ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Diseksiyon yaygın doku içindeki DNA, RNA ve protein incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM) en sık kullanılan yöntem, ancak, yeni bir freze tekniği, mesodissection, son zamanlarda kullanılabilir. Biz mesodissected formalin sabit parafin Mycobacterium tuberculosis granülomlarının gömülü doku slaytlar RNA çıkarma göstermektedir.
Abstract
Diseksiyon bir on yıl için DNA, RNA ve protein düzeylerinde dokuların incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM), bugün kullanılan en yaygın mikrodisseksiyon tekniktir. Bu teknikte, bir lazer fokal dehidre doku bölümü 1 üzerinde uzanan bir termoplastik zarı eritmek için kullanılır. Doku kesiti bileşik daha sonra kaldırılır ve membran ayrılır. Bu tekniği, doku inceleme için başarılı bir şekilde kullanılabilir olmasına rağmen, zaman alıcı ve pahalı. Ayrıca, bu teknik kullanılarak prosedürlerin başarıyla tamamlanması böylelikle, bunun kullanımını sınırlayan, bir lazer kullanılmasını gerektirir. Mesodissection adlandırılan yeni daha ekonomik ve pratik bir yaklaşım mikrodisseksiyonla LCM tuzaklar olası bir çözümdür. Bu teknik, değirmen, bir slayt monte edilmiş doku numunesinden arzu edilen doku MESO-1/MeSectr sistemini kullanmaktadır eşzamanlı olarak arzu edilen bir doku örneği kurtarmak için sıvı dağıtma ve aspirasyon sırasındaBir sarf değirmen biraz. Diseksiyon işlemi başlamadan önce, kullanıcı (FFPE) gömülü formalin sabit parafin (H & E) referans slayt lekeli bir hematoksilen ve eozin ile slayt hizalar. Bundan sonra, operatör, arzu edilen diseksiyon alan annotates ve uygun bir bölümü incelemek için devam eder. Program diseksiyonu arşivlenmiş bir görüntü oluşturur. Mesodissection ana avantajı, bu deneyde nesil örnek kurmak on dakika ortalama alarak, bir slayt incelemek için gerekli kısa sürmesidir. Ayrıca, sistem önemli ölçüde daha düşük maliyetli ve kullanıcı dostudur. Hafif bir dezavantajı, bu lazer yakalama mikroskopisi gibi hassas olmasıdır. Bu yazıda mesodissection Mycobacterium tuberculosis (MTB) neden FFPE granülomlarında slaytları RNA ayıklamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Numuneler geleneksel elle bütün doku veya bir iğne ve neşter kullanılarak slaytlar birinden microdissected edilmiştir. Bu ilgi doku bölümünde ve çevre dokular bölümleri 2 arasında net bir ayrım gerektirir. Moleküler profil teknolojideki gelişmeler sayesinde, hücresel düzeyde doku değerlendirmek için artan bir ihtiyaç söz konusudur. Nedeniyle manuel mikrodisseksiyon sınırlamaları, LCM dahil teknikler daha fazla izolasyon hassasiyet sağlamak için kuruldu. Bu teknik, bir araştırmacı daha sonra, gen ekspresyonu profillemesi gibi alt-deneyleri için kullanılan çeşitli hücre tipleri ve slayt belirli hücre popülasyonlarının, izole sağlar. Alt deneyleri için çok etkili olsa da, LCM sınırlama olmadan değildir. Birincisi, LCM pahalı ve zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca nedeniyle RNA kararsız doğası, genellikle LCM örneklerinden 2 yüksek kalitede RNA elde etmek zordur. Nedeniyle diLCM sadvantages mikrodisseksiyon teknolojisindeki yeni gelişmeler hala bir ekonomik ve zaman hassas bir şekilde araştırmacıların daha fazla sayıda daha erişilebilir hale getirmek için gereklidir.
