Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא

Published: August 27, 2014 doi: 10.3791/51697

Introduction

קבלת DNA באיכות גבוהה עבור מחקרים גנטיים אנושיים היא חיונית בתהליך גילוי גנים למחלות. דם, אם כי דורש הליך פולשני וגם להיות יקר יותר מאשר אוסף רוק, הוא מועדף ליצירת שורות תאים הונצחו כמקור אינסופי של DNA, או iPSCs ללימודים פונקציונליים, ולפעמים DNA הדם משמש בעת שורות תאים אינן זמינות. עם זאת, קבלת דם דורשת phlebotomist מאומן ויש לו דם מחצית חיים קצרים יותר מאשר רוק 1. DNA מרוק הוא פחות יקר וקל יותר להשגה, שכן הוא יכול להיות שנאסף ונשלח באמצעות הדואר ללא הצורך בphlebotomist, ובכך להגדיל בריכות נושא הפוטנציאל הרבה מעבר לאגן ההיקוות של בתי חולים ומעבדות 2. הרשמה למחקר ניתן לשפר את האיכות יש לי נושאים האפשרות של מתן דגימת רוק במקום דם 3, 4. חששות לגבי הכמות והאיכות של DNA מרוק יכולים להיות המוגבלים הנרחבדואר למרות מחקרים שנעשה לאחרונה מחקרים רבים המראים את התאמתו של כל רוק, עם ממוצע של 4.3 x 10 5 תאים למיליליטר, לבדיקות DNA על פני שיטות מטליות buccal המבוגרות שלא לקבל כמויות משמעותיות של רוק 2, 3, 4, 5, 6. בעוד ספרות צנועה קיימת מראה את ההתאמה של DNA רוק השלם נגזר עבור יישומי גנוטיפ כולל שיטות המבוסס על microarray 8, 9, רצף 10, אין מחקרים בחנו הדור הבא (NGS). המטרה לייעול פרוטוקול חילוץ זה כל DNA הרוק הייתה למקסם את הכמות ואיכות עבור יישומי גנטיקה בדרך יעילה עלות שמיושמת בקלות במעבדות עם חומרים כימיים וחומרים נפוצים.

מיצוי DNA מרוק דורש מספר הליכים: 1) איסוף ואחסון, טיפול RNase 2) תמוגה תא, 3), 4) ממטרים חלבון, 5) משקעים אתנול, 6) להחזרת נוזלי DNA. פתרון DNA ייצוב הצפת, שתוארבעבר 2, פונקציות כראוי ללא שינוי. שום ניסיון לייעל את טיפול RNase וצעדים להחזרת נוזלי DNA נעשה. לכל שלב שנותר, מספר משתנה שיכול להשפיע על תשואה זוהו. כל אחד ממשתנים היו מניפולציות באופן אישי ושיפור בתפוקה ואיכות הוערך סטטיסטי. עבור משתנים שהוצגו כדי לשפר את התשואה ו / או איכות DNA, הערכים אופטימליים נכללו בפרוטוקול הסופי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: לפני מתן דגימות רוק כל הנושאים נתנו הסכמה מדעת התואמת את הקווים המנחים לטיפול בבני אדם בבית החולים לילדים בפריסה ארצית.

.1 רוק איסוף ואחסון

  1. לפני אוסף רוק, להבטיח כי הפה של הנושא הוא ללא מזון או חומרים זרים אחרים על ידי בעל העניין לשטוף את פיהם במים והימנעות אכילה או שתייה במשך 30 דקות לפני איסוף הדגימה.
  2. פתח צינור צנטריפוגות 15 מ"ל עם 2.5 מ"ל של חיץ ייצוב DNA 2 והקפד להימנע מלגעת בחלק הפנימי של הכובע או צינור, ויש לי את הנושא לירוק 2.5 מ"ל של רוק לפתרון החיץ. שים לב: איסוף יותר מ 2.5 מ"ל של רוק יכול להוביל להשפלת מדגם מיחס מספק של מדגם לחיץ ייצוב DNA. איסוף רוק מעט מדי יפחית תשואות הצפויות מהפרוטוקול. כדי להעריך את היקפי גבייה, להשתמש במעברי הצבע הממוספרים בצד של tהוא הצינור.
  3. להחליף כובע ומערבבים על ידי היפוך עד לקבלת התערובת הומוגני. טלטול נמרץ הוא לא הכרחי. אחסן את הדגימות ב RT עבור אחסון לטווח קצר או 4 ° C לאחסון לטווח ארוך (> 3 חודשים).

2 הכנות ראשוניות ותמוגה תא

  1. לפני תחילת ההפקה, לחמם אמבט מים ל37 מעלות צלזיוס, ולהכין דלי קרח. שלושה 15 צינורות מ"ל צנטריפוגות חרוטי יהיה צורך עבור כל דגימה שחולצה. שלושה צינורות ישמשו כדי להחזיק את התא גלולה וחלבון, gDNA חילוץ הסופי, וsupernatants isopropanol ואתנול.
  2. להשיג דוגמאות קרקע מאחסון, ודגימות הפכו כמה פעמים ואז מערבולת במהירות בינונית במשך 15 שניות.
  3. לוותר 2.5 מ"ל של מדגם לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ"ל, ולהוסיף 5 מ"ל של תא תמוגה פתרון. מערבבים את המדגם 50 פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך 30 דקות.

