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Summary
Microdissezione è stato ampiamente impiegato per l'esame di DNA, RNA e proteine nel tessuto. Microscopia laser capture (LCM) è il metodo più comunemente usato, ma una nuova tecnica di fresatura, mesodissection, è da poco disponibile. Dimostriamo estrazione di RNA da mesodissected in formalina paraffina fissati diapositive tessuti integrati di Mycobacterium tuberculosis granulomi.
Abstract
Microdissezione è stato utilizzato per l'esame dei tessuti a DNA, RNA e proteina livelli per oltre un decennio. Microscopia laser capture (LCM) è la tecnica di microdissezione più comune usato oggi. In questa tecnica, un laser viene utilizzato per fondere focally una membrana termoplastica che sovrasta una sezione di tessuto disidratato 1. La sezione di tessuto composito viene poi sollevato e separato dalla membrana. Sebbene questa tecnica può essere utilizzata con successo per l'esame dei tessuti, è lunga e costosa. Inoltre, il completamento delle procedure utilizzando questa tecnica richiede l'uso di un laser, limitando così il suo utilizzo. Un nuovo approccio microdissezione più conveniente e pratico chiamato mesodissection è una possibile soluzione per le insidie di LCM. Questa tecnica impiega il sistema MESO-1/MeSectr al mulino tessuto desiderato da un campione di tessuto scorrevole montato mentre contemporaneamente dispensando ed aspirando fluido per recuperare il campione di tessuto desiderato nellaun po 'mulino di consumo. Prima che inizi il processo di dissezione, l'utente allinea formalina paraffina fisso incorporato (FFPE) scorrere con un ematossilina e eosina macchiato (H & E) di riferimento diapositiva. Successivamente, l'operatore annota la zona dissezione desiderato e procede a sezionare il segmento appropriato. Il programma genera un'immagine archiviata della dissezione. Il vantaggio principale di mesodissection è la breve durata necessaria per sezionare una diapositiva, stabilendo una media di dieci minuti dal impostato per campionare generazione in questo esperimento. Inoltre, il sistema è molto più conveniente e facile da usare. Un leggero svantaggio è che non è preciso come microscopia laser capture. In questo articolo mostriamo come mesodissection può essere utilizzato per estrarre RNA da diapositive da granulomi FFPE causate da Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
I campioni sono stati tradizionalmente microdissezione manualmente sia da tutto il tessuto o diapositive utilizzando un ago e bisturi. Ciò richiede una netta separazione tra la sezione di tessuto di interesse e dei tessuti circostanti le sezioni 2. Con i progressi attuali nella tecnologia profiling molecolare, vi è stata una crescente necessità di valutare il tessuto a livello cellulare. A causa delle limitazioni di microdissezione manuale, sono stati stabiliti tecniche tra cui LCM per consentire una maggiore precisione di isolamento. Questa tecnica consente al ricercatore di isolare specifiche popolazioni cellulari da vari tipi di cellule e diapositive, che possono poi essere utilizzati per saggi valle come espressione genica. Sebbene molto efficace per saggi a valle, LCM non è senza limitazioni. Primo, LCM è un processo costoso e richiede tempo. Inoltre, a causa della natura instabile di RNA, è spesso difficile da ottenere RNA di alta qualità da campioni LCM 2. A causa della disadvantages di LCM, nuovi progressi nella tecnologia microdissezione sono ancora necessari per renderlo più accessibile a un maggior numero di ricercatori in maniera sensibile conveniente e tempo.
Un tale progresso della tecnologia microdissezione ora disponibile è una tecnica nota come mesodissection. In questa tecnica una macchina viene utilizzata per la lavorazione della sezione di tessuto annotato di interesse e aspirati in un po mulino consumabile 3. Quindi, questo esempio può essere aspirato in un tubo di raccolta e utilizzata per applicazioni a valle. I vantaggi di questo sistema sono che è molto meno costoso e delicato momento. Nella nostra esperienza, il sistema consente la dissezione di una sezione di tessuto polmonare granuloma in dieci minuti. D'altra parte, LCM tradizionale sarebbe probabilmente richiederà ore per completare il processo. Il sistema permette all'operatore di caricare una diapositiva di riferimento da utilizzare come confronto così come strumento per l'annotazione. Inoltre, viene generato un report che illustra the area del vetrino che è stato sezionato. Ci sono due svantaggi principali mesodissection. Sebbene efficace a estrarre più celle, è impegnativo per isolare una singola cella. Inoltre, la precisione dell'immagine generata non è chiaro come se si utilizzano altri microscopi di imaging.
La tubercolosi (TB) è una importante malattia mortale contagiosa dell'umanità in tutto il mondo e risultati da infezione da Mtb. In una maggioranza di individui esposti ad aerosol di Mtb, l'infezione è latente limitato. In almeno 10 milioni di persone ogni anno, si traduce in malattia tubercolare attiva 4. Durante l'infezione latente, Mtb è contenuto all'interno lesioni polmonari patologiche conosciuti come granulomi. Quindi si è sostenuto che l'esito dell'infezione Mtb viene deciso a livello del granuloma 5.
Qui mostriamo come mesodissection può essere utilizzato per microdissect granulomi causati da Mtb. Le slide utilizzatesono da FFPE tessuto polmonare di macachi Rhesus infetti. Ai fini di questa dimostrazione, saremo sezionare granulomi nella loro interezza. Abbiamo inoltre dimostrato che l'RNA può essere estratto dal tessuto recuperato. Questa tecnica può essere applicata a campioni di tessuto da vari altri campioni e poi utilizzato per una varietà di saggi a valle.
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Protocol
1. Calibrate strumento Mesodissection con 2id software di imaging
Il software di imaging 2id verrà indicato come sia il software o il programma per il resto di questo articolo. Questo passo è necessario per monitorare correttamente l'immagine così come allineare più diapositiva frame.
- Accendere strumento e computer.
- Il software Open e selezionare "strumento di calibrazione".
- Calibrare viaggio stage utilizzando il joystick. Spostare palco per la posizione in alto a sinistra. Premere il tasto "set" in fase 1 in programma.
- Spostare fase di abbassare giusta posizione. Premere il tasto "set" sotto il punto 2 in programma.
- Calibrare aspirazione premendo prima "Z-button" per sollevare assemblea testa. Premere il tasto "pulse aspirare" e il pulsante "dissezione" sul joystick finché asta di comando del pistone raggiunge prima posizione. Premere il tasto "set" sotto il punto 3 del programma.
- Premere il tasto "Reset aspirato &# 8221; pulsante. Una volta che il pistone si ferma alla posizione di premere il tasto "set" in basso al punto 4.
- Fare clic sulla scheda "scala".
- Mettere righello calibrazione lato bianco.
- Concentrarsi microscopio, se necessario.
- Disegnare una linea tra le due barre di scala utilizzando il mouse.
- Immettere la distanza in scatola pulsante punto 2. Premere il tasto "Calcola" etichettati.
- Fare clic sulla linguetta "mirino". Girare la velocità del motore a 1.
- Inserire xScisor nel gruppo della testa. Assemblaggio testata inferiore in asse z posizione pronta premendo il tasto "z". NOTA: Il gruppo di testa è la grande struttura sulla sommità dello strumento di dissezione. Il xScisor verrà indicato come un po mulino di consumo per il resto di questo articolo.
- Fare clic su "dissezione impegnarsi" sul joystick. NOTA: Questo pulsante si trova sulla parte superiore del joystick.
- Definire centro di rotazione visivamente. Per fare questo, spostare il centro di mirino sul centro di rotazione usando definireparametro d al punto 1 del programma. Utilizzare il su e giù nella "x" e "y bar-asse" per regolare i pixel per allineare mirino. Fare clic sulla scheda "done".
- Fare clic sull'icona "casa". NOTA: Questo è rappresentato da un'immagine casa situata in alto a destra.
2. Creare Immagine di riferimento
- Posizionare H & E vetrino sul palco. Mettere copertura opaca sulla parte superiore della diapositiva. Guidare lo strumento muovendo il joystick per l'area desiderata della diapositiva H & E. Salvare l'immagine generata. NOTA: Sia la scheda "cattura di riferimento" o scheda "sezionare" possono essere utilizzati per completare questo passaggio.
3. Allineare tessuto per dissezione
- Fare clic sull'opzione "sezionare il tessuto" sullo schermo di casa.
- Compilare l '"operatore", "numero dissezione di adesione", "numero di accesso di riferimento", "xScisor codice a barre", & #8220; dissezione numero di lotto fluido "," dimensione xScisor "e" descrizione "nella scheda" setup ".
- Fare clic sulla scheda "trovare tessuti".
- Importazione di immagini di riferimento precedentemente salvata.