Şu anda mevcut mikrodiseksiyon teknolojide Böyle bir gelişme mesodissection olarak bilinen bir tekniktir. Bu teknikte bir makine değirmen ilgi açıklamalı doku kesiti için kullanılan ve bir tüketim değirmen parça 3 içine emer. Daha sonra, bu numune bir toplama tüpüne aspire edilir ve alt uygulamaları için de kullanılabilir. Bu sistemin avantajı, belirgin olarak daha az pahalı ve zaman duyarlı olmasıdır. Bizim tecrübelerimize göre, sistem on dakika içinde bir akciğer granülom dokusu bölümünün diseksiyon sağlar. Öte yandan, geleneksel LCM olasılıkla işlemini tamamlamak için saat gerektirir. Sistem operatörü açıklama için bir karşılaştırma yanı sıra aracı olarak kullanmak için bir referans slayt yüklemenizi sağlar. Ayrıca bir rapor özetleyen inci oluşturulurdisseke slayt e alanı. Mesodissection iki ana dezavantajı vardır. Birden fazla hücre ayıklanması etkili olmasına rağmen, tek bir hücreyi izole etmek zordur. Buna ek olarak, oluşturulan görüntünün hassas diğer görüntüleme mikroskop kullanıyorsanız kadar net değildir.
Tüberküloz (TB) önemli bir enfeksiyon hastalığı tüm dünyada insanlığın katil ve Mtb ile enfeksiyondan sonuçlanır. Mtb aerosollerle maruz kalan bireylerin çoğunda, latent enfeksiyon sınırlıdır. Yılda en az 10 milyon kişi, aktif verem hastalığı 4. sonuçlanır. Latent enfeksiyon esnasında, Mtb granülomlar olarak bilinen patolojik lezyonların içinde bulunur. Dolayısıyla Mtb enfeksiyon sonucu granülom 5 seviyesinde karar olduğu ileri sürülmüştür.
Burada mesodissection Mtb neden granülomlarını microdissect için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Kullanılan slaytlarEnfekte rhesus makakların FFPE akciğer dokusundan bulunmaktadır. Bu gösteri amaçla, kendi bütünlükleri içinde granülomlar teşrih edecek. Ayrıca RNA geri dokusundan elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Bu teknik, çeşitli örneklerden doku örnekleri uygulanır ve daha sonra aşağı doğru bir çok analizde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
2iD Görüntüleme Yazılımı ile 1. Kalibre Mesodissection Enstrüman
2iD görüntüleme yazılımı bu maddenin geri kalanı için yazılım veya program ya olarak adlandırılacaktır. Bu adımı doğru görüntüyü izlemek yanı sıra birden fazla slayt kareleri uyum için gereklidir.
- Enstrüman ve bilgisayarı açın.
- Açık yazılım ve "kalibrasyon aracı" seçeneğini seçin.
- Joystick'i kullanarak sahne seyahat kalibre. Sol üst konuma aşamasına gider. Programda adım 1 altında basın "set".
- Doğru konumunu indirmek için sahneye taşımak. Programda adım 2 altında basın "set".
- İlk kafası düzeneğini yükseltmek için "Z-tuşuna" basarak aspirasyon kalibre. Joystick basın "aspire darbe" butonuna ve "diseksiyon" butonuna dalgıç kontrol çubuğu kadar üst pozisyona ulaşır. Programın 3. adımda altında basın "set".
- Basın "aspirat sıfırlama &# 8221; düğmesine basın. Piston 4. adımda alt pozisyon basın "set" durur kez.
- "Ölçek sekmesine" üzerine tıklayın.
- Boş tarafına kalibrasyon cetvel yerleştirin.
- Gerekirse mikroskop odaklanın.
- Fareyi kullanarak iki ölçek bar arasında bir çizgi çizin.
- 2. adım. Basın "hesaplama" butonuna etiketli kutuda mesafeyi girin.
- "Crosshair" sekmesine tıklayın. 1 motor hızını çevirin.
- Kafa montaj içine xScisor yerleştirin. "Z-ekseni" düğmesine basarak z-ekseni hazır pozisyona alt kafa montaj. NOT: kafası düzeneği üst diseksiyon enstrüman üzerinde büyük bir yapıdır. XScisor bu maddenin geri kalanı için sarf değirmen biti olarak adlandırılacaktır.
- Joystick düğmesine "diseksiyon meşgul" tıklayın. NOT: Bu düğme joystick üstünde yer almaktadır.