הסרת .3 RNA

  1. הוסף 40 μl של RNase סולution ב100 מ"ג / מ"ל, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  2. הסר את המדגם מאמבט המים 37 מעלות צלזיוס ומגניבה על קרח למשך 3 דקות.
    1. לאחר הדגירה RNase, להעלות את הטמפרטורה של המים באמבטיה ל65 מעלות צלזיוס למשך הצעד להחזרת נוזלי DNA של הפרוטוקול.

.4 חלבון והסרת שומנים

  1. הוסף 50 μl של proteinase K פתרון ב20 מ"ג / מ"ל, לערבב כמה פעמים על ידי היפוך, ולדגור על RT למשך תקופה מינימאלית של 30 דקות. הערה: זוהי נקודת השהיה אפשרית לפרוטוקול. לאחר התוספת של proteinase K הפתרון, המדגם יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד ליכול להסתיים החילוץ. האחסון בC ° 4 עד 24 שעה לא הוצג להיות השפעה משמעותית על תשואות מיצוי או איכות DNA. אחסון לטווח ארוך, בשלב זה לא נבדק.
  2. הוספת 1.7 מ"ל של פתרון משקעים חלבון, מערבולת במרץ ל20 שניות במהירות גבוהה, ומניחים על קרח עבור 10 דקות. ברגע שהדגימות התקררו על קרח עבור 10 דקות, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 3,000 XG ו4 מעלות צלזיוס. החלבונים זירז חייבים ליצור גלולה חזקה להמשיך. אם גלולה היא לא חזקה או הפתרון הוא עדיין מעונן, יכולות להיות מקוררות על דגימות קרח למשך 5 דקות נוספות וצנטריפוגה חוזרת ונשנית. הדגימות חייבות להיות כל הזמן על קרח כדי להבטיח גלולה הדוקה.

.5 בידוד וטיהור של gDNA

  1. לתוך צינור צנטריפוגות נקי 15 מ"ל, pipet 5 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל ו8 μl של טהור גליקוגן פתרון ב20 מ"ג / מ"ל.
  2. יוצקים את supernatant המכיל gDNA משלב 4.3 לתוך הצינור המכיל האלכוהול איזופרופיל וגליקוגן פתרון, והותיר אחריו את כדור החלבון זירז. ברגע שsupernatant נוסף, לערבב בעדינות המדגם 50 פעמים על ידי היפוך וצנטריפוגות במשך 30 דקות ב 3,000 XG ו4 ° C..
  3. יוצקים את supernatant לאט לתוך צינור 15 מ"ל נקי. לאחר הסרת supernatant, להוסיף 1 מ"ל של אתנול 70% ללשטוף את הכדור על ידי נדנדה לאט ובעדינות נעו אתנול על גלולה זירז כמה פעמים. שמור אתנול בצינור.
  4. לאחר השטיפה הראשונית, צנטריפוגות המדגם 1 דקות ב2,000 XG ו20 מעלות צלזיוס. ניתן לעשות צעד צנטריפוגה זה ברמת 4 מעלות צלזיוס או 20 מעלות צלזיוס. אין השפעה משמעותית של טמפרטורה הוכחה בשלב זה.
  5. , בעקבות לשטוף וצנטריפוגה הראשוניות של גלולה לשפוך לאט לשטוף אתנול מהצינור וזורקים, ולאחר מכן לבצע לשטוף את השני על ידי חזרה על שלבי 5.3 ו5.4.
  6. לאחר הסרת supernatant מלשטוף את השני, לאפשר את גלולה לייבוש באוויר במשך 15 דקות.
    1. אם המדגם לא התייבש לחלוטין, אוויר יבש לעוד דקות 15.

.6 Rehydration של gDNA

  1. לאחר המדגם התייבש, להוסיף 300 μl של טריס-EDTA לרעננות גלולה gDNA המיובש.
  2. מערבולת המדגם במשך 5 שניות במהירות בינונית ומניחים באמבט מים חמים 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. הסר את הדגימות מאמבט המים ודגירת O / N ב RT.
    הערה: כל מוצרים וחומרים כימיים המשמשים מפורטים בלוח חומרים, כמו גם לוח 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לקבוע פרמטרים אופטימליים להפקה DNA סדרה של עקירות DNA מזווגות בוצעה. דגימת רוק אחת פוצלה וכל מנה שנבדקה עם אחד משני ערכים אפשריים עבור משתנה נתון. לפחות שמונה חזרות של כל בדיקה לזווג בוצעו (למשל, דגימת רוק אחת הייתה aliquoted לבדוק חילוץ עם או בלי הדגירה C ° 50 ראשונית). אופטימיזציה הייתה מבוססת על ארבעה מדדים סטנדרטיים: תשואה כוללת DNA, ערך 260/280, ערך 260/230, ובדיקה ויזואלית של DNA electrophoