Summary
A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento.
Abstract
Através de um delicado equilíbrio entre a quietude ea proliferação, auto-renovação e produção de progênie diferenciada, as células-tronco hematopoéticas (CTH) manter o volume de negócios de todas as linhagens de células sanguíneas maduras. A coordenação dos sinais complexos que levam a destinos específicos HSC depende da interação entre HSCs e microambiente da medula óssea complexo, que ainda é pouco compreendida [1-2].
Descrevemos como pela combinação de um suporte de amostra recentemente desenvolvido para o posicionamento dos animais estável com confocal multi-passo e de dois fotões, em técnicas de imagiologia in vivo, é possível obter pilhas 3D de alta resolução contendo hspCs e seus nichos circundantes e controlá-los ao longo do tempo através de vários pontos de lapso de tempo de imagem. Imagem de alta definição permite detectar ex vivo de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas rotulados (hspCs) residentes dentro da medula óssea. Além disso, vários pontos de time-lapse de imagens 3D, obtained com configurações de aquisição mais rápidos, fornece informações precisas sobre o movimento HSPC e as interações recíprocas entre hspCs e células do estroma.
Rastreio de hspCs em relação às células osteoblásticas positivo para GFP é mostrado como um exemplo de aplicação do presente método. Esta técnica pode ser utilizada para rastrear qualquer hematopoiético estromal ou célula marcada de forma apropriada de interesse dentro do espaço da medula óssea do rato calvária.
Introduction
Apesar de nichos de células estaminais terem sido reconhecido há décadas 3 e bem caracterizados em vários tecidos, tais como o bolbo olfactivo, fibra muscular, bojo folículo piloso ou CNS zona subventricular 4-7, as interacções entre as células hematopoiéticas estaminais (HSCs) e microambiente da medula óssea ( BM) são ainda mal compreendido, devido à dificuldade de observar directamente através de células individuais do osso, bem como a natureza extremamente fluido do próprio tecido. Tem sido demonstrado, por meio de um número de estudos funcionais baseados em ablação ou sobre-expressam genes específicos em qualquer HSCs ou as células estromais do próprio microambiente, que uma rede complexa de diferentes tipos de células e os sinais reguladores é responsável por regular o equilíbrio delicado entre a quiescência , proliferação, diferenciação e expansão de HSCs 1-2. O crosstalk entre HSCs e seus nichos podem ser compreendidas em profundidade apenas através da observação direta. Este é achgraças ievable para o desenvolvimento de protocolos avançados de imagem, combinando a tecnologia disponível não só em termos de microscopia, mas também de soluções de suporte da amostra e do software de aquisição.
Resolução de uma única célula de imagem ao vivo de células estaminais progenitoras hematopoiéticas e transplantados (hspCs) na BM compartimento dos ossos calvária de ratinho mostrou que hspCs enxertar localizar na proximidade de vasos SDF-1 e VCAM-1-positivos, 8-9 e que as células mais imaturas encontram-se dentro de 15 - 20 micra de células osteoblásticas GFP positivas (Col2.3-GFP linha de rato transgénico, em que o promotor de colagénio 1α restrição osteoblastos dirige a expressão da GFP), enquanto a sua descendência são mais distal 10. Observações semelhantes foram obtidos a partir dissecados e fraturado ossos do fêmur e dos ossos 11 tibeal diluído 12. Imagens de medula óssea calvária permanece a abordagem menos invasiva para alcançar a visualização direta de hspCs dentro thmicroambiente nativo eir.
Com qualquer imagem espécime vivo há uma necessidade inerente de manter a amostra o mais imóvel possível para evitar qualquer tipo de artefato desnecessários devido ao movimento da amostra. A respiração faz com que os movimentos oscilatórios da cabeça do rato, que precisam ser evitados na obtenção de imagens de medula óssea calvária. Titulares estereotáxicos convencionais, usados por exemplo para imagiologia cerebral e de eletrofisiologia, não são adequados para a imagem latente calvarium porque obstruir os ossos frontais. A partir de um suporte de rato usado para minimizar o sofrimento durante o exame e eletrofisiologia estudos ao vivo 13, o titular da 2 componente foi desenvolvido, com um pequeno pedaço fixado na cabeça do mouse para criar uma janela de imagem ligada a um braço maior garantia de manter estável com um placa de base pesada que assegura firmemente no estágio do microscópio. Protegendo a peça de cabeça para o crânio do mouse permite a respiração livre, enquanto ainda imobilizar a cabeça no lugar e eliminando adequadamente movements devido à respiração. Um mecanismo de "fechadura e chave" que liga a cabeça de peça para o corpo de suporte permite que o tamanho da janela para ser minimizados, bem como o aumento da precisão de posicionamento, por conseguinte, simplificar a cirurgia, e o ajuste da placa de base na fase de permite um alinhamento preciso do microscópio. Para monitorar com precisão células móveis, um protocolo de lapso de tempo multi-ponto foi projetado para permitir o rastreamento de células ao longo do tempo com intervalos de 5 min entre os períodos. HSCs Aqui, fez marcados são injetadas em ratos repórter col2.3GFP osteoblasitc 10,14 e fotografada, aproximadamente, 20 horas mais tarde. O titular do rato que foi concebido e as configurações de imagem necessários para realizar uma rápida multi-ponto de lapso de tempo de imagem das mesmas áreas ao longo de um período de horas múltipla são descritos em detalhe.
Protocol
Todos os procedimentos que envolvam o uso de animais são realizados de acordo com a legislação local. Nosso trabalho é aprovado pela UK Home Office assim como o painel de avaliação ética do Imperial College. Os procedimentos autorizados estão descritos na documentação de licença do projeto e seguir as orientações que garantem o bem-estar do animal em todos os momentos. Certifique-se a aderir à legislação em matéria de experimentação animal do país, onde o trabalho é realizado.
1. Labeling e Injection de hspCs:
- Células colheita, como descrito por Lo Celso 14-15.
- Preparar as células a uma concentração de 10 6 células / ml em PBS. NOTA: Use um hemocitômetro ou as informações fornecidas pelo classificador celular para contar as células; o número de células a ser marcado e injectado varia dependendo do tipo de célula (por exemplo mancha 10.000 - 20.000, hsc 100.000 - 300.000 HPCs); se trabalhar com menos de 10 5 células, ressuspender em 100 ul de PBS; é importante para ter as células em PBS sem soro, como soro inibe a coloração.
- DiD Adicionar à suspensão celular numa concentração final de 5 uM e a suspensão imediatamente vortex para assegurar que o corante não precipitar da solução e deixar de rotular as células.
- Incubar durante 10 minutos a 37 ° C, em seguida, lavar por centrifugação a 500 xg durante 5 minutos, decantação do líquido e ressuspender o sedimento em um volume apropriado de injecção IV (~ 100 - 150 ul)
- Ressuspender as células em 200 ul de PBS e recolher para uma seringa de insulina. NOTA: uma seringa de insulina é recomendada durante uma seringa convencional porque não tem agulha espaço morto e, portanto, permite que a administração da suspensão de células inteira para o mouse.
- Injectar as células num ratinho letalmente irradiados através de injecção na veia da cauda. NOTA: A irradiação tem conhecido, um impacto considerável no microambiente da medula óssea (ambos os componentes hematopoéticas e estromais), que se desenvolve ao longo time. Por isso, é muito importante para manter sincronismo consistente para irradiação, injeção de células (4 a 24 horas de irradiação para o melhor enxerto) e de imagem. Aqui irradiação é realizada de 6 horas antes da injeção e de imagem é realizado 20 horas após a injeção.
- Colocar o rato numa câmara quente (37 ° C) até que a veia da cauda parece vasodilatado.
- Mova o rato para o limitador e cuidadosamente deslize a agulha na veia da cauda.
- Injectar as células na veia - nenhuma resistência a injecção deverá ser encontrado.
- Deixar o rato S / N, de modo a permitir que as células migram para os espaços de medula óssea.
2 Preparando o mouse for Imaging
- Autoclave um par de pinças finas e um par de tesouras finas, bem como um capacete antes de usar e armazenar em um ambiente estéril.
- Certifique-se de anestésico o mais fresco possível, (0,38 ml Ketamina + 0,25 ml Medetomidine + 4,47 ml de água). NOTA: otos anestésicos aprovados, incluindo o isoflurano eo outro injetável, será muito eficaz. O coquetel descrito é para ser administrado por via intraperitoneal em 0,1 ml por 10 g de peso corporal, com recargas de 30-50 ul administrados a cada 45 minutos a 1 hora.
- Ligue o laser de dois fótons, se necessário, em seguida, iniciar o microscópio e software, a calibragem do palco quando solicitado. Ligue os lasers e permitir-lhes para se aquecer e estabilizar enquanto prepara o mouse para a imagem latente.