- Görsel dönme merkezini tanımlayın. Bunu yapmak için, define ile dönme merkezi üzerinde crosshair merkezini taşımakProgramın adım 1'de d parametresi. Crosshair hizalamak için piksel ayarlamak için "x" ve "y ekseni" barlarda yukarı ve aşağı okları kullanın. "Done" sekmesini tıklayın.
- "Ev" simgesine tıklayın. NOT: Bu sağ üst köşesinde bulunan bir ev görüntüsü ile temsil edilir.
2.. Referans resim oluşturun
- Sahnede H & E slayt yerleştirin. Slayt üstüne opak kapak yerleştirin. H & E slayt istenen alana joystick'i hareket ettirerek araç sürücü. Oluşturulan görüntü kaydetme. NOT: "yakalama referans" sekmesi veya "teşrih" sekmesi Ya bu adımı tamamlamak için kullanılabilir.
3. Diseksiyon için Doku hizalama
- Ana ekranda "dokusu disseke" seçeneğini tıklayın.
- "Operatörü", "diseksiyon katılım numarası", "referans erişim numarası," "xScisor barkod numarası" & # doldurun8220; diseksiyon sıvı lot numarası, "" xScisor boyutu "ve" setup "sekmesinde" açıklama ".
- "Doku bulmak" sekmesine tıklayın.
- İthalat önceden referans görüntü kaydedilir.
- Sahnede 5 mikron kalınlığında bir boyanmadı FFPE slayt yerleştirin. Referans resimde gösterilen ile aynı alana sahne hareket ettirin. "Insert image" sekmesine tıklayın.
- "Hizalama" sekmesine tıklayın. Boyanmamış görüntü referans görüntüyü hizalamak için fare ve ilişkili okları kullanın.
4. Slayt Annotate
- "Annotatesekmesindeki" sekmesine tıklayın.
- Microdissected olacak slayt istenilen alanın etrafında bir daire çizmek için fareyi kullanın.
5.. Sarf Mill Bit yükleyin
- Bir sıvı hareket yukarı ve aşağı birkaç kez pistonu çekerek, burada istenen tampon, PKD tampon ile sarf değirmen biraz doldurun. Emin hava dışlamak olunkabarcıklar.
- "Z-ekseni butonuna" basarak Z-ekseni kaldırın.
- Makinenin içine sarf değirmen biraz yükleyin. Makinenin üst kısmına sarf değirmen biraz kaydırarak bunu böylece sarf değirmen bit siyah çizgi ile alet hatları üzerinde beyaz çizgi. Dalgıç doğru pozisyona indirdi izin vermek için basın "aspirasyon reset" düğmesine basın. NOT: Bu sarf değirmen biraz slayt kolay olmalıdır. Değilse, çentikler doğru hizada olduğundan emin olun.
- Tekrar "Z-ekseni" düğmesine basarak alt Z-ekseni.
6.. Doku teşrih (Şekil 4)
- "Teşrih" sekmesini açın.
- 1 motor ve aspirasyon hızları çevirin.
- "Show izleme" kutusunu işaretleyin. Not: Bu, kullanıcının diseksiyon işlemi sırasında kesilmiş alan görselleştirmek için izin verir.
- Teşrih etmeye hazır olduktan sonra, butonuna "meşgul" yanı sıra "aspire & # tutmaya devam8221; düğmesine doku incelemek için bir saat yönünün tersine joystick'i hareket ederken.
- Aspirat "tam" sekmesi kırmızıya döner kadar bir saatin tersi yönde incelemek için devam ediyor.
7. Sarf Değirmen biraz boş ve kaldır
- Sarf değirmen bitinin ucu altında bir 0.5 ul mikrofuge'de tüp yerleştirin.
- Basın "aspirasyon" kontrol çubuğu hızla mikrofuj tüpüne örnek çıkartmak için.
- Kullanılmış sarf değirmen biraz çıkarmak için artan bir güçle basın.
- Pistonu geri çekerek doku fragmanı durulayın. Sarf değirmen biraz içine kalan numuneyi ifade ileri pistonu itin. Doku parçası artık mikrofüj tüpü içinde ihtiva edilecektir.
Isıl İşlem Ardından proteinaz K Sindirim 8. Lizleyin Örnek
- Doku örneği geri için proteinaz K içinde 5 ug ihtiva eden 70 ul TE pH 8.5 ekleyin.
- Programlanabilir ısıtıcı-karıştırıcısı içine örneği yerleştir.
- Aşağıdaki ayara göre programlanabilir ısıtıcı-çalkalayıcı kullanılarak tam sindirim: 1500 rpm'de 30 dakika boyunca 60 ˚ ° C; 1500 rpm'de, 15 dakika boyunca 82 ˚ ° C; ve 450 rpm'de 1 dakika için 25 C ˚. Numune artık alt uygulamaları için hazır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anılan protokol FFPE doku slaytlar RNA ayıklamak için yeni bir mesodissection tekniği nasıl kullanılacağını gösterir. Bu protokolün etkinliği çeşitli enfeksiyon aşamalarında Mtb ile enfekte NHP'ın akciğer granülomlarının FFPE slaytlar aracılığıyla gösterilir. 1-3 alet. Şekil 4. görüntüleri Rakamlar diseksiyon sürecinin nasıl oluştuğunu gösteriyor ve yazılım. Tablo 1. tarafından oluşturulan çıkan görüntü Her durum, iltihaplı bir NHP bir granülom ile RNA ekstraksiyon sonuçları gösterilmektedir. RNA yükseltilir ve 16 yaş (Tablo 2-4) RT-PCR için kanıt izin vermek için saflaştırılmıştır. Tablo 4 bu nedenle Mtb 16s ribozomal alt biriminin varlığını teyit eder ve Mtb, microdissected örneklerinde.
Joystick dahil mesodissection enstrümanın 1.. Image Şekil. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2.. Mesodissection enstrümanın Closer view. "Z-ekseni" düğmesi, "motor" hızı ve "aspirasyon" hız topuzlar görüntünün sol tarafında gösterilir. "Aspiratör sıfırlama düğmesi" ve "on / off" düğmesi görüntünün sağ tarafında gösterilir. Slayt sahne aracının üstüne. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Joystick Closer view. Joystick, "aspire darbe" ve gösterilen "aşamalı hız" düğmeleri. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
NHP EB23 ikinci mesodissected bütün granülom Şekil 4.. Raporu. Bu çalışmada kullanılmıştır Hayvanlar aerosol ile CDC1551 MTB ile enfekte edilmiştir. Soldaki referans görüntü aktif olarak enfekte yanaklı makak bir H & E boyalı granulomayı gösterir. Disseke gereken ilgi istenilen alan yeşil özetlenmiştir. Orta sho görüntüws diseksiyon önce 5 mikron kalınlığında gelen boyanmamış FFPE slayt. Alanlar yazılımı kullanılarak birbirinden ayrıldı ve ilgi alanı arasında ilişki yeşil gösterilmiştir. Sağdaki görüntü aynı boyanmamış FFPE slayt sonrası diseksiyon gösteriyor. Disseke alan mavi temsil edilmektedir. A 400 mm 2 sarf değirmen biraz büyük diseksiyon alanına orta hareket diseksiyonu için tasarlanmış diseksiyonu için kullanılmıştır. Geniş diseksiyon alanı en az 100 mm 2 olarak tanımlanmaktadır. Diğer alanlarda / Diseksiyon tipleri için tasarlanmış boyutları mevcuttur. Rapor 0 mm 2 olarak açıklamalı alanı açıklanır, ancak, bu yanlıştır. Biz makineden microdissected slayt kaldırmak ve fiziksel olarak ilgi kendisinin alanında baktığımızda, biz artık doku vardır ve bu nedenle disseke olmuştur slaytta ilgili alanı görebilirsiniz. Bu yazarlar araç kiralama dikkat edilmelidir ve bu konuda diğer Instrume sabit olmuşturNTS. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
| Başpiskopos | Enfektif Devlet | Ng / ul RNA konsantrasyonu | Ng toplam RNA | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | Aktif | 48.3 | 724.5 | 1.71 | 1.59 |
| HB12 | Gizli | 61.4 | 921 | 1.7 | 1.86 |
| HP 41 | SIV ile birlikte enfeksiyon yoluyla yeniden | 22.3 | 334.5 | 1.9 | 2.18 |
Tablo 1. RNA konsantrasyonları çıkarma gönderebilir. Numune DNAsed ve RNA ekstraksiyonu Qiagen RNAeasy FFPE kiti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. RNA consantrasyondan NanoDrop kullanılarak elde edilmiştir. NSP enfektif aşamaları da tasvir edilmiştir. RNA 15 ul RNazsız su içinde elüt edilmiştir.