- Inserire un FFPE scivolo senza macchia di 5 micron di spessore sul palco. Spostare palco per la stessa area come quello raffigurato nell'immagine di riferimento. Clicca sulla scheda "Inserisci immagine".
- Fare clic sulla linguetta "align". Utilizzare il mouse e le frecce associati per allineare l'immagine di riferimento all'immagine senza macchia.
4. Annota diapositiva
- Fare clic sulla scheda "annotate".
- Usate il mouse per disegnare un cerchio attorno all'area desiderata della diapositiva che sarà in paraffina.
5. Caricare consumabili Mill Bit
- Riempire consumabile bit mulino con tampone desiderato, qui tampone PKD, tirando lo stantuffo su e giù in un movimento fluido più volte. Assicurati di escludere l'ariabolle.
- Sollevare asse Z premendo il tasto "Z".
- Caricare consumo bit mulino in macchina. Fate questo facendo scorrere la punta mulino consumabile nella parte superiore della macchina in modo che la linea bianca sulle linee strumento con la linea nera sul bit mulino consumabile. Premere il tasto "Reset aspirazione" per consentire stantuffo per essere abbassata nella posizione corretta. NOTA: Dovrebbe essere facile scivolare la punta mulino di consumo. Se non lo è, assicurarsi che le tacche siano allineate correttamente.
- Bassa asse Z premendo nuovamente il tasto "Z".
6. Dissect Tissue (Figura 4)
- Apri scheda "sezionare".
- Girare velocità del motore e aspirazione a 1.
- Casella "spettacolo di monitoraggio". Nota: Questo consente all'utente di visualizzare l'area sezionato durante il processo di dissezione.
- Una volta pronti a sezionare, continuare a tenere premuto il tasto "impegnarsi", così come "aspirato & #8221; pulsante mentre si muove joystick in senso antiorario per sezionare il tessuto.
- Continua a sezionare in senso antiorario finché l'aspirato è scheda "pieno" diventa rossa.
7. Svuotare e rimuovere consumabili Mill Bit
- Mettere una provetta per microcentrifuga 0,5 ml sotto la punta della punta mulino di consumo.
- Pressetta controllo "aspirazione" rapidamente per espellere campione in provetta per microcentrifuga.
- Premere con maggiore forza per espellere usati consumo bit mulino.
- Risciacquare frammento di tessuto tirando indietro lo stantuffo. Spingere lo stantuffo in avanti per esprimere campione rimanente in consumo bit mulino. Il frammento di tessuto sarà ora contenuto all'interno della provetta per microcentrifuga.
8. Lyse campione con proteinasi K digestione da un trattamento termico
- Aggiungere 70 microlitri TE pH 8,5 contenente 5 mg di proteinasi K per recuperare campione di tessuto.
- Collocare il campione in programmabile riscaldamento-shaker.
- Digestione completa utilizzando programmabile riscaldamento-shaker al seguente impostazione: 60 ˚ C per 30 min a 1.500 giri; 82 ˚ C per 15 min a 1.500 giri; e 25 ˚ C per 1 min a 450 rpm. Il campione è ora pronto per applicazioni a valle.
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Representative Results
Il protocollo di cui sopra mostra come utilizzare una nuova tecnica mesodissection per estrarre l'RNA da diapositive tessuto FFPE. L'efficacia di questo protocollo è mostrato tramite diapositive FFPE di granulomi polmonari da NHP infettati con Mtb in vari stadi infettivi. Figure 1-3 sono immagini dello strumento. Figura 4 mostra come avviene il processo di dissezione e l'immagine risultante generato dal software. Tabella 1 mostra i risultati di estrazione dell'RNA con un granuloma da un NHP ad ogni stato infettivo. RNA è stato amplificato e purificato per consentire RT-PCR evidenza di 16s (Tabelle 2-4). Tabella 4 conferma la presenza di Mtb subunità ribosomiale 16S, e quindi Mtb, nei campioni microdissezione.