- Anestesiar o rato utilizando a mistura do anestésico preparada (passo 2.2) para o anestésico escolhido por meio de injecção intraperitoneal. Monitorizar o início da anestesia profunda através do pedal do reflexo agora e em intervalos regulares durante todo o protocolo. NOTA: o mouse devem ser cuidadosamente monitorizados durante o processo e se a anestesia parece estar iluminando (normalmente após 45 - 60 minutos) e depois administrar uma dose top-up (conforme detalhado no 2.2). Esperar alguma variação entre os ratos de diferentes idades e sexo. É importante para discutir o protocolo de anestesia com o seu veterinário local para assegurar sejam tomadas precauções adequadas para assegurar o bem-estar do mouse.
- Pincelar o topo do couro cabeludo, com etanol a 70% em um tecido, garantindo a não ficar qualquer etanol nos olhos do rato.
- Usando fórceps e tesouras estéreis, remover cuidadosamente a porção central do couro cabeludo para expor a área de calvária a ser trabalhada: fazer uma pequena incisão na parte de trás da cabeça entre as orelhas, levantando-se a pele com fórceps. Enquanto mantém a pele para cima, a tesoura deslize sob a pele suavemente e cortar ao longo do lado de fora da área de imagem desejada.
- Limpe o osso exposto com cotonete estéril umedecido com PBS estéril para mantê-lo úmido.
- Coloque a peça de cabeça de metal no crânio do rato pronto para a imagem latente.
- Misturar uma quantidade adequada de cimento dentário de um barco de pesagem, até se obter uma pasta e aplicar rapidamente para a superfície inferior do capacete que se atribuem ao sKull.
- Antes dos jogos de cimento, coloque o capacete sobre o crânio do mouse, certificando-se de não obter qualquer cimento dental na área de imagem, em seguida, esperar por ele para definir.
- Aplique uma pequena quantidade de Intrasite hidrogel que mantém o crânio úmido.
- Prenda o capacete para o suporte e prenda no lugar com o parafuso, assegurando que as ranhuras caber dentro dos entalhes titular.
- Retire o hidrogel do crânio com cotonetes estéril e limpo com PBS estéril, antes de se transferir para o microscópio.
- Insira o suporte para o estágio do microscópio, posicione o tapete de aquecimento sob o mouse, inserir a sonda termômetro retal e segura tudo no lugar no palco com fita adesiva.
- Coloque uma pequena gota de pomada oftálmica nos olhos do rato para garantir que eles não sequem enquanto sob anestesia. NOTA: o mouse não devem ser deixados sozinhos em qualquer momento durante o processo de imagem sob anestesia.
in vivo de imagens: Pilhas de alta resolução e Time-lapse Aquisição
- Concentre-se no crânio através dos pedaços de olho.
- Preencha janela de imagem com purificada, água estéril e usando uma lente de imersão de água, abaixe-o para que ele toque a gota de água.
- Concentre-se no topo do crânio utilizando as oculares de microscópio, utilizando uma lâmpada externa como a fonte de luz.
- Posicionar a área de imagem no sutura central e mover para a parte traseira da cabeça para localizar a sutura coronária como uma posição de partida.
- Definir o microscópio para permitir a excitação eficaz e detecção dos fluoróforos relevantes especificadas na tabela de excitação e de emissão. NOTA: enquanto um confocal vertical Leica SP5 com uma cabeça de leitura galvanometer convencional rodando a plataforma de software LAS-AF é usado aqui, o procedimento pode ser facilmente replicado em outras plataformas microscópio / software. A lente usada aqui é a Leica HCX IRAPO L 25x W / 0,95 NA blentes equivalentes ut de outros fabricantes estão disponíveis com ampliação adequada e alta NA
- Coloque o software em um modo de capturar duas imagens XY, bem como um Z-stack 3D e definir a velocidade de imagem a 400 Hz e resolução de 512 x 512 pixels. NOTA: a configuração e hardware aqui resultará em um campo de visão de 620 um e isso pode variar em outras plataformas.
- Defina o software de modo que vários canais / faixas são capazes de ser capturado, bem como assegurar que o método de coleta é definido para alterar as configurações entre as pilhas, se possível, ou entre quadros, no mínimo. Configure três configurações de captura independentes, desligando a iluminação a laser, no final de aquisição de cada pilha. NOTA: três canais será necessário para este procedimento para reduzir a interferência entre canais.
- Configure as definições da primeira varredura seqüencial para o sinal de osso SHG dois fótons (840 nm de excitação; 400-440 nm de emissão); abrir o obturador para o laser MP e assegurar MGanho P e deslocamento são configurados corretamente, potência do laser é de 12,5 - 25% e que o laser é ligado. Selecione um PMT apropriado como o único detector e mudar a cor para branco. Nota: Os detectores NDD com filtros apropriados devem ser utilizados para a detecção de quando o osso disponível para atingir um sinal mais claro, mais profundo.
- Repita o procedimento de configuração do canal utilizado para o canal de GFP para a autofluorescência combinado (543 nm de excitação; 560 - emissão de 600 nm) e fez (633 nm de excitação; 650-720 nm de emissão), sob as segundas configurações de digitalização, utilizando duas PMTs apropriadas. Mude o canal de cor para verde para a autofluorescência e vermelho para o fizeram. Nota: usando verde como o canal de auto-fluorescência permite a detecção mais fácil de células positivas quando fez os dois canais estão sobrepostos - células autofluorescentes aparecer como amarelo / laranja devido a estar em ambos os canais, enquanto que as células aparecem apenas como uma vez que eles só aparecem no vermelho DiD canal. O canal de auto-fluorescênciasó é usado para esta comparação e não é utilizado em qualquer análise final, no entanto, se o utilizador desejar, esta pode ser alterada para uma cor diferente para efeitos de visualização, para evitar a confusão com o canal de GFP.
- Finalmente, a instalação da terceira e última varredura para GFP (488 nm de excitação; 500-530 nm de emissão); certificar-se de que o obturador está aberto, se necessário e em seguida, defina a potência do laser da linha de laser de 488 nm a cerca de 15% ou um nível adequado para o laser a ser utilizado, selecione um PMT apropriado como o único detector ativo e alterar o seu pseudo-verde.
- Ativar um modo de imagem "ao vivo" para começar a digitalização de visualização do canal selecionado e ajuste de ganho do detector e Compensação da exposição ideal. Repita esse procedimento para cada varredura na janela seqüencial.
- Salve as configurações desses scans multi-canal para facilitar a reutilização. NOTA: esta permite ao usuário recarregar as configurações nas sessões subseqüentes.
- Ative captura multi-posição, conhecido como 'Mark umnd Encontrar "no software demonstrado, e redefinir os pontos de coordenadas.
- Digitalizar área de imagem do osso, a partir do cruzamento entre a sutura central e coronal, digitalização a profundidade da área de medula óssea usando tanto autofluorescência (pseudo cor verde) e fez (pseudo-cor vermelha) com uma imagem composta. NOTA: As células autofluorescentes estará presente em ambos os canais aparecem laranja / amarelo na imagem composta enquanto que as células marcadas aparece como o vermelho-apenas as células na imagem composta.
- Quando é detectada uma célula, marque-a como uma nova posição coordenada (x, y e z) no "Mark and Find 'ferramenta clicando na janela" Adicionar Novo ícone de posição no lado esquerdo da "Mark and Find" .
- Quando o campo de vista atual foi examinado, passar a fase a distância de um campo de visão para a esquerda / direita / cima / baixo. Repita esse processo para cada campo de visão, trabalhando gradualmente em torno de toda a área da janela de imagem para a esquerda de the sutura central, movendo-se em direção ao nariz do mouse. Uma vez que a bifurcação sutura central é à vista, passar para o lado direito da sutura e repita o procedimento a digitalização do lado esquerdo no sentido inverso (ou seja, em direção à sutura coronal). Marque as coordenadas de todas as novas células de interesse pelo "Mark and Find 'ferramenta.
- Quando a digitalização da janela de imagem é completo, use o "Mark and Find 'ferramenta para rever os pontos (selecione o ponto desejado e analisar cada ponto individualmente). Defina a parte superior e inferior de uma pilha Z em torno de cada célula para cada posição, (muitas plataformas de software permitirá que você execute z-stacks independentes para cada posição, o que reduz a captura de espaço vazio). Para cada ponto, o foco para cima e para baixo e definir posições Z superior e inferior para 3D captura z-stack e atualizar o ponto individual no 'Mark and Find ". Definir intervalo de Z-Stack para 5m e uma média para cada canal de varredura seqüencial para a qualidade adequada: Linha oQuadro média r. NOTA: O aumento do número de exames a média aumenta o período de tempo de aquisição.
- Adquirir uma pilha de referência de alta qualidade para cada ponto de interesse, iniciando todo o processo de digitalização (muitas vezes referida como 'Start' em vez de "Capture"). Nota: Esta verificação pode funcionar como uma referência para a futura imagem de alta velocidade.
- Após ter terminado com a digitalização de alta qualidade, activar uma definição de lapso de tempo para a captura.
- Nas configurações de lapso de tempo, defina o intervalo de tempo para 5 minutos e tempo total de execução para o comprimento desejado (por exemplo, 5 h). "Aplicar" estas definições para a digitalização total. NOTA: para reduzir este tempo de verificação para permitir um intervalo de lapso de tempo de 5 minutos, pode-se necessário reduzir o número de exames utilizados para cálculo da média, limitar a resolução de 512 x 512 pixels, converter a digitalização para bidirecional (com correção de fase necessário para alinhar ambas as direções de varredura), e / ou aumentar a velocidade de verificação a 600 Hz ou mais (mais de 600Hz fará com que o zoom da área de imagem para a plataforma de software demonstrado). É também importante notar que, enquanto um modo de imagiologia sequencial foi usada para adquirir uma imagem de alta qualidade pilha inicialmente, a aquisição simultânea é utilizado para aumentar a velocidade durante a imagiologia de lapso de tempo - isto pode resultar em alguma ligeira a diafonia entre canais, que coloca adicional importância na captura inicial das pilhas de referência com precisão separados.
- Começar de imagem (como antes, clicando no botão 'Iniciar' no software demonstrado). NOTA: certifique-se de manter o nível adequado de anestesia pela administração de mais, doses menores quando necessário, tomando cuidado para não overdose o mouse, regularmente completar a água para garantir o objetivo não secar e monitorar os sinais vitais e temperatura de aquecimento-pad por toda parte.
- Quando terminar, levante a lente do suporte e, em seguida, remova o suporte desde a fase de microscópio, assegurando os fios da sonda retal e hcomer tapete não estão danificados.
- Desaparafuse o capacete do detentor do palco e remova cuidadosamente o mouse. Abater o mouse usando deslocamento cervical e remover a cabeça-peça de metal colocando-a fora do crânio. Salve os dados em disco e transferência de servidor para posterior análise. NOTA: A peça de cabeça é de preferência feita por meio de imersão em acetona durante algumas horas e finalmente a esfregar o cimento residual fora.
Representative Results
O costume fez, titular do mouse de alta precisão, incluindo uma janela de imagem calvarium permite imagens prolongado de FACS purificados hspCs, rotuladas injetadas em ratos receptores letalmente irradiados (Figura 1A). Tipicamente, após a injecção de entre 15-20000 células marcadas, 8 a 15 células são normalmente reconhecidas dentro da área de imagem da medula óssea do crânio no dia seguinte. Aqui é mostrado como adquirir resolução célula pilhas 3D únicos de HSPC contendo áreas de medula óssea de aproximadamente 90-120 espessura um, (Figura 1B), seguido por filmes dos hspCs identificados (Figura 1C e filme) lapso de tempo 4D.
Resultados sub-óptimos são obtidos se o cimento dental não é optimamente preparada, por exemplo, a água pode vazar a partir de áreas não seladas, e mesmo que ela pode ser carregada a partir da parte superior do suporte, de qualquer período de tempo em que a lente não é mergulhado em água leva a preto f Rames. Alguns deriva nas imagens é inevitável devido à expansão térmica dos materiais de suporte do mouse, no entanto, pode ser acentuada pela aderência de cimento abaixo do ideal, levando ao descolamento progressivo do mouse, e por perturbações da imagem criada, levando a mudanças súbitas do foco durante o exame de lapso de tempo. Deriva durante multi-ponto de lapso de tempo de imagem também pode ser causada por imprecisões nos movimentos de palco quando revisitar posições previamente trabalhada. Deriva e gaguejar artefatos em filmes de lapso de tempo pode ser corrigida por meio de algoritmos de registro de imagem.
Tabela 1 Excitação e configurações de emissão.
| Cor Canal | Excitação | Emissão |
| GFP | 13px; "> 488 nm500-530 nm | |
| Autofluorescência | 543 nm | 560-610 nm |
| DiD | 633 nm | 640-700 nm |
| SHG | 840 nm (MP) | 400-450 nm |
Figura 1 in vivo 4D de hspCs no rato calvária. Células exemplos de resultados obtidos (B) fatias 2D a partir de uma pilha 3D (profundidade total é de 114 mm), contendo sinal do osso colágeno (branco), fez marcados (vermelho) - (A) Esquema do experimento (C B).. , cel autofluorescentls (amarelo) e osteoblastos (verde). Barras de escala: 100 mm fatias (C) 2D a partir de um filme de lapso de tempo 4D mostra uma fez marcado HSC (vermelho), que migram na proximidade de células osteoblásticas (verde).. A linha pontilhada destaca o deslocamento da célula. Barras de escala: 50 mm (B) e 100 um (de C). NOTA:. O filme obtido a partir da aquisição de lapso de tempo em (C) é mostrada durante o artigo de vídeo Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O que foi realizado?
O protocolo usa imagem multi-dimensional de lapso de tempo para monitorar a migração de FACS purificado, ex vivo rotulados, hspCs transplantadas em camundongos medula óssea calvária. Identificação das células transplantadas único foi alcançado e estes foram monitorados ao longo de períodos prolongados de tempo (hr) com alta precisão. Respirar artefatos de movimento induzidos foram minimizados e as células foram reimaged repetidamente ao longo de um curso de tempo prolongado.
Quais são os caminhos futuros?
O desenvolvimento da técnica pode progredir para ensaios de recuperação, para permitir a imagiologia em vários dias, ao longo de uma semana ou mais, e o uso de gases anestésicos tais como o isoflurano para reduzir e simplificar o processo de recuperação para o rato (Nota: ensaios de recuperação requerem estritamente condições da cirurgia estéreis e administração de analgésicos apropriado). Devolvimento de uma maior paleta de cores de corantes in vivo, bem como a rotulagem genética eficiente de células hematopoiéticas também irá facilitar experiências múltiplas de rotulagem, fornecer mais conhecimento sobre as interacções célula-célula dentro da medula óssea e para permitir experiências mais complexas no futuro. Além disso, a rotulagem simultânea de estruturas de medula óssea múltiplas e componentes do estroma irá fornecer uma imagem mais completa dos eventos que ocorrem em nichos HSPC. Estabilidade de imagem dos filmes de lapso de tempo poderia ser melhorado preacquisition, estabilizando o microscópio ainda mais, bem como minimizar os gradientes de temperatura na amostra e pós-aquisição por meio de algoritmos de registro de imagem.
Limitações:
A técnica descrita apresenta algumas limitações. A sobrevivência de ratinhos após a administração de anestésicos injectáveis é imprevisível e é muito fácil de complicações experiência, dependendo da resposta individual aoanestésico. Geralmente, quanto mais tempo uma sessão de imagens, mais difícil é para o mouse para recuperar da anestesia e por isso é importante planejar com cuidado se o rato está a ser recuperado, o ideal é limitar a duração do tempo de lapso de imagem. O uso de anestésicos injetáveis limita o tempo de cada sessão de imagens pode durar. Embora seja possível para prolongar a anestesia por readministrar uma dose menor de anestésico, é difícil executar esta precisão e uma overdose o mouse é uma das causas mais freqüentes de cessação antecipada de imagem in vivo. Anestesia gás é menos tóxico e permite uma sessão de imagens mais inicial, porém rápida recuperação do mouse depois de> 2 horas longa administração de isoflurano raramente é bem sucedida. Outra limitação desta técnica é o limite de resolução de imagens que podem ser obtidos durante a multi-ponto de lapso de tempo de imagem, em virtude da necessidade de adquirir imagens rapidamente. Isso, juntamente com desvio de foco ou campo saltos (discoussed acima), pode fazer o rastreamento de células difícil.
Comparação com métodos alternativos:
HspCs são geralmente marcadas com o corante lipofílico fez, mas dir e DII corantes são alternativas equivalentes e outros corantes celulares podem ser utilizados, desde que suficientemente brilhante, como revisto em [16]. Mesmo ex vivo marcação das células com DID tem sido demonstrado que não afectam a função a longo prazo de HSCs, que tem a limitação de que DiD (ou qualquer outro corante químico) é diluída depois da divisão celular. Desde HSCs proliferar durante os primeiros dias após o transplante, a relação sinal-ruído para as células deteriora-se rapidamente. Rotulagem endógena de células por meio de manipulação genética e expressão de proteínas fluorescentes é um método viável, alternativo, enquanto as proteínas fluorescentes são expressos em níveis suficientemente elevados para gerar sinal detectável através do osso do crânio. Há um número de tecnol alternativaiques disponíveis para realizar imagem de hspCs dentro do espaço da medula óssea, cada uma com suas próprias vantagens e limitações. A inserção de dispositivos de imagem baseada em fibra óptica permitido para imagens de reconstituição da medula óssea em ossos longos [8], enquanto a imagem confocal após a exposição cirúrgica da tíbia e afinamento do esmalte óssea com uma broca cirúrgica [12] produziu imagens detalhadas de hspCs residente em as áreas periféricas dos ossos longos. Esses métodos, porém, são muito mais invasivo do que o descrito aqui e, portanto, não permitem a repetir as sessões de imagem com foco na mesma área da medula óssea dentro do mesmo mouse. Além disso, é possível que estas técnicas podem afectar as células observadas tendo em conta a resposta inevitável danos extensos no tecido circundante. HspCs foram fotografada por curtos períodos de tempo através de lamelas colocadas sobre excisadas, fêmures fraturados [11], no entanto, o impacto dessa preparação dura do tecido em hspCs não é clear ea técnica foi utilizada unicamente para obter observações pontuais vez. Ossos fixos foram seccionados em cortes seriados, com detalhes, e as imagens obtidas reconstruídas em um modelo 3D, proporcionando excelente resolução 3D, especialmente quando são utilizados moldes vasculares [17] e, recentemente, Laser Scanning Citometria (LASC) tem sido usado para obter quantitativa medidas sobre hspCs in situ, com destaque para imunomarcação [18], mas são incapazes de fornecer qualquer informação temporal sobre o comportamento das células. As técnicas descritas nesta nova técnica de proporcionar uma combinação de boa resolução em 3D, amostragem temporal suficiente para monitorar as células em 4D e são relativamente não-invasivo, por conseguinte, oferecer uma abordagem ideal para atingir controlo a longo prazo de hspCs interagindo com a medula óssea microambiente.
Acknowledgments
Imagem foi realizada em um microscópio vertical confocal Leica SP5 localizado dentro das instalações FILM, do Imperial College London, gerido pelo Dr. Martin Spitaler.
O suporte da amostra e capacete foi feito em colaboração com o departamento de Engenharia Química do Imperial College de Londres, com o conselho de Samuel Jones e Dr. Simon Schultz.
Nicola Ruivo, Francisco Diaz e funcionários da CBS no Imperial College foram determinantes para a sua assistência e aconselhamento sobre a criação de mouse. Mark Scott é financiado pelo HFSP e cinema, Olufolake Akinduro por CRUK e Cristina Lo Celso por CRUK, KKLF, BBSRC e HFSP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Narketan 100 mg/ml) | Vetoquinol | 407575 0107 C | Other anesthetics may be used in place of this. |
| Medetomidine (Domitor 1 mg/ml) | Elanco | 134800-2 | Other analgesics may be used in place of this. |
| Vibrant DiD cell labeling solution | Roche Products Ltd. | V22887 | Other colors are available and may be used if required. |
| Lacrilube ophtalmic ointment | Allergan | n/a | avaliable by prescription by the local vet |
| Kemdent "Diamond Carve" glass ionomer cement | Associated Dental Products Ltd. via Kemdent | SUN527 | We use shade A3, but any shade of cement can be used. |
| PBS | multiple equivalent | ||
| Insulin syringes | Terumo Medical Corporation | SS10M3109 | 1 ml, 31 G |
| Mouse restrainer | Harvard Apparatus | 340031 | Cone type (small) |
| Autoclaved forceps and scissors | Agar Scientific | AGT577 AGT5034 |
Iris scissors - 90 mm; Dumont HP tweezers (0.06 mm tip) |
| Weigh boat and cement stirrer | VWR | 611-1996/231-0370 | 5 ml weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor |
| Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser | Leica Microsystems | Call for quote | |
| 25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95) | Leica Microsystems | 11506323 | HCX IRAPO L lens |
| Custom designed mouse holder | Imperial College Engineering Workshop | See Figure 1 for details | |
| Heating pad with rectal thermometer probe | BASi Instrumentation | FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502 | Heat mat/ Control box/ Thermometer probe |
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