| Başpiskopos | Enfektif Devlet | ng / ul cDNA konsantrasyonunun | Ng Toplam cDNA | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | Aktif | 31.7 | 951 | 2.08 | 2.37 |
| HB12 | Gizli | 156.5 | 4695 | 1.94 | 4.4 |
| HP 41 | SIV ile birlikte enfeksiyon yoluyla yeniden | 41.7 | 1251 | 2.19 | 3.44 |
Tablo 2.. CDNA konsantrasyonları amplifikasyon ve arıtma sonrası. NSP enfektif aşamaları da tasvir edilmiştir. RNA Ovation RNA-Seq FFPE Sistemi (Bölüm n kullanılarak büyütülmüştüro. 7150) ve amplifiye edilen cDNA amplifikasyon sistem kullanım kılavuzu, sayfa 26 Nugen önerdiği gibi QIAGEN QIAquick PCR Saflaştırma Kiti kullanılarak saflaştırılmıştır. cDNA, 30 ul TE tamponu içinde elüt edilmiştir.
| Iyi | Muhabir | Ct | Tm değeri |
| 16S 10-1 | Standart | 12,35138 | 79.4 |
| 16S 10-2 | Standart | 16.144611 | 79.4 |
| 16S 10-3 | Standart | 17.911345 | 79.4 |
| 16S 10-4 | Standart | 21.762596 | 79.4 |
| 16S 10-5 | Standart | 25.746624 | 79.4 |
| 16S 10-6 | Standart | 28.505266 | 79.1 |
| HB12 | Bilinmeyen 25.771492 | 77.8 | |
| HP 41 | Bilinmeyen | 17.760149 | 78 |
| EB23 | Bilinmeyen | 24.754618 | 78.2 |
| Negatif Kontrol | NTC | 33.544422 | 79.7 |
Tablo 3. RT-PCR 16 yaş ile ilgili ribozomal alt birimi ile sonuçlanır. Böylece numune içinde Mtb varlığını kanıtlamak görülmektedir Uygun amplifikasyon. CDC1551 gerginlik Mtb genomik DNA, standart olarak kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mesodissection patojenlerin geniş bir dizi neden olduğu patolojik lezyon slaytlardan RNA ekstre uygulanabilir bir tekniktir. Bu kullanıcı görüntü izler ve doğru olarak görüntü hizalayan bir zorunluluktur. Bunu gerçekleştirmek için, alet görüntüleme yazılımı yönleri aşağıdaki kalibre edilmelidir. Diseksiyon disseke ilgi slayt ve alan uyum yoksa, kullanıcı tekrar kalibrasyon gerekir. Diseksiyon sürecinde bir diğer kritik adım, diseksiyon önce (5.1 Adım) kabarcıklar yoksun böyle bir şekilde sarf değirmen biraz yüklemektir. Bu kabarcıkların mevcudiyeti, diseksiyon verimini düşürür bulduk. Bu sorunu gidermek için, birden çok kez iten ve pistonu ifade öneririz. Kullanıcı üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, kabarcıklar görselleştirmek için bir uygulama tampon gıda boyası ekleyerek bu uygulama olabilir. Etkili kez, kullanıcı daha sonra normal bir diseksiyon ile devam edilmelidir. Last kritik adım ters saat doğrultusunda örnek incelemek etmektir. Ters saat yönünde makine değirmenler; Bu nedenle, bir saatin tersi şekilde bir dairesel hareketlerle joystick'i hareket daha temiz firar kenarına 6 daha öncü kesim olarak doku verimini artırdığını bulduk. Doku verimini arttırmak için başka bir diseksiyon sürecinin hızını azaltmak etmektir. Biz aynı zamanda "düşük" yüksek doku verim üretmek için sahne hızını ayarlarken en düşük hızına aspirasyon hızı ve motor hızını ayarlayarak bulduk. Bu mikrodisseksiyon yaklaşımın iki temel sınırlamalar vardır. İlk kısıtlılığı nedeniyle diseksiyon işlemi saat yönünün tersine daireler joystick sürücü ihtiyacına işaret diseksiyon çok zor bulduk olmasıdır. İkinci sınırlama enstrüman üzerinde kamera gelişmiş bir mikroskop oluşturulan bir görüntünün hücresel ayrıntı yoksun bir görüntü üretir olmasıdır.
Mtb 'Transkriptomik analizi açısından doğrudan etkileri vardır. Granülomu formasyonu TB enfeksiyonu ve akciğer 5 sınırlı bir bölge içinde patojen içeren konağın girişimi sonuçlarının bir özelliğidir. Bunun aksine, Mtb. Mtb enfeksiyonun aşamasına bağlı olarak farklı streslere tabi granülomatöz lezyonlarda 7'de kalıcılığını izin vermek için gelişmiş olduğu önerilmiştir. Bu stresler arasında, ancak bazıları vb 7-13 redoks stres, düşük pH, zar hasan, hipoksi, beslenme yetersizliği, bunlarla sınırlı değildir. Bu çeşitli aşamaları boyunca, Mtb hala örtük biçimde hayatta kalmak ve hatta yeniden etkinleştirebilirsiniz. Bu, farklı genler yukarı regüle ve farklı enfeksiyon aşamalarında aşağı regüle olduğu anlamına gelir. Örneğin, Mtb 200 transkripsiyon faktörleri 4 kodlar. Buna ek olarak, farklı kemokinler arasında denge ifadesi, suc gösterilmiştirgranülom içindeki α ve β kemokinlerin gibi h önemli koruma belirteçleri 8 olabilir. Granülomatöz dokuda mikobakteri transkriptomik değerlendirilmesi enfeksiyon her durumda ifade edilir onların oluşumunda rol mekanizmaları ve bakım yanı sıra bu genlerin anlayışımızı daha muhtemeldir. Bu bize aktif latent ve yeniden hastalık gibi granülom kendi içinde çeşitli bölgelerde olmak üzere çeşitli TB enfeksiyon aşamalarında mikobakteriyel transkriptomik değerlendirmek sağlayacak. Bize ayrıca mikobakteriyel transkriptomik değerlendirmek sağlayan ek olarak, yukarıdaki prosedür, aynı zamanda, aynı ülkelerde enfeksiyon konakçı transkriptomik değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca bu yaklaşım, daha sonra ana bilgisayar ve bakteriler arasındaki ilişkiyi, karşılaştırın kontrast ve analiz etmek için kullanılabilir.
TB araştırma önemli bir araç da, yukarıda sözü edilen protokol ve diğer patojenlerin uygulanabilir. YukarıdakiProtokol enfekte akciğer örnekleri FFPE slaytlar kullanır, ancak aynı zamanda diğer organları lezyonlar uygulanabilir. Biz RNA ayıklamak için sistemin nasıl kullanılacağını göstermek, ama teorik olarak eşit derecede etkili ve zaman hassas bir şekilde DNA ve protein çıkarılması için kullanılabilir. FFPE blokları çoğu laboratuvar histoloji bölümlerinde mevcuttur; Bu nedenle, burada açıklanan tekniği katlanarak bu şu anda kullanılmayan örneklerden elde bilgiyi artırma olasılığı vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarları olduğunu ifşa.
Acknowledgments
R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, ve P51OD011104: Yazarlar bu araştırmanın destek için aşağıdaki NIH ödül / subawards kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).
- Esposito, G. Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens. Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).
- Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).
- Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains. J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).
- Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us. Science. 328 (5980), 852-856 (2010).
- Mesodissection of fibrous tissue. AvanSciBio. , (2013).
- Paige, C., Bishai, W. R. Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view. Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).
- Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).
- Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH. Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).
- Mehra, S., Kaushal, D. Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH. J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).
- Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection. PLoS Pathog. 8 (6), (2012).
- Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth. J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).
- Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3 (1), (2008).
Tags
İmmünoloji Sayı 88 Mikrodisseksiyon mesodissection formalin sabit parafin,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 07/01/2014.
Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