Figura 1. Immagine di strumento mesodissection compreso joystick. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Vista ravvicinata strumento mesodissection. Il tasto "z", velocità "motore" e "aspirazione" manopole di velocità sono indicati sul lato sinistro dell'immagine. Il "pulsante di reset aspiratore" e il pulsante "on / off" vengono visualizzati sul lato destro dell'immagine. La fase di scorrimento è in cima dello strumento. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Vista ravvicinata del joystick. Il joystick, "pulse aspirare" e pulsanti "velocità stadio" riportate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Relazione del tutto granuloma mesodissected da NHP EB23. Animali utilizzati in questo studio sono stati infettati con CDC1551 MTb via aerosol. L'immagine di riferimento a sinistra mostra un granuloma H & E macchiato da un macaco rhesus infettati attivamente. L'area desiderata di interesse da sezionato è delineato nel verde. L'immagine nella sho mezzows il corrispondente FFPE slitta senza macchia su 5 micron di spessore prima della dissezione. Le aree sono state allineate con il software e l'area correlazione di interesse è delineata al verde. L'immagine a destra rappresenta lo stesso senza macchia FFPE diapositiva dopo la dissezione. L'area sezionato è rappresentata in blu. A 400 mm 2 consumabile po 'mulino è stato utilizzato per la dissezione, che è stato progettato per la dissezione traversata di medio-grande area dissezione. Grande area dissezione è descritta come inferiore a 100 mm 2. Misure progettati per i tipi di altri settori / dissezione sono disponibili. Anche se la relazione descrive l'area annotato come 0 mm 2, questo è imprecisa. Quando rimuoviamo la diapositiva microdissezione dalla macchina e guardiamo fisicamente presso l'area di interesse in sé, possiamo vedere l'area corrispondente sul vetrino che non ha più il tessuto e quindi è stato sezionato. Va notato che gli autori sono di affittare lo strumento e questo problema è stato risolto su altri instrumenti. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Primate | Infettiva Stato | Concentrazione di RNA in ng / ml | RNA totale in ng | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | Attivo | 48.3 | 724,5 | 1.71 | 1.59 |
| HB12 | Latente | 61.4 | 921 | 1.7 | 1.86 |
| HP41 | Riattivato tramite l'infezione collaborazione con SIV | 22.3 | 334,5 | 1.9 | 2.18 |
Le concentrazioni di RNA Tabella 1. Inserisci estrazione. Il campione è stato DNAsed e estrazione di RNA è stata eseguita utilizzando il kit Qiagen RNAeasy FFPE. RNA concentrazione è stato ottenuto utilizzando un NanoDrop. Stadi infettivi NHP sono anche raffigurati. RNA è stato eluito in 15 microlitri RNasi acqua libera.
| Primate | Infettiva Stato | concentrazione cDNA in ng / ml | CDNA totale in ng | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | Attivo | 31.7 | 951 | 2.08 | 2.37 |
| HB12 | Latente | 156.5 | 4695 | 1.94 | 4.4 |
| HP41 | Riattivato tramite l'infezione collaborazione con SIV | 41.7 | 1251 | 2.19 | 3.44 |
Tabella 2. Concentrazioni di cDNA inserisci amplificazione e purificazione. Stadi infettivi NHP sono anche rappresentati. RNA è stato amplificato utilizzando RNA-Seq Ovation FFPE System (Part no. 7150) e risultante cDNA amplificato è stato purificato utilizzando il kit di purificazione QIAGEN QIAquick PCR come suggerito da Nugen a pagina 26 della guida per l'uso del sistema di amplificazione. cDNA è stato eluito in 30 microlitri tampone TE.
| Bene | Reporter | Ct | Valore di Tm |
| 16S 10-1 | Standard | 12,35138 | 79.4 |
| 16S 10-2 | Standard | 16.144611 | 79.4 |
| 16S 10-3 | Standard | 17.911345 | 79.4 |
| 16S 10-4 | Standard | 21.762596 | 79.4 |
| 16S 10-5 | Standard | 25.746624 | 79.4 |
| 16S 10-6 | Standard | 28.505266 | 79.1 |
| HB12 | Sconosciuto 25.771492 | 77.8 | |
| HP41 | Sconosciuto | 17.760149 | 78 |
| EB23 | Sconosciuto | 24.754618 | 78.2 |
| Controllo Negativo | NTC | 33.544422 | 79.7 |
Tabella 3. RT-PCR risultati rispetto agli subunità ribosomiale 16S. Amplificazione appropriata osservato dimostrando così la presenza di Mtb all'interno di campioni. DNA genomico da CDC1551 ceppo Mtb è stato utilizzato come standard.
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Discussion
Mesodissection è una tecnica che può essere applicata per l'estrazione di RNA da diapositive lesioni patologiche causate da una vasta gamma di agenti patogeni. È una necessità che l'utente ascolti l'immagine e allinea correttamente l'immagine. Per fare questo, lo strumento deve essere calibrato seguendo le indicazioni sul software di imaging. Quando dissezione, se la slitta e la zona di interesse essere sezionato non si allineano, l'utente deve ricalibrare lo strumento. Un altro punto critico nel processo di dissezione è caricare il bit mulino consumabile in modo tale che sia privo di bolle prima dissezione (punto 5.1). Abbiamo trovato che la presenza di bolle diminuisce la resa dissezione. Per correggere questo problema, si consiglia di propulsione e di esprimere il pistone più volte. L'utente può praticare questo aggiungendo colorante alimentare per un buffer pratica per visualizzarne bolle, come raccomandato dal produttore. Una volta effettivo, l'utente dovrebbe quindi procedere con dissezione normale. Il lav passo fondamentale è quello di sezionare il campione in senso antiorario. I mulini macchina in senso antiorario; Pertanto, abbiamo trovato che spostando il joystick in un movimento circolare in modo antiorario aumenta resa tessuto come i principali tagli bordo più pulito di bordo d'uscita 6. Un altro modo per migliorare il rendimento del tessuto è quello di diminuire la velocità del processo di dissezione. Abbiamo trovato che l'impostazione della velocità di aspirazione e velocità del motore alla velocità più bassa e contemporaneamente l'impostazione della velocità di fase "bassa" produrre la massima resa tessuto. Ci sono due limiti principali di questo approccio microdissezione. La prima limitazione è che abbiamo trovato punto dissezione molto difficile a causa della necessità di guidare il joystick nei circoli antiorario nel processo di dissezione. La seconda limitazione è che la fotocamera sullo strumento genera un'immagine che manca il dettaglio cellulare di un'immagine generata da un microscopio avanzato.
Mtb. formazione di granuloma è un marchio di garanzia di infezione da TBC e risultati dal tentativo del padrone di casa per contenere il patogeno all'interno di una regione limitata del polmone 5. Al contrario, è stato proposto che Mtb è evoluto per consentire la sua persistenza nel lesioni granulomatose 7. Mtb è sottoposto a sollecitazioni diverse a seconda della fase di infezione. Alcune di queste sollecitazioni includono ma non sono limitati a stress redox, pH basso, danno alla membrana, ipossia, mancanza di nutrizione, etc 7-13. Durante queste fasi, Mtb può ancora sopravvivere in una forma latente e persino riattivare. Questo significa che diversi geni sono upregulated e inibiti a diversi stadi infettivi. Ad esempio, Mtb codifica per oltre 200 fattori di trascrizione 4. Inoltre, è stato dimostrato che l'espressione equilibrio tra diverse chemochine, such come α e β chemochine, all'interno del granuloma può essere marcatori di protezione importanti 8. Valutazione della trascrittomica micobatteri nel tessuto granulomatoso è probabile che per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nella loro formazione e la manutenzione, nonché quei geni che sono espressi in ogni stato dell'infezione. Questo ci permetterà di valutare trascrittomica micobatteri in vari stadi infettivi di tubercolosi tra cui la malattia attiva, latente e riattivato così come le varie regioni all'interno del granuloma stesso. Oltre a consentire di valutare ulteriormente trascrittomica micobatteri, la procedura sopra descritta consente anche per la valutazione della trascrittomica ospitanti negli stessi stati infettivi. Inoltre, questo approccio può quindi essere utilizzato per confrontare, contrasto, e analizzare il rapporto tra ospite e batteri.
Anche se uno strumento importante nella ricerca TB, citato protocollo può essere applicato ad altri patogeni pure. Quanto sopraprotocollo utilizza vetrini FFPE da campioni polmonari infette, ma può anche essere applicato su lesioni di altri organi. Dimostriamo come utilizzare il sistema per estrarre l'RNA, ma può teoricamente essere utilizzato per l'estrazione del DNA e delle proteine in maniera sensibile ugualmente efficace e di tempo. Blocchi FFPE sono disponibili nella maggior parte dei reparti istologici di laboratorio; Pertanto, la tecnica qui descritta ha la possibilità di aumentare esponenzialmente le conoscenze acquisite da questi campioni attualmente inutilizzati.
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Disclosures
Gli autori rivelano che non ci sono interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere i seguenti premi NIH / subawards per il sostegno di questa ricerca: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, e P51OD011104.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
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Tags
Immunologia Numero 88 Microdissection mesodissection fissato in formalina paraffina,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 07/01/2014.
Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
