar de isolerade mitokondrier är lokaliserade i en topp med en genomsnittlig diameter på 0,38 ± 0,17 um överens med tidigare rapporter 7.

Mitokondriell protein / g (våt vikt) utgångsvävnad enligt bestämning med bicinkoninsyra (BCA)-analys var 4,8 ± 2,9 mg / g (våt vikt) och 7,3 ± 3,5 mg / g (våt vikt) för skelettmuskulatur och leverprover respektive (Figur 2C).

Mitokondriell renhet bestämdes genom transmissionselektronmikroskopi och visas i figur 2D. Mitokondrier visas vara elektrontätt med mindre än 0,01% är brottskadat eller skadas. Förorening av icke-mitokondrie partiklarna är mindre än 0,001%.

Mitochondrial livskraft bestämdes genom MitoTracker Röd som tidigare frånritsade 17,18. Våra resultat visar att de isolerade mitokondrier upprätthålla membranpotential (figurerna 3A - C).

ATP bestämdes med användning av ett luminiscerande analys-kit. En platta kartan för ATP-analys visas i Figur 4. ATP standarder ströks ut i duplikat. Mitokondriella prover och negativa kontroller ströks tredubbelt. ATP-halten var 10,67 ± 4,38 nmol / mg mitokondriellt protein och 14.83 ± 4.36 nmol / mg mitokondriellt protein för skelettmuskulaturen och leverprover respektive (Figur 3D).

Mitochondrial respiration bedömdes med hjälp av en Clark elektrod som tidigare beskrivits 17,18. Mitochondrial syreförbrukning hastigheten var 178 ± 17 nM O 2 / min / mg mitokondriellt protein för skelettmuskulaturen och 176 ± 23 nM O 2 / min / mg mitokondriellt protein för preparat lever. Andningskontrollindex (RCI) värden var 2,45 ± 0,34 end 2,67 ± 0,17 för skelettmuskel och lever provpreparat respektive (Figur 3E). Dessa resultat liknar de som rapporterats i våra tidigare studier med manuella homogenisering och differentialcentrifugering för att isolera mitokondrier 17-18.

Figur 1
Figur 1 Schema för isolering av mitokondrier använder vävnadsdissociering och differentialfiltrering. (A) Överföring två 6 mm biopsi prov stansar till 5 ml homogeniseringsbuffert i en dissociation C rör och homogenisera proverna med hjälp av vävnads dissociator s 1 min homogenisering program. (B) Lägg till 250 l subtil En stamlösning till homogenatet i dissociation C röret och inkubera på is under 10 min. (C) Filtrera homogenatet genom en pre -wetted 40 um mesh filter i en 50 ml koniskt centrifugrör på is och tillsätt sedan 250 | il BSA-stamlösning till filtratet. (D) Åter filtrering filtratet genom ett nytt för-vätta 40 um mesh filter i en 50 ml konisk centrifug på is. (E) Åter filter filtratet genom en ny pre-fuktade 10 um mesh filter i en 50 ml koniskt centrifugrör på is. (F) Ta filtratet till 1,5 ml mikrofugrör och centrifugera vid 9000 xg under 10 minuter vid 4 ° C. (G) Avlägsna supernatanten och slamma och kombinera de mitokondriella pellets i 1 ml Respiration buffert. Total förfarande är mindre än 30 minuter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

d / 51682 / 51682fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2 Mitokondriell utbyte och renhet. (A) hemocytometer och partikelstorleksräknare mitokondrier nummer isolerad från 0,18 ± 0,04 g vävnad (våt vikt) för skelettmuskel och lever. (B) Mitochondrial storlek (mg / g) fördelning som detekteras av partikelstorleksräknare. (C) Mitochondrial protein mg / g vävnad våt vikt för skelettmuskel och lever. (D) Transmissionselektronmikroskopi bild av isolerade mitokondrier. Skala bar är 100 nm. Pilar indikerar eventuell förorening med icke mitokondrie partiklar och skadade mitokondrier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 < br /> Figur 3 Mitochondrial livskraft. Representativa mikrofotografier av isolerade mitokondrier (A) under faskontrast belysning och (B och C) enligt fluorescens, med mitokondrier märkta med MitoTracker Red CMXRos. Skala barer är 25 nm (A, B) och 5 pm (C). Dessa bilder visar att mitokondrier underhålls membranpotential.   Pilar indikerar mitokondrier saknar membranpotential eller skräp (D) ATP innehåll nmol / mg mitokondriellt protein bestämt med ATP-analys och (E) RCI (tillstånd 3 / stat 4) bestämt med Clark-elektrod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

belastning / 51682 / 51682fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
. Figur 4 Plate karta för ATP-analys Denna platta karta visar hur du ställer in standard (A1 - A12), mitokondrier prover (B1 - C6), och negativa kontroller (C7 - C9) för ATP-analysen. Under analysen, 100 | il av respiration Buffer, är 50 | il av däggdjurscell-lys-lösning och 50 ul av rekonstituerad substratlösning till alla brunnar (A1 - C9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att lyckas isolera mitokondrier som använder detta protokoll är det viktigt att hålla alla lösningar och vävnadsprov på is för att bevara mitokondrie livskraft. Även när underhålls på is, kommer isolerade mitokondrier uppvisar en minskning av funktionell aktivitet över tiden 19. Vi rekommenderar att alla lösningar och tillägg i förväg förberedda. Vi reser väga och lagra subtilisin A i 4 mg alikvoter i 1,5 ml mikrofugrör och förvara dem vid -20 ° C. Likaså BSA förvägt och lagrades i 20 mg alikvoter i 1,5 ml mikrofugrör som kan lagras vid -20 ° C. Precis före användning rören avlägsnas från -20 ° C och Subtilisin A och BSA löses i 1 ml homogeniseringsbuffert för användning i den mitokondriella isoleringsförfarandet.

Två biopsi stämplingar från skelettmuskulaturen vävnad erhållen med en 6 mm biopsistans ge tillräckliga mitokondrier för användning i kliniska och kirurgiska ingrepp för terapeutiska insatser 17-18. För att uppskatta antalet mitokondrier vi använt två metoder, hemocytometer och partikelstorleksräkning. Användningen av partikelstorleksräkning rekommenderas. Partikelstorleken räknare använder elektrisk impedans för att mäta volymen av partiklar som passerar genom en öppning i en definierad storlek. Partikelstorleken räknaren är dyrt men ger exakta och tillförlitliga uppskattningar och är användarvänlig oberoende. Mitochondrial antal uppskattas av hemocytometry är mer ekonomiskt. Våra studier har visat att denna metod ger variabla skattningar som är cirka en storleksordning mindre än den som erhölls med användning av en partikelstorleksräknare. Vi har också noterat att räknas som erhållits genom hemocytometer är starkt beroende av användaren. Vi föreslår att för att säkerställa konsekventa bedömningar alla punkter med hjälp av en hemocytometer bör utföras av en person.

Vi har funnit ATP analyssatser för att vara användbara för bestämning av mitokondriefunktion. Satsen levererar all nödvändig reagents och ger en enkel och snabb metod för att bestämma den metaboliska aktiviteten hos isolerade mitokondrier. ATP-analysen ger liknande resultat som de som erhållits med hjälp av en Clark-elektrod och är därför kompatibel med tidigare dataanalys 20-21.

En stor fördel med vår mitokondrie isoleringsprotokoll är att den möjliggör isolering av ett högt utbyte av livskraftiga, andnings behöriga mitokondrier fria från föroreningar på mindre än 30 minuter. Differential filtrering i stället för differentialcentrifuge reducerar undersökningstider avsevärt. Andra protokoll införliva flera centrifugeringssteg med total isolering tills vidare 60 minuter till 100 minuter 13-17. En annan fördel med detta protokoll är att vävnads homogenisering är standardiserad. Den kommersiella vävnads dissociator ger en standardiserad cykel och ger konsekventa och reproducerbara resultat. Detta är i motsats till manuell homogenisering som är föremål för användar variabilitet ochinkonsekvens. Vår metod för snabb isolering av mitokondrier använder vävnadsdissociering och differentialfiltrering ger en isolerings tidsram kompatibel för klinisk och kirurgisk terapeutisk intervention 17,18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Samtliga djur behandlades i enlighet med gällande institutionella riktlinjer. Vi har inga konkurrerande ekonomiska intressen att lämna ut.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL 103.542 och BCH Anesthesia Research Foundations Distinguished Trailblazer Award till den gemensamma jordbrukspolitiken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Sigma Aldrich 84100
HEPES Sigma Aldrich H4034
EGTA Sigma Aldrich E4378
Substilsin A Sigma Aldrich P5380
BSA Sigma Aldrich A7906
KH2PO4 Sigma Aldrich P5379
MgCl2 Sigma Aldrich M8266
NaCl Sigma Aldrich S6191
KCl Fisher Scientific P2173
Na2HPO4 Fisher Scientific S374
ATPlite Luminescence Assay System,
1,000 Assay Kit
Perkin Elmer 6016941
50 ml Conical Tubes BD 352098
40 μm Nylon Filters BD  352340
GentleMACS C tube Miltenyl Biotech 120-005-331
1.5 ml Eppendorf tube Fisher Scientific 05-408-129
6 mm biopsy punch Miltex 33-36
10 μm Pluristrainer Pluriselect 43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C Marshall Scientific EP-5415C 
GentleMACS Dissociator  Miltenyl Biotech 130-093-235
96-well plates, tissue culture treated VWR 82050-732
Rotomax 120 orbital shaker Heidolph 544-41200-00
Synergy H4 Hybrid Multi-Mode
 Microplate Reader
BioTek
Multisizer 4 Coulter Counter Beckman Coulter A63076
Oxytherm System Hansatech Instruments
Hemacytometer Fisher Scientific 267110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S. J., Vandenabeele, P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9 (10), 1031-1042 (2002).
  2. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology (Bethesda). 23, 84-94 (2008).
  3. Chan, D. C. Mitochondria: Dynamic Organelles in Disease, Aging, and Development. Cell. 125 (7), 1241-1252 (2006).
  4. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard Isolation methods. PLoS ONE. 6 (3), e18317 (2011).
  5. Bensley, R. R., Hoerr, N. Studies on cell structure by freeze-drying method; preparation and properties of mitochondria. Anat Rec. 60, 449-455 (1934).
  6. Claude, A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation II. Experimental procedures and results. J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).
  7. Hogeboom, H., Schneider, W. C., Palade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).
  8. Ernster, L., Schtaz, G. Mitochondria: a historical Review. J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).
  9. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  10. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Anal Biochem. 443 (1), 66-74 (2013).
  11. Fernández-Vizarra, E., Ferrín, G., Pérez-Martos, A., Fernández-Silva, P., Zeviani, M., Enríquez, J. A. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
  12. Graham, J. M. Chapter 3, Unit 3.3, Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , (2001).
  13. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Gostimskaya, I., Galkin, A. Preparation of highly coupled rat heart mitochondria. J Vis Exp. (43), (2010).
  16. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal Biochem. 418 (2), 213-223 (2011).
  17. Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 304 (7), (2013).
  18. McCully, J. D., et al. Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection. American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).
  19. Olson, M. S., Von Korff, R. W. Changes in endogenous substrates of isolated rabbit heart mitochondria during storage. J Biol Chem. 242 (2), 325-332 (1967).
  20. Diepart, C., et al. Comparison of methods for measuring oxygen consumption in tumor cells in vitro. Anal Biochem. 396 (2), 250-256 (2010).
  21. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

Tags

Cellular Biology kirurgiska ingrepp operativ utredningsteknik mitokondrier isolering filtrering homogenatet vävnadsdissociering transplantation

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration
Posted by JoVE Editors on 01/05/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. An optional step was added to step 7 of the 'Mitochondrial Isolation' section of the protocol. The step is:

1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

Snabb Isolering och rening av Mitokondrier För Transplantation Av vävnadsdissociering Och Differential Filtration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo,More

Preble, J. M., Pacak, C. A., Kondo, H., MacKay, A. A., Cowan, D. B., McCully, J. D. Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration. J. Vis. Exp. (91), e51682, doi:10.3791/51682 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter