Summary
Afin de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent néo-tissu formation et le développement de la sténose dans les valves cardiaques de l'ingénierie tissulaire, un modèle murin de coeur hétérotopique vanne transplantation a été développé. Une valvule cardiaque pulmonaire a été transplanté au destinataire en utilisant la technique de transplantation cardiaque hétérotopique.
Abstract
valves cardiaques de l'ingénierie tissulaire, en particulier soupapes décellularisée, commencent à prendre de l'ampleur dans l'utilisation clinique de chirurgie reconstructive avec des résultats mitigés. Toutefois, les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement du néo-tissu, vanne épaississement et le développement de la sténose sont pas étudiés en profondeur. Pour répondre à ces questions, nous avons développé une vanne modèle hétérotopique murin de transplantation cardiaque. Valve cardiaque a été récolté à partir d'une souris donneuse de soupape et transplanté d'une souris donneuse cardiaque. Le cœur d'une nouvelle vanne a été transplanté hétérotopique à une souris receveuse. La transplantation cardiaque a montré son propre battement de coeur, indépendant de rythme cardiaque du destinataire. Le débit sanguin a été quantifiée en utilisant un système à ultrasons à haute fréquence avec un Doppler de l'onde pulsée. Le débit à travers la valve pulmonaire a montré implanté avant écoulement avec régurgitation minime et le débit de pointe est proche de 100 mm / sec. Ce modèle murin de transplantation de valvule cardiaque est highly polyvalent, de sorte qu'il peut être modifié et adapté pour fournir différents environnements hémodynamiques et / ou peut être utilisé avec divers souris transgéniques pour étudier le développement néo-tissu dans une valve cardiaque de l'ingénierie tissulaire.
Introduction
Anomalies cardiovasculaires congénitales sont l'une des principales causes de mortalité infantile dans le monde 1,2 occidentale. Parmi eux, sténose de la valve pulmonaire et prémolaires défauts de la valve aortique est une forme fréquente 3. chirurgie de remplacement valvulaire cardiaque est un choix systématique des chirurgies de reconstruction; Cependant, les complications, y compris une sténose et la calcification de la valve cardiaque, et la dépendance permanente sur les anticoagulants sont une source importante de problèmes de santé chroniques et de décès 4-7. En outre, l'absence de potentiel de croissance nécessite opérations de révision, ce qui augmente encore le taux de mortalité de ces jeunes patients 4,8,9.
Dans une tentative pour développer une valvule cardiaque de remplacement fonctionnelle avec un potentiel de croissance, des cellules autologues Shinoka et al. Ensemencées sur une biodégradable synthétique valvule cardiaque 8. La vanne de synthèse transformé à une valve cardiaque native comme la structure avec potentiomètre de croissanceal. Grandes études animales préliminaires ont démontré la faisabilité de l'utilisation de cette méthode pour créer une valve cardiaque fonctionnelle 10. Cependant, des études d'implantation à long terme ont démontré une faible durabilité due à l'épaississement progressif de la néo-tissu de soupape entraîne un rétrécissement de la valve cardiaque. Travailler à partir de Sodian et al. Ont utilisé la méthodologie Shinoka, mais finalement remplacé la matrice PGA avec un élastomère biodégradable, ce qui a donné les propriétés biomécaniques de la vanne de l'ingénierie tissulaire construire un profil plus physiologique 9,11,12. Dans l'étude in vivo, en dépit du succès de l'implantation, une doublure de cellules endotheliales confluentes n'a pas été formé, qui pourrait limiter le succès à long terme de cet échafaudage 12.
Afin de concevoir rationnellement une valve améliorée de coeur synthétique de deuxième génération, un modèle murin de greffe de valve cardiaque a été créé pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires underlyinformation g de néo-tissu, valve épaississement et le développement de la sténose. Les modèles murins offrent une vaste gamme de réactifs moléculaires, y compris transgéniques, qui ne sont pas facilement disponibles dans les autres espèces 7. Dans ce modèle de transplantation de valvule cardiaque, une ex vivo syngénique remplacement de valvule cardiaque pulmonaire a été effectuée en premier lieu; et ensuite le coeur avec la valvule cardiaque hétérotopique implanté a été implanté dans un hôte syngénique en utilisant une technique de microchirurgie. Ce modèle permet de remplacement de valve cardiaque sans la nécessité d'une circulation extracorporelle.
Dans ce papier, une explication détaillée de la récolte des valves cardiaques, préparations de coeur de donneur, la greffe de valve cardiaque, et une transplantation cardiaque hétérotopique est décrite. Les résultats ont montré un rythme cardiaque continue à partir du cœur du donneur, qui est indépendante de la pulsation de destinataire. Le flux sanguin à travers la valve pulmonaire implanté a été mesurée en utilisant un système à ultrasons à haute fréquence avec une onde pulsée Effectuerppler.
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Protocol
Remarque: Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel Hôpital soin et l'utilisation des animaux de la Nationwide Children.
1. Pulmonaire valve cardiaque récolte à partir d'un donneur Heart Valve souris
- Autoclave tous les outils chirurgicaux avant la chirurgie: 1x ciseaux fins, micro pince 3x, micro pinces vasculaires 2x, 1x pince forceps applicables, titulaire de la micro-aiguille 1x, ciseaux à ressort 1x, 1x enrouleur.
- Un vieux 6-8 semaines femelle C57BL / 6 de souris est utilisé comme un donneur de valve pulmonaire du coeur. Débranchez la souris de sa cage et le peser, alors euthanasier avec un cocktail de kétamine / xylazine (kétamine, 200 mg / kg et de xylazine, 20 mg / kg, IP) surdosage.
- Clip de la région de la poitrine et placer la souris dans une position de décubitus dorsal sur un tapis. Ensuite, faire la thoracotomie. Exposer le coeur, faire une petite coupure sur l'oreillette droite et le ventricule gauche perfuser avec de la glace une solution saline froide.
- Carrément disséquer l'artère pulmonaire (AP) de l'ascendant d'unorta. Découper la valvule pulmonaire (PV) ainsi que 2 mm brassard de l'artère pulmonaire. Éliminer le reste du cœur.
- Rangez le PV dans l'héparine froid et une solution saline (100 unités / ml). Remarque: Le PV peut être maintenu dans la solution pendant deux heures avant la transplantation au cœur d'un donneur.
2. Préparation de coeur des donateurs
- Un vieux 6-8 semaines femelle C57BL / 6 de souris est utilisé comme donneur de coeur. Débranchez la souris de sa cage et le peser, alors euthanasier avec un cocktail de kétamine / xylazine (kétamine, 200 mg / kg et de xylazine, 20 mg / kg, IP) surdosage. Il s'agit d'une procédure de terminal.
- Clip de la région de la poitrine et placer la souris dans une position de décubitus dorsal sur un tapis. Ensuite, faire la thoracotomie. Carrément séparer le coeur, la veine cave inférieure (VCI), la veine cave supérieure (VCS), l'aorte ascendante, PA, et la veine pulmonaire. Perfuser l'IVC, avec le froid de la glace une solution saline stérile.
- Ligaturer la veine cave inférieure, SVC, et la veine pulmonaire avec 6-0 suture de soie puis couper supérieure à laligatures.
- Coupez l'aorte et PA 2 mm brassard.
- Découpez le PV et de s'en débarrasser.
3. Valve cardiaque transplantation sur un cœur de donneur
- Immédiatement après l'étape 2.5, placez la valve cardiaque à partir de l'étape 1.5 dans le cœur d'un donneur et d'orienter la valve cardiaque.
- Fixez le PV avec un point sur le côté droit de la vanne à l'aide 10-0 sutures de monofilament sur les aiguilles coniques et commencer à suturer continue avec 5-6 points de suture de l'autre côté de la PV.
- Après avoir terminé la face avant, tourner le cœur horizontalement et commencer à suturer la face arrière de la PV sur le cœur d'un donneur.
- Rangez le coeur dans une solution d'héparine / saline stérile froid. Remarque: le cœur du donneur peut être conservé dans la solution pendant deux heures avant l'implantation de la souris receveuse.
4. Hétérotopique transplantation cardiaque à un bénéficiaire de souris
- Un vieux 6-8 semaines femelle C57BL / 6 de souris a été utilisé comme un récinataire. Débranchez la souris de sa cage et peser, puis anesthésiés avec de la kétamine / xylazine cocktail (kétamine, 100 mg / kg et de xylazine 10 mg / kg). Le kétoprofène (5 mg / kg) est utilisée comme analgésique préanesthésie.
- Après avoir vérifié le niveau de sédation par la queue pincer, couper les abdominaux et les poils de la poitrine. Lubrifier les yeux avec pommade ophtalmique stérile, et placer la souris dans une position de décubitus dorsal sur un tapis. Désinfecter l'abdomen avec des tampons de bétadine et alcool. Puis couvrir la souris avec un champ stérile et d'exposer la zone d'incision seulement.
- Faire une laparotomie médiane incision du dessous de la xiphoïde à la région sus-pubienne, et insérer un écarteur auto de retenue. Envelopper les intestins dans une solution saline humidifié gaze. Définir carrément l'aorte et la veine cave.
- Placer deux sutures en soie 6-0 proximale et distale autour de l'aorte et IVC pour retenir la circulation sanguine.
- Placez le cœur du donneur sur le côté droit de l'aorte abdominale et le couvrir avec gau stérileze. Hydrater avec une solution saline.
- Faire une aortotomie dans l'aorte abdominale à l'aide d'une aiguille 30 G et étendre l'ouverture avec des ciseaux à la taille de l'aorte du donneur.
- Effectuer un bout à côté anastomose utilisant stériles sutures 10-0 monofilament les aiguilles coniques. Fixer l'aorte du donneur avec une maille sur l'extrémité proximale de l'ouverture dans l'aorte abdominale et de commencer à suturer de façon continue avec 4-5 points de suture depuis l'extrémité distale de l'aorte abdominale.
- Retournez le coeur sur le côté gauche, le couvrir avec une solution saline infusé gaze, et commencer à suturer en continu avec 4-5 points de suture de l'extrémité distale de l'aorte abdominale.
- Faire un veinotomie dans la veine cave inférieure en utilisant une aiguille 30 G et étendre l'ouverture à la taille de l'artère pulmonaire du donneur.
- Effectuer une fin anastomose utilisant stériles sutures 10-0 monofilament les aiguilles coniques. Fixez le donneur PA avec un point sur l'extrémité proximale de l'ouverture de la VCI et commencer à suturer en continu avec 4-5 points de suture del'extrémité distale de la veine cave inférieure. Cette fois-ci, parce que l'aorte est dans la manière, assurez-vous que la suture de la paroi gauche de PA du donneur est à l'intérieur de la VCI.
- Rincer la lumière IVC avec de l'héparine et une solution saline (100 unités / ml). Fermez la paroi droite du donneur et du receveur PA IVC en les suturant en continu à l'extrémité distale.
- Retirez la ligature distale et contrôler l'hémorragie en appliquant un agent hémostatique résorbable stérile d'actualité. Lorsque l'hémorragie s'arrête complètement, retirez la suture proximale et contrôler l'hémorragie de la même façon.
- Remettre les intestins et fermer la musculature abdominale et la peau en deux couches à l'aide d'un monofil 6-0 polyamide noir.
- Injecter 0,5 ml de solution saline sous-cutanée et placer la souris dans une cage de récupération sur un coussin chauffant jusqu'à ce que la souris est entièrement mobile. Lors de la récupération, le retour de la souris dans une nouvelle cage avec une literie de papier. Donner des médicaments de la douleur (ibuprofène, 30 mg / kg, eau potable) pendant 48 heures. Fairepas retourner un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce que complètement rétabli.
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Representative Results
La figure 1 illustre le schéma du modèle de transplantation de valvule cardiaque en utilisant une transplantation cardiaque hétérotopique. La valve cardiaque a été récolté à partir d'un cœur de donneur et implanté sur un coeur d'un deuxième souris donneuse. Ensuite, le coeur de la nouvelle valve cardiaque a été implanté dans l'abdomen d'une souris receveuse. Figure 2 montre une illustration du coeur implanté dans l'espace abdominal (A), immédiatement après la transplantation cardiaque (B), et 5 min après la transplantation. Lors du retrait des sutures des deux côtés de l'aorte et IVC, le cœur commence à battre 1-2 minutes plus tard et devient plus rose avec plus de circulation sanguine. Notez que l'oreillette droite est plus dilatée dans (C) à (B). Le coeur bat plus fort progressivement et est stable après 24 h.
Le flux sanguin à travers la valve pulmonaire a été mesurée implantée par voie percutanée 10 jours après l'implantation à l'aideun système à ultrasons à haute fréquence avec le mode Doppler pulsé d'onde (Figure 3). Les lieux de l'aorte, le ventricule droit (VD), a implanté la valve pulmonaire (PV), et l'artère pulmonaire (AP) en mode B a été montré dans la figure 3 (A). L'échantillon de volume jaune superposition est située sur la PV implanté. Figure 3 (b) montre un diagramme de l'anatomie et de la localisation de la couche de volume de l'échantillon. Comme le montre la figure 3 (C), l'onde QRS du coeur du donneur a été détectée en cadence et indépendante de l'onde de coeur de destinataire. Le systolique mesurée et le volume diastolique au PV implanté correspondaient à la vague de coeur de donneur. La vitesse de pointe est d'environ 100 mm / sec.
Figure 1.60: schéma de la valvule cardiaque transplantation Une valve cardiaque pulmonaire a été récolté à partir d'une première souris donneuse et implanté dans un coeur d'un deuxième souris donneuse.. Ensuite, le coeur de la nouvelle valve a été implantée hétérotopique dans une souris receveuse.
Figure 2. L'greffe du coeur. A) Un diagramme d'un coeur avec nouvelle valve cardiaque implanté à l'espace abdominale (B) juste après l'implantation, et (C) 5 min après l'implantation.
Mesure la figure 3. D'écoulement de sang dans implanted valve pulmonaire. A) image en mode B indiquant les emplacements de l'aorte, le ventricule droit (VD), la valve pulmonaire implanté (PV) et l'artère pulmonaire (AP). B) Un schéma de l'anatomie et de l'emplacement de la couche de volume de l'échantillon. C) Mesure de la vitesse au PV implanté avec la vague ECG.
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Discussion
Le taux de cette procédure de mortalité est proche de 20%, qui a été principalement causée par une hémorragie au niveau du site de transplantation de PV et anastomose sur l'aorte de donneur au receveur aorte abdominale. Dans la plupart des cas, le taux de mortalité diminue de façon significative 48 h chirurgie de poste. Les souris de survie ont montré des battements cardiaques et des flux de sang dans le PV implanté. L'ensemble du processus prend quatre heures pour un micro chirurgien expérimenté. Il faudra environ 250 souris pour maîtriser la technique. La transplantation cardiaque hétérotopique est relativement simple par rapport à l'implantation de PV au cœur d'un donneur. Une des étapes les plus importantes pour une transplantation réussie HV est la récolte de la structure de PV d'une souris donneuse. La structure de PV doit être sectionné d'environ 1-2 mm en dessous de la vanne. Si le tissu restant est trop court, anastomose sera difficile. Si le tissu en dessous de la PV est trop longue (ie. L'AP sera trop long par rapport à l'ascensionment aorte après l'implantation), le PA implanté peut tordre ou coude. Une autre étape essentielle est l'anastomose entre l'AP et le destinataire implanté IVC. Depuis l'IVC est très mince, il est extrêmement facile à déchirer pendant la suture.
Dans ce modèle, le sang de l'aorte vient à travers l'aorte, s'écoule à travers les artères coronaires, puis sort à travers le sinus coronaire pour la RA donneur. Ainsi, le volume de sang de passer à travers la PV est implanté à 5% du volume total de sang dans l'estimation, qui est la limitation la plus importante de ce modèle pour l'étude TEHV. Pour augmenter le débit de sang si le PV, trois modèles supplémentaires ont été créés. Tout d'abord, un troisième anastomose a été créé à partir de la RV de donneur au receveur IVC. La troisième anastomose peut augmenter le débit sanguin de 10% à 50% du volume sanguin total. D'autre part, pour augmenter encore le débit de sang, après avoir passé le troisième anastomose, la veine cave inférieure a été ligaturé en amont de la troisième anastomose. Cette méthode assuré à 50% du flux sanguin à travers lePV implanté. Troisièmement, afin d'augmenter l'écoulement à travers le PV implanté et de maintenir la circulation plus physiologique, le coeur a été transplanté avec les poumons. Cette méthode pourrait augmenter le débit jusqu'à 50% du débit sanguin total et, plus important, le ventricule gauche et l'oreillette gauche maintenir leur circulation. Ces différents modèles de flux physiologiques nous permettent d'étudier comment la différence dans les conditions d'écoulement physiologiques affectent le développement de néo-tissu et une sténose dans une vanne de greffe du coeur.
Récemment, nous avons mené une étude pilote pour la greffe décellularisé HV sans ensemencement des cellules utilisant la technique décrite dans le présent document. Le PV implanté a montré des caractéristiques d'écoulement de sang similaire à la commande, predecellularized transplanté PV. Dans l'avenir, les différents types de cellules seront ensemencées pour étudier la formation néo-tissu et le développement de la sténose de l'HV transplanté. En outre, en utilisant des souris transgéniques, telles que la protéine fluorescente verte (GFP des souris) ou un protocole d'ententemodèle soi de maladie HV, le processus de formation néo-tissu peut être étudié de façon mécanique par l'étude de la source de cellules qui peuplent la valve cardiaque décellularisée ou malade par immunohistochimie, ce qui aidera le développement de, les valves cardiaques de l'ingénierie tissulaire deuxième génération plus rationnellement conçus. La possibilité d'utiliser différentes conditions d'écoulement physiologique, des souris transgéniques, les implantations photovoltaïques décellularisées et toutes les combinaisons possibles de trois correspond à la polyvalence et potentiellement important préclinique utilité de ce modèle de transplantation HV.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par une subvention du NIH (RO1 HL098228) de CKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine Sterile Solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Fine Scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp Applying Forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular Clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring Scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For sutureing the graft |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non Woven Sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in., Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in., Needle | BD | 305106 | |
| Warm Water Recircultor | Gaymar | TP-700 | |
| Warming Pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 High Frequency Ultrasound | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives. |
| Ultrasound transmission gel | Parker Laboratories, INC. |
01-02 | |
| Table Top Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip, INC. | 901806 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 |
References
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