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वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Published: September 4, 2014 doi: 10.3791/51683
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Life Science and Facility for Imaging by Light Microscopy, Imperial College London, 2Department of Life Sciences, Imperial College London

Summary

hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) और अस्थि मज्जा आलों के बीच बातचीत की प्रकृति खराब समझा जाता है. कस्टम हार्डवेयर संशोधनों और एक बहु कदम अधिग्रहण प्रोटोकॉल पूर्व vivo छवि अस्थि मज्जा क्षेत्रों में असर पड़ा लेबल HSPCs, ट्रैकिंग बातचीत और आंदोलन करने के लिए दो photon और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने की अनुमति.

Abstract

निष्क्रियता और प्रसार, आत्म नवीकरण और भेदभाव संतान के उत्पादन के बीच एक नाजुक संतुलन के माध्यम से, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (HSCs) सभी परिपक्व रक्त कोशिका प्रजातियों के कारोबार को बनाए रखने. विशिष्ट एचएससी भाग्य के लिए अग्रणी जटिल संकेतों के समन्वय HSCs और अभी भी खराब समझा जाता है जो जटिल अस्थि मज्जा microenvironment, [1-2] के बीच बातचीत पर निर्भर करता है.

हम बहु कदम confocal और vivo इमेजिंग तकनीक में दो फोटॉन साथ स्थिर जानवर स्थिति के लिए एक नव विकसित नमूना धारक के संयोजन से, यह उच्च संकल्प 3 डी HSPCs युक्त ढेर और उनके आसपास के आलों प्राप्त करने के लिए और समय के साथ उन पर नजर रखने के लिए संभव है वर्णन कैसे बहु बिंदु समय चूक इमेजिंग के माध्यम से. उच्च परिभाषा इमेजिंग का पता लगाने के पूर्व vivo लेबल hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) अस्थि मज्जा के भीतर रहने की अनुमति देता है. इसके अलावा, बहु बिंदु समय चूक 3 डी इमेजिंग, ओतेजी से अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ btained, HSPC आंदोलन और HSPCs और स्ट्रोमा कोशिकाओं के बीच पारस्परिक संबंधों के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करता है.

GFP सकारात्मक osteoblastic कोशिकाओं के संबंध में HSPCs की ट्रैकिंग इस पद्धति का एक अनुकरणीय आवेदन के रूप में दिखाया गया है. इस तकनीक माउस calvarium अस्थि मज्जा अंतरिक्ष के भीतर ब्याज की किसी भी उचित लेबल hematopoietic या stromal सेल ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

Introduction

स्टेम सेल आलों ऐसे घ्राण बल्ब, मांसपेशी फाइबर, बाल कूप उभार या सीएनएस subventricular क्षेत्र 4-7 के रूप में दशकों 3 के लिए मान्यता प्राप्त है और अच्छी तरह से कई ऊतकों में विशेषता गया होने के बावजूद, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (HSCs) और अस्थि मज्जा microenvironment के बीच बातचीत ( बी एम) अभी भी खराब होने के कारण सीधे हड्डी के माध्यम से एकल कक्षों के साथ ही ऊतक के ही अत्यंत तरल पदार्थ प्रकृति के अवलोकन की कठिनाई को समझ रहे हैं. यह विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और विनियामक संकेतों की एक जटिल नेटवर्क निष्क्रियता के बीच नाजुक संतुलन को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार है कि, ablating या HSCs या microenvironment खुद की stromal कोशिकाओं या तो में विशिष्ट जीन overexpressing पर आधारित कार्यात्मक अध्ययन का एक नंबर के माध्यम से दिखाया गया है , प्रसार, विस्तार और HSCs 1-2 से भेदभाव. HSCs और उनके आलों बीच crosstalk केवल प्रत्यक्ष अवलोकन के माध्यम से गहराई में समझा जा सकता है. इस ACH हैन केवल माइक्रोस्कोपी के संदर्भ में उपलब्ध प्रौद्योगिकी के संयोजन उन्नत इमेजिंग प्रोटोकॉल के विकास के लिए ievable धन्यवाद, लेकिन यह भी नमूना धारक समाधान की और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर की.

माउस calvaria हड्डियों के बीएम डिब्बे में प्रत्यारोपित hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) की एकल कोशिका संकल्प रहते इमेजिंग engrafting HSPCs अधिक अपरिपक्व कोशिकाओं एसडीएफ -1 और Vcam -1 पॉजिटिव जहाजों 8-9 की निकटता में और उस के स्थानीयकरण से पता चला कि उनकी संतान 10 अधिक बाहर हैं, जबकि GFP पॉजिटिव osteoblastic कोशिकाओं (अस्थिकोरक प्रतिबंधित कोलेजन 1α प्रमोटर GFP अभिव्यक्ति ड्राइव जिसमें Col2.3-GFP ट्रांसजेनिक माउस लाइन,) से 20 माइक्रोन - 15 के भीतर पाए जाते हैं. इसी प्रकार टिप्पणियों विच्छेदित और खंडित फीमर हड्डियों 11 से और पतला tibeal हड्डियों 12 से प्राप्त किया गया. Calvarial अस्थि मज्जा की इमेजिंग वें भीतर HSPCs के प्रत्यक्ष दृश्य प्राप्त करने के लिए कम से कम इनवेसिव दृष्टिकोण रहता हैEIR देशी microenvironment.

किसी भी जीवित नमूना इमेजिंग के साथ होने के कारण नमूना आंदोलन को किसी भी अनावश्यक कलाकृतियों से बचने के लिए संभव के रूप में अभी भी नमूना रखने के लिए एक अंतर्निहित जरूरत नहीं है. श्वास calvarial अस्थि मज्जा इमेजिंग जब से परहेज करने की आवश्यकता है जो माउस सिर की oscillatory आंदोलनों का कारण बनता है. वे ललाट हड्डियों में बाधा डालती है क्योंकि मस्तिष्क इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया परम्परागत स्टीरियोटैक्टिक धारकों, calvarium इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं हैं. लाइव इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पढ़ाई 13 के दौरान संकट को कम करने के लिए इस्तेमाल एक माउस धारक से शुरू, एक 2 घटक धारक एक साथ स्थिर पकड़ सुनिश्चित करने के लिए एक बड़ा हाथ से जुड़ा एक इमेजिंग खिड़की बनाने के लिए माउस के सिर के लिए तय एक छोटा सा टुकड़ा के साथ विकसित किया गया था खुर्दबीन मंच में मजबूती से सुरक्षित करता है, जो भारी बेस प्लेट. अभी भी जगह में सिर immobilizing और पर्याप्त रूप से मीटर को नष्ट करते हुए माउस की खोपड़ी के लिए सिर टुकड़ा सुरक्षित मुक्त सांस लेने की अनुमति देता हैसाँस लेने के कारण ovements. धारक शरीर को सिर टुकड़ा जोड़ने ए 'ताला और चाबी' तंत्र खिड़की के आकार इसलिए सर्जरी सरल बनाने, स्थिति की वृद्धि की सटीकता के साथ ही कम से कम करने की अनुमति देता है, और चरण में बेस प्लेट के फिट माइक्रोस्कोप पर सटीक संरेखण के लिए अनुमति देता है. सही रूप में गतिशील कोशिकाओं की निगरानी करने के लिए, एक बहु बिंदु समय व्यतीत प्रोटोकॉल समय बिंदुओं के बीच 5 मिनट के अंतराल के साथ समय के साथ कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति के लिए डिजाइन किया गया था. इधर, लेबल किया HSCs col2.3GFP osteoblasitc संवाददाता चूहों 10,14 में इंजेक्शन और लगभग 20 घंटे बाद imaged हैं. डिजाइन किया गया था और कई घंटे की अवधि में एक ही क्षेत्रों का तेजी से बहु बिंदु समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक इमेजिंग सेटिंग्स विस्तार से वर्णन किया गया हैं कि माउस धारक.

Protocol

जानवरों के उपयोग से जुड़े सभी प्रक्रियाओं स्थानीय कानून के अनुसार किया जाता है. हमारा काम ब्रिटेन के गृह मंत्रालय के साथ ही इंपीरियल कॉलेज नैतिक समीक्षा पैनल द्वारा मंजूरी दे दी है. अनुमति दी प्रक्रियाओं परियोजना लाइसेंस दस्तावेज में वर्णित है और हर समय पशुओं के कल्याण सुनिश्चित है कि दिशा निर्देशों का पालन कर रहे हैं. काम किया जाता है, जहां देश के पशु प्रयोगों पर कानून का पालन करना सुनिश्चित करें.

1 लेबल और HSPCs इंजेक्शन:

  1. लो सेलसो 14-15 द्वारा वर्णित के रूप में हार्वेस्ट कोशिकाओं.
  2. पीबीएस में 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में कोशिकाओं को तैयार है. नोट: कोशिकाओं की गिनती करने के लिए एक hemocytometer या सेल सॉर्टर द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी का उपयोग करें; लेबल और इंजेक्शन जा कोशिकाओं की संख्या (- 20,000 HSCs, 100,000 - उदाहरण के लिए 10,000 दाग 300,000 HPCs) सेल के प्रकार पर निर्भर करता है; कम से कम 10 5 कोशिकाओं, पीबीएस के 100 μl में resuspend के साथ काम अगर; सीरम धुंधला रोकता है, क्योंकि यह किसी भी सीरम बिना पीबीएस में कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में सेल निलंबन के लिए किया था और समाधान के बाहर वेग और कोशिकाओं लेबल असफल नहीं डाई सुनिश्चित करने के लिए तुरंत निलंबन भंवर जोड़ें.
  4. , 5 मिनट के लिए 500 XG पर कताई तरल decanting और चतुर्थ इंजेक्शन (- 150 μl ~ 100) के लिए एक उचित मात्रा में गोली resuspending द्वारा धो तो 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते
  5. पीबीएस के 200 μl में कोशिकाओं Resuspend और एक इंसुलिन सिरिंज में इकट्ठा. नोट: यह माउस को पूरे सेल निलंबन प्रशासन की अनुमति देता है इसलिए कोई सुई मृत स्थान है और क्योंकि एक इंसुलिन सिरिंज एक पारंपरिक सिरिंज से अधिक की सिफारिश की है.
  6. पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से एक घातक विकिरणित माउस में कोशिकाओं इंजेक्षन. नोट: तिवारी के साथ विकसित जो अस्थि मज्जा microenvironment (hematopoietic और stromal घटकों दोनों), पर किरणन जाना जाता है, काफी प्रभावमुझे. यह लगातार विकिरण के लिए समय, सेल इंजेक्शन (सबसे अच्छा engraftment के लिए विकिरण से 4 के लिए 24 घंटे) और इमेजिंग बनाए रखने के लिए इसलिए बहुत महत्वपूर्ण है. यहाँ विकिरण इंजेक्शन से पहले 6 घंटा प्रदर्शन किया है और इमेजिंग इंजेक्शन के बाद 20 घंटे का प्रदर्शन किया है.
    1. पूंछ नस vasodilated प्रकट होने तक एक गर्म चैम्बर (37 डिग्री सेल्सियस) में माउस रखें.
    2. Restrainer में माउस ले जाएँ और ध्यान से पूंछ नस में सुई स्लाइड.
    3. नस में कोशिकाओं इंजेक्षन - इंजेक्शन के लिए कोई प्रतिरोध का सामना करना पड़ा जाना चाहिए.
    4. कोशिकाएं अस्थि मज्जा रिक्त स्थान की ओर पलायन करने के लिए अनुमति देने के लिए माउस हे / एन छोड़ दें.

2 इमेजिंग के लिए माउस की तैयारी

  1. ठीक संदंश की एक जोड़ी और एक ठीक कैंची की जोड़ी के साथ ही एक बाँझ वातावरण में एक का उपयोग करने से पहले बुद्धि और दुकान आटोक्लेव.
  2. संभव के रूप में नए रूप संवेदनाहारी अप (0.38 मिलीलीटर Ketamine + 0.25 मिलीग्राम Medetomidine + 4.47 मिली लीटर पानी). नोट: OTisoflurane और अन्य इंजेक्शन सहित उसे अनुमोदित एनेस्थेटिक्स,, बहुत प्रभावी हो जाएगा. 1 घंटे के लिए हर 45 मिनट प्रशासित 50 μl - वर्णित कॉकटेल 30 के ऊपर अप के साथ, शरीर के वजन के 10 ग्राम प्रति 0.1 मिलीग्राम पर intraperitoneally प्रशासित किया जा रहा है.
  3. यदि जरूरी हुआ तो फिर संकेत मिलने चरण औजार, माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर शुरू दो photon लेजर पर स्विच करें. पराबैंगनीकिरण पर स्विच और उन्हें गर्म और इमेजिंग के लिए माउस की तैयारी समय स्थिर करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. Intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से चुना संवेदनाहारी के लिए तैयार संवेदनाहारी मिश्रण (2.2 कदम) का उपयोग माउस anesthetize. अब और प्रोटोकॉल भर में नियमित अंतराल पर पेडल पलटा माध्यम गहरी संज्ञाहरण की शुरुआत की निगरानी. नोट: माउस प्रक्रिया के दौरान सावधानी से नजर रखी और संज्ञाहरण चमकती प्रतीत होता है किया जाना चाहिए - (2.2 में विस्तृत रूप में) (आमतौर के बाद 45 से 60 मिनट) तो एक टॉप अप खुराक प्रशासन. अलग अलग उम्र और लिंग के चूहों के बीच कुछ बदलाव की उम्मीद है. यह महत्वपूर्ण हैपर्याप्त सावधानी सुनिश्चित करने के लिए अपने स्थानीय पशु चिकित्सा अधिकारी के साथ संज्ञाहरण प्रोटोकॉल पर चर्चा करने के लिए उग्रवादी माउस का कल्याण सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है.
  5. माउस की आँखों में किसी भी इथेनॉल पाने के लिए नहीं, यह सुनिश्चित करने के लिए एक ऊतक पर 70% इथेनॉल के साथ खोपड़ी के शीर्ष झाड़ू.
  6. बाँझ संदंश और कैंची का प्रयोग, ध्यान से imaged किया जा calvarium क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी के केंद्रीय हिस्से को हटा दें: संदंश के साथ त्वचा ऊपर उठाने से कान के बीच सिर के पीछे एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. त्वचा को धारण करते हैं, त्वचा के नीचे कैंची स्लाइड और धीरे वांछित इमेजिंग क्षेत्र के बाहर के साथ काटा.
  7. नम रखने के लिए यह बाँझ पीबीएस के साथ सिक्त बाँझ कपास कली के साथ संपर्क में हड्डी साफ कर लें.
  8. इमेजिंग के लिए तैयार माउस की खोपड़ी के लिए धातु सिर टुकड़ा देते.
    1. यह एक पेस्ट बन जाता है जब तक एक का वजन नाव में दंत सीमेंट की एक पर्याप्त राशि मिक्स और जल्दी एस को जोड़ना होगा कि बुद्धि के नीचे की सतह पर लागूKull.
    2. सीमेंट सेट करने से पहले, फिर, यकीन इमेजिंग क्षेत्र पर किसी भी दंत सीमेंट पाने के लिए नहीं कर रही है, माउस की खोपड़ी पर बुद्धि जगह इसे स्थापित करने के लिए के लिए प्रतीक्षा करें.
    3. खोपड़ी नम रहती है जो intrasite hydrogel के एक छोटी राशि लागू करें.
  9. धारक को बुद्धि देते हैं और खांचे धारक notches के भीतर फिट सुनिश्चित करना है कि, पेंच का उपयोग जगह में सुरक्षित.
  10. माइक्रोस्कोप के लिए स्थानांतरित करने से पहले बाँझ पीबीएस के साथ बाँझ कपास की कलियों के साथ खोपड़ी और स्वच्छ से हाइड्रोजेल निकालें.
  11. खुर्दबीन मंच में धारक डालें माउस के तहत हीटिंग चटाई की स्थिति, गुदा थर्मामीटर जांच डालने और चिपकने वाला टेप के साथ मंच पर जगह में सब कुछ सुरक्षित है.
  12. वे संवेदनाहारी के तहत जबकि बाहर सूखी नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए माउस की आँखों पर नेत्र मरहम की एक छोटी सी बूंद रखें. नोट: संज्ञाहरण के तहत जबकि माउस इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान किसी भी समय पर पहुंच से बाहर नहीं छोड़ा जाना चाहिए.

vivo इमेजिंग: उच्च संकल्प के ढेर और समय चूक अधिग्रहण

  1. आंख टुकड़ों के माध्यम से खोपड़ी पर ध्यान दें.
    1. , शुद्ध, बाँझ पानी और एक पानी की सूई लेंस का उपयोग कर के साथ इमेजिंग खिड़की भरें यह छोटी बूंद पानी छू इतना है कि यह कम है.
    2. प्रकाश स्रोत के रूप में एक बाहरी दीपक का उपयोग, खुर्दबीन eyepieces का उपयोग खोपड़ी के शीर्ष पर ध्यान दें.
    3. केंद्रीय सीवन पर इमेजिंग क्षेत्र की स्थिति और एक शुरू करने की स्थिति के रूप में राज्याभिषेक सिवनी खोजने के लिए सिर के पीछे की ओर ले जाएँ.
  2. उत्तेजना और उत्सर्जन तालिका में निर्दिष्ट प्रासंगिक fluorophores के प्रभावी उत्तेजना और पता लगाने की अनुमति के लिए माइक्रोस्कोप की स्थापना की. नोट: एक पारंपरिक गैल्वेनोमीटर स्कैन सिर लास वायुसेना सॉफ्टवेयर मंच चलाने के साथ एक Leica SP5 ईमानदार confocal यहाँ प्रयोग किया जाता है, जबकि प्रक्रिया आसानी से अन्य माइक्रोस्कोप / सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों में दोहराया जा सकता है. यहां इस्तेमाल किया लेंस Leica HCX IRAPO एल 25x डब्ल्यू / 0.95 एनए ख हैअन्य निर्माताओं के केन्द्र शासित प्रदेशों के समकक्ष लेंस उपयुक्त बढ़ाई और उच्च एनए के साथ उपलब्ध हैं
    1. 512 x 512 पिक्सल के लिए दोनों XY छवियों के साथ ही 400 हर्ट्ज के लिए एक 3 डी जेड ढेर और सेट इमेजिंग गति और संकल्प पर कब्जा करने के लिए एक मोड में सॉफ्टवेयर रखें. नोट: सेटअप और हार्डवेयर यहां 620 माइक्रोन से देखने के एक क्षेत्र में परिणाम और यह अन्य प्लेटफार्मों पर भिन्न हो सकती है.
    2. कई चैनलों / पटरियों के साथ ही संग्रह विधि बहुत कम से कम ढेर यदि संभव हो तो या फ्रेम के बीच के बीच सेटिंग बदलने की तैयारी कर रहा है यह सुनिश्चित करना कि कब्जा करने में सक्षम हैं, इसलिए है कि सॉफ्टवेयर सेट करें. प्रत्येक ढेर के अधिग्रहण के अंत में लेजर रोशनी बंद, 3 स्वतंत्र कब्जा सेटिंग्स सेट करें. नोट: तीन चैनलों चैनलों के बीच crosstalk को कम करने के लिए इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक हो जाएगा.
    3. सेटअप दो फोटोन एसएचजी हड्डी संकेत (840 एनएम उत्तेजना, 400-440 एनएम उत्सर्जन) के लिए पहली अनुक्रमिक स्कैन के लिए सेटिंग्स; सांसद लेजर के लिए शटर खुला और एम सुनिश्चित25% और लेजर पर बंद है - पी लाभ और ऑफसेट सेटअप सही ढंग से कर रहे हैं, लेजर शक्ति 12.5 है. केवल डिटेक्टर के रूप में एक उपयुक्त पीएमटी का चयन करें और सफेद रंग बदल जाते हैं. नोट: उपलब्ध एक उज्जवल, गहरे संकेत प्राप्त करने के लिए जब उपयुक्त फिल्टर के साथ NDD डिटेक्टरों हड्डी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    4. दोहराएँ चैनल स्थापना एक संयुक्त autofluorescence के लिए GFP चैनल के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया (543 एनएम उत्तेजना, 560 - 600nm उत्सर्जन) और किया (633 एनएम उत्तेजना, 650-720 एनएम उत्सर्जन) दूसरे सेटिंग के तहत दो उपयुक्त PMTs उपयोग, स्कैन. Autofluorescence के लिए हरे और था के लिए लाल चैनल रंग बदलें. नोट: ऑटो प्रतिदीप्ति चैनल दो चैनलों overlayed कर रहे हैं जब था सकारात्मक कोशिकाओं की आसान पता लगाने की अनुमति देता है के रूप में हरी उपयोग कर - autofluorescent कोशिकाओं के कारण दोनों चैनलों के समय में किया जा रहा है के रूप में पीला / नारंगी प्रकट किया कोशिकाओं केवल वे ही में दिखाई देते हैं क्योंकि लाल के रूप में प्रकट चैनल था. ऑटो प्रतिदीप्ति चैनलप्रदर्शन प्रयोजनों GFP चैनल के साथ भ्रम से बचने के लिए उपयोगकर्ता, यह एक अलग रंग बदला जा सकता करना चाहती है, लेकिन यदि केवल इस तुलना के लिए प्रयोग किया जाता है और कोई अंतिम विश्लेषण में उपयोग नहीं किया है.
    5. अंत में, सेटअप GFP के लिए तीसरे और अंतिम स्कैन (488 एनएम उत्तेजना, 500-530 एनएम उत्सर्जन); आवश्यक और फिर लगभग 15% करने के लिए 488 एनएम लेजर लाइन की लेजर सत्ता स्थापित या लेजर के लिए एक उचित स्तर केवल सक्रिय डिटेक्टर के रूप में एक उपयुक्त पीएमटी का चयन करें और हरे रंग के लिए अपने pseudocolor बदलने के लिए, प्रयोग किया जा रहा है अगर शटर खुला है सुनिश्चित करें.
    6. चयनित चैनल के एक पूर्वावलोकन स्कैन शुरू और डिटेक्टर लाभ समायोजित और इष्टतम प्रदर्शन के लिए ऑफसेट करने के लिए एक 'लाइव' इमेजिंग मोड सक्रिय करें. अनुक्रमिक खिड़की में प्रत्येक स्कैन के लिए इस दोहराएँ.
    7. आसान पुन: उपयोग के लिए इन मल्टी चैनल स्कैन की सेटिंग सहेजें. नोट: इस प्रयोक्ता बाद के सत्र में सेटिंग्स को फिर से लोड करने के लिए अनुमति देता है.
  3. 'मार्क एक के रूप में भेजा बहु स्थिति कब्जा, सक्रियएन डी का प्रदर्शन सॉफ्टवेयर में 'का पता लगाएं, और समन्वय अंक रीसेट.
  4. केंद्रीय और राज्याभिषेक सिवनी बीच चौराहे से शुरू, हड्डी इमेजिंग क्षेत्र स्कैन, दोनों autofluorescence का उपयोग अस्थि मज्जा क्षेत्र की गहराई स्कैन (छद्म हरे रंग का) और किया (छद्म रंग लाल) एक समग्र दृष्टि से. नोट: autofluorescent कोशिकाओं दोनों चैनलों में उपस्थित होने और लेबल की कोशिकाओं समग्र छवि में लाल ही कोशिकाओं के रूप में दिखाई देगा था जबकि समग्र छवि में पीला / नारंगी दिखाई देगा.
  5. एक सेल का पता चला है, "मार्क के बाएं हाथ की ओर नई स्थिति चिह्न जोड़ें" और ढूँढें "विंडो पर क्लिक करके उपकरण में एक नया समन्वय स्थिति (एक्स, वाई और जेड) के रूप में इस मार्क मार्क और लगाएं ' .
  6. देखने के वर्तमान क्षेत्र की जांच की गई है, जब वाम / सही / नीचे / ऊपर या तो देखने में से एक क्षेत्र के चरण दूरी चाल है. धीरे धीरे वें के बाईं ओर पूरे इमेजिंग खिड़की के आसपास के क्षेत्र में काम कर रहे, देखने के प्रत्येक क्षेत्र के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएंई केंद्रीय सीवन, माउस के नाक की ओर बढ़ रहा है. केंद्रीय सीवन विभाजन की दृष्टि में है एक बार, सिवनी के दाईं ओर करने के लिए कदम और (राज्याभिषेक सिवनी की ओर, यानी) विपरीत दिशा में बाईं ओर स्कैनिंग प्रक्रिया को दोहराने. का उपयोग ब्याज की किसी भी नई कोशिकाओं के निर्देशांक मार्क मार्क और ढूँढें 'उपकरण.
  7. इमेजिंग खिड़की की स्कैनिंग पूरा हो गया है एक बार, 'मार्क और खोज' का उपयोग अंक की समीक्षा के लिए उपकरण (वांछित बिंदु का चयन करें और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक बिंदु की समीक्षा). प्रत्येक स्थिति के लिए प्रत्येक कोशिका के चारों ओर एक z ढेर के ऊपर और नीचे सेट, (कई सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों तुम खाली जगह पर कब्जा कम कर देता है जो प्रत्येक स्थिति के लिए स्वतंत्र Z-ढेर प्रदर्शन करने के लिए अनुमति देगा). प्रत्येक बिंदु के लिए, ऊपर ध्यान केंद्रित करने और नीचे और 3 डी z ढेर को पकड़ने के लिए ऊपर और नीचे जेड पदों सेट और में व्यक्ति बिंदु अपडेट 'मार्क और लगाएं'. 5μm लिए z ढेर अंतराल सेट और एक उचित गुणवत्ता के लिए प्रत्येक अनुक्रमिक स्कैन चैनल के लिए औसत: रेखा ओअनुसंधान फ्रेम औसत. नोट: औसत करने के लिए स्कैन की संख्या बढ़ाने से अधिग्रहण के समय की लंबाई बढ़ जाती है.
  8. पूरे स्कैन प्रक्रिया शुरू करने से ब्याज के प्रत्येक बिंदु के लिए एक उच्च गुणवत्ता संदर्भ ढेर मोल (अक्सर बल्कि "कब्जा" से 'आरंभ' के रूप में). नोट: इस स्कैन भविष्य उच्च गति इमेजिंग के लिए एक संदर्भ के रूप में कार्य कर सकते हैं.
  9. एक बार, उच्च गुणवत्ता स्कैन के साथ समाप्त कब्जा करने के लिए एक समय चूक सेटिंग को सक्रिय करें.
  10. समय चूक सेटिंग्स में, इच्छित लंबाई (जैसे, 5 घंटा) के लिए 5 मिनट और समग्र चलाते समय के लिए समय अंतराल सेट. समग्र स्कैन करने के लिए इन सेटिंग्स 'लागू करें'. नोट: एक 5 मिनट का समय व्यतीत हो जाने के अंतराल अनुमति देने के लिए इस स्कैन के समय को कम करने के लिए, एक, औसत के लिए इस्तेमाल किया स्कैन की संख्या कम 512 x 512 पिक्सल के संकल्प की सीमा, आवश्यक चरण के सुधार के साथ (द्विदिश के लिए स्कैनिंग में परिवर्तित करने की आवश्यकता हो सकती है ) दोनों स्कैन दिशाओं संरेखित, और / या 600 हर्ट्ज या अधिक (600 से अधिक को स्कैन गति को बढ़ाने के लिएहर्ट्ज) का प्रदर्शन सॉफ्टवेयर मंच के लिए इमेजिंग क्षेत्र की जूमिंग कारण होगा. यह एक अनुक्रमिक इमेजिंग मोड शुरू में एक उच्च गुणवत्ता छवि ढेर प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जबकि एक साथ अधिग्रहण के समय चूक इमेजिंग के दौरान गति को बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है कि नोट करने के लिए भी महत्वपूर्ण है - इस अतिरिक्त स्थानों जो चैनलों के बीच कुछ मामूली पार बात में हो सकता है सही ढंग से अलग हो संदर्भ के ढेर की प्रारंभिक पकड़ने पर महत्व.
  11. (प्रदर्शन सॉफ्टवेयर में 'आरंभ' बटन पर क्लिक करके के रूप में पहले) इमेजिंग शुरू. नोट: बाहर सूखी और महत्वपूर्ण संकेत और हीटिंग पैड तापमान की निगरानी नहीं करता नियमित रूप से, जब जरूरत माउस ज्यादा सावधान नहीं किया जा रहा है, आगे छोटी खुराक प्रशासन द्वारा संज्ञाहरण के उचित स्तर को बनाए रखने के उद्देश्य सुनिश्चित करने के लिए पानी को ऊपर करने के लिए सुनिश्चित हो भर.
  12. जब समाप्त हो, गुदा जांच और ज से तारों को सुनिश्चित करने धारक से लेंस बढ़ाने के लिए और फिर खुर्दबीन मंच से धारक को दूरचटाई खाने क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं.
  13. मंच धारक से बुद्धि खोलना और ध्यान से माउस को हटा दें. ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग माउस चुनना और खोपड़ी बंद यह तड़क द्वारा धातु सिर टुकड़ा हटा दें. डिस्क में डाटा सेव करें और बाद में विश्लेषण के लिए सर्वर के लिए स्थानांतरण. नोट: सिर टुकड़ा आदर्श कुछ घंटों के लिए एसीटोन में सूई और अंत में अवशिष्ट सीमेंट बंद रगड़ से साफ किया जाता है.

Representative Results

कस्टम, एक calvarium इमेजिंग खिड़की सहित उच्च परिशुद्धता माउस धारक घातक विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों (चित्रा 1 ए) में इंजेक्शन FACS शुद्ध, लेबल HSPCs के लंबे समय तक इमेजिंग की अनुमति देता है. आमतौर पर, 15 के बीच के इंजेक्शन के बाद - 20 हजार लेबल कोशिकाओं, 8 से 15 कोशिकाओं खोपड़ी अगले दिन की अस्थि मज्जा इमेजिंग क्षेत्र के भीतर आम तौर पर स्वीकार करने योग्य हैं. पहचान HSPCs (चित्रा 1C और फिल्म) के 4D समय चूक फिल्मों द्वारा पीछा 120 माइक्रोन मोटाई, (चित्रा 1 बी), - यहाँ यह लगभग 90 की अस्थि मज्जा क्षेत्रों HSPC युक्त के एकल कक्ष संकल्प 3 डी के ढेर प्राप्त करने के लिए कैसे दिखाया गया है.

दंत सीमेंट बेहतर तैयार नहीं है अगर suboptimal परिणाम उदाहरण के लिए पानी और यह धारक के ऊपर से ऊपर सबसे ऊपर जा सकता है, भले ही गैर सील क्षेत्रों से रिसाव हो सकता है, प्राप्त कर रहे हैं, किसी भी समय की अवधि में जो लेंस डूबा नहीं है पानी में काले च की ओर जाता है rames. छवियों में कुछ बहाव अचानक छलांग करने के लिए अग्रणी, लेकिन यह माउस के प्रगतिशील टुकड़ी के लिए अग्रणी suboptimal सीमेंट आसंजन द्वारा बल, और स्थापित इमेजिंग के perturbations द्वारा किया जा सकता है, कारण माउस धारक की सामग्री के थर्मल विस्तार करने के लिए अनिवार्य है समय चूक इमेजिंग के दौरान ध्यान देने की. पहले से imaged पदों समीक्षा जब बहु बिंदु समय चूक इमेजिंग के दौरान बहाव भी मंच आंदोलनों में अशुद्धियों के कारण हो सकता है. समय चूक फिल्मों में बहाव और हकलाना कलाकृतियों छवि पंजीकरण एल्गोरिदम का उपयोग करके के लिए सुधारा जा सकता है.

तालिका 1 उत्तेजना और उत्सर्जन सेटिंग्स.

13px; "> 488 एनएम
कलर चैनल उत्तेजना उत्सर्जन
GFP 500-530 एनएम
Autofluorescence 543 एनएम 560-610 एनएम
था 633 एनएम 640-700 एनएम
एसएचजी 840 एनएम (सांसद) 400-450 एनएम

चित्रा 1
माउस calvarium में HSPCs की विवो 4D इमेजिंग में चित्रा 1. प्रयोग की (ए) को रेखांकित (बी - सी).. प्राप्त परिणामों के उदाहरण (बी) के एक 3 डी ढेर से 2 डी स्लाइस (कुल गहराई 114 मीटर है), मज्जा हड्डी (सफेद) से संकेत युक्त, लेबल किया कोशिकाओं (लाल) , autofluorescent सीईएलरास (पीला) और osteoblastic कोशिकाओं (हरा). स्केल सलाखों:. Osteoblastic कोशिकाओं (हरा) की निकटता में पलायन एक लेबल किया एचएससी (लाल) दिखा एक 4D समय व्यतीत फिल्म से 100 माइक्रोन (सी) 2 डी स्लाइस. बिंदीदार रेखा सेल के विस्थापन पर प्रकाश डाला गया. स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन (बी) और 100 माइक्रोन (सी). नोट:. वीडियो लेख के दौरान दिखाया गया है (सी) में समय चूक अधिग्रहण से प्राप्त फिल्म इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

क्या पूरा किया गया?

प्रोटोकॉल माउस calvarial अस्थि मज्जा में शुद्ध FACS के प्रवास, पूर्व vivo लेबल, प्रतिरोपित HSPCs नजर रखने के लिए समय चूक बहु आयामी इमेजिंग का उपयोग करता है. एकल प्रतिरोपित कोशिकाओं की पहचान हासिल किया गया है और इन उच्च सटीकता के साथ समय (मानव संसाधन) की लंबे समय से अधिक नजर रखी जा चुके हैं. श्वास प्रेरित आंदोलन कलाकृतियों को कम से कम किया गया है और कोशिकाओं को बार बार एक लंबे समय के पाठ्यक्रम से अधिक reimaged किया गया है.

भविष्य दिशाओं क्या हैं?

तकनीक के विकास को छोटा और नोट (माउस के लिए वसूली की प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए एक सप्ताह या उससे अधिक है और ऐसे isoflurane के रूप में गैस anesthetics के उपयोग के दौरान, कई दिनों पर इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए वसूली प्रयोगों की दिशा में प्रगति कर सकते हैं: वसूली प्रयोगों सख्ती की आवश्यकता बाँझ सर्जरी की स्थिति और उपयुक्त दर्दनाशक दवाओं के प्रशासन). देवएक vivo में रंगों का बड़ा रंग पैलेट के साथ ही इसके अलावा, बहु लेबलिंग प्रयोगों की सुविधा अस्थि मज्जा के भीतर सेल सेल बातचीत में और अधिक जानकारी प्रदान करते हैं और भविष्य में और अधिक जटिल प्रयोगों के लिए अनुमति देगा hematopoietic कोशिकाओं के कुशल आनुवंशिक लेबलिंग के elopment. साथ ही, कई अस्थि मज्जा संरचनाओं और स्ट्रोमा घटकों के एक साथ लेबलिंग HSPC आलों में हो रही घटनाओं की एक और पूरी तस्वीर प्रदान करेगा. समय चूक फिल्मों की छवि स्थिरता माइक्रोस्कोप स्थिर आगे के रूप में अच्छी तरह से छवि पंजीकरण एल्गोरिदम का उपयोग करके नमूना और postacquisition में तापमान ढ़ाल कम करके पूर्व अधिग्रहण सुधार किया जा सकता है.

सीमाएं:

वर्णित तकनीक कुछ सीमाएँ प्रस्तुत करता है. इंजेक्शन anesthetics के प्रशासन के बाद चूहों की जीवन रक्षा अप्रत्याशित है और इसे करने के लिए व्यक्तिगत प्रतिक्रिया के आधार पर अनुभव जटिलताएं बहुत आसान हैसंवेदनाहारी. माउस संज्ञाहरण से उबरने के लिए और यह माउस आदर्श समय चूक इमेजिंग की अवधि सीमित बरामद किया है अगर ध्यान से योजना के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है के लिए आम तौर पर, एक इमेजिंग सत्र अब, मुश्किल है. इंजेक्शन anesthetics का उपयोग प्रत्येक इमेजिंग सत्र के लिए पिछले सकता है समय सीमा. यह संवेदनाहारी की एक छोटी खुराक readministering द्वारा संज्ञाहरण लम्बा संभव है, यह मुश्किल यह सही और माउस overdosing में vivo इमेजिंग की समयपूर्व समाप्ति की सबसे लगातार कारणों में से एक है प्रदर्शन है. Isoflurane के> 2 घंटा लंबा प्रशासन शायद ही कभी सफल होने के बाद गैस संज्ञाहरण माउस की लेकिन तेजी से वसूली, कम विषाक्त है और एक लंबे समय तक प्रारंभिक इमेजिंग सत्र के लिए अनुमति देता है. तकनीक की एक और सीमा की वजह से तेजी से छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यकता के लिए, बहु बिंदु समय चूक इमेजिंग के दौरान प्राप्त की जा सकती है कि छवियों के सीमित संकल्प है. फोकल बहाव या क्षेत्र के साथ मिलकर यह, (डिस्क कूदता) ऊपर ussed, कोशिकाओं की ट्रैकिंग कठिन बना सकते हैं.

वैकल्पिक तरीकों के साथ तुलना करें:

HSPCs आमतौर पर किया lipophilic डाई के साथ चिह्नित कर रहे हैं, लेकिन [16] में समीक्षा के रूप में दीर और DiI रंजक, बराबर विकल्प और अन्य सेल रंजक के रूप में लंबे समय के रूप में पर्याप्त उज्ज्वल इस्तेमाल किया जा सकता हैं. कोशिकाओं के पूर्व vivo लेबलिंग के साथ HSCs के दीर्घकालिक कार्य प्रभावित नहीं दिखाया गया है किया है, भले ही यह कोशिकाओं के विभाजन पर पतला है था कि सीमा (या किसी भी अन्य रासायनिक डाई) है. HSCs प्रत्यारोपण के बाद पहले दिन के दौरान पैदा करना, इन कोशिकाओं के लिए शोर अनुपात करने के लिए संकेत तेजी से कमजोर होती जाती है. आनुवंशिक हेरफेर और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के माध्यम से कोशिकाओं की अंतर्जात लेबलिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन खोपड़ी की हड्डी के माध्यम से पता लगाने योग्य संकेत उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं के रूप में लंबे समय के रूप में, एक व्यवहार्य विकल्प विधि है. वैकल्पिक techn के एक नंबर रहे हैंउपलब्ध iques अपने स्वयं के लाभ और सीमाओं के साथ, अस्थि मज्जा अंतरिक्ष के भीतर प्रत्येक HSPCs की इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए. Confocal इमेजिंग एक शल्य ड्रिल के साथ टिबिया और हड्डी तामचीनी के thinning की शल्य प्रदर्शन के बाद, जबकि फाइबर ऑप्टिक आधारित इमेजिंग उपकरणों की निवेशन, लंबी हड्डियों [8] में अस्थि मज्जा पुनर्गठन की इमेजिंग के लिए अनुमति दी [12] HSPCs में रहने के विस्तृत चित्र का उत्पादन लंबी हड्डियों की परिधीय क्षेत्रों. हालांकि इन तरीकों में कहीं अधिक आक्रामक यहाँ वर्णित है और इसलिए एक ही माउस के भीतर एक ही अस्थि मज्जा क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित इमेजिंग सत्र दोहराने की अनुमति नहीं देते हैं एक से हैं. इसके अलावा, यह इन तकनीकों आसपास के ऊतकों में व्यापक क्षति के लिए अपरिहार्य प्रतिक्रिया दी मनाया कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है कि संभव है. HSPCs excised, खंडित femurs [11] पर रखा coverslips के माध्यम से समय का संक्षिप्त अवधि के लिए imaged किया गया है, HSPCs पर ऊतक के इस कठोर तैयारी की लेकिन प्रभाव clea नहीं हैअनुसंधान और तकनीक ही समय बिंदु टिप्पणियों प्राप्त करने के लिए विशिष्ट इस्तेमाल किया गया था. फिक्स्ड हड्डियों दाग, धारावाहिक वर्गों में sectioned, और प्राप्त छवियों संवहनी डाले उपयोग किया जाता है, खासकर जब उत्कृष्ट 3 डी संकल्प, उपलब्ध कराने, एक 3 डी मॉडल में खंगाला गया है [17], और हाल ही में लेजर स्कैनिंग Cytometry (LaSC) मात्रात्मक प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है बगल में HSPCs के बारे में उपाय, [18] immunostaining से प्रकाश डाला लेकिन कोशिकाओं के व्यवहार के बारे में कोई अस्थायी जानकारी प्रदान करने में असमर्थ हैं. इस नई तकनीक में वर्णित तकनीकों 4D में कोशिकाओं की निगरानी के लिए 3 डी में अच्छा संकल्प, पर्याप्त लौकिक नमूने का एक संयोजन प्रदान करते हैं और वे इसलिए अस्थि मज्जा के साथ बातचीत HSPCs की लंबे समय तक निगरानी प्राप्त करने के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण की पेशकश, अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव हैं microenvironment.

Acknowledgments

इमेजिंग डॉ मार्टिन Spitaler द्वारा प्रबंधित इंपीरियल कॉलेज लंदन के फिल्म की सुविधा के भीतर स्थित एक ईमानदार Leica SP5 confocal खुर्दबीन पर बाहर किया गया था.

नमूना धारक और बुद्धि शमूएल जोन्स और डॉ साइमन Schultz से सलाह के साथ, इंपीरियल कॉलेज लंदन के केमिकल इंजीनियरिंग विभाग के सहयोग से बनाया गया था.

निकोला Ruivo, फ्रांसिस्को Diaz और इंपीरियल कॉलेज में सीबीएस स्टाफ माउस पशुपालन पर उनकी सहायता और सलाह के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी. मार्क स्कॉट CRUK, KKLF, बीबीएसआरसी और HFSP द्वारा CRUK और क्रिस्टीना लो सेलसो द्वारा HFSP और फिल्म, Olufolake Akinduro द्वारा वित्त पोषित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine (Narketan 100 mg/ml) Vetoquinol 407575 0107 C Other anesthetics may be used in place of this.
Medetomidine (Domitor 1 mg/ml) Elanco 134800-2 Other analgesics may be used in place of this.
Vibrant DiD cell labeling solution Roche Products Ltd. V22887 Other colors are available and may be used if required.
Lacrilube ophtalmic ointment Allergan n/a avaliable by prescription by the local vet
Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement Associated Dental Products Ltd. via Kemdent SUN527 We use shade A3, but any shade of cement can be used.
PBS multiple equivalent
Insulin syringes Terumo Medical Corporation SS10M3109 1 ml, 31 G
Mouse restrainer Harvard Apparatus 340031 Cone type (small)
Autoclaved forceps and scissors Agar Scientific AGT577
AGT5034		 Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip)
Weigh boat and cement stirrer VWR 611-1996/231-0370 5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor
Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser Leica Microsystems Call for quote
25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) Leica Microsystems 11506323 HCX IRAPO L lens
Custom designed mouse holder Imperial College Engineering Workshop See Figure 1 for details
Heating pad with rectal thermometer probe BASi Instrumentation FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 Heat mat/ Control box/ Thermometer probe

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 91 hematopoietic स्टेम सेल multiphoton माइक्रोस्कोपी सेल ट्रैकिंग अस्थि मज्जा आला calvarium इंट्रा महत्वपूर्ण confocal माइक्रोस्कोपी समय चूक इमेजिंग मल्टी मॉडल माइक्रोस्कोपी
वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के <em>Vivo</em> 4 आयामी ट्रैकिंग <em>में</em>
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Scott, M. K., Akinduro, O., Lo… More

Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow. J. Vis. Exp. (91), e51683, doi:10.3791/51683 (2014).

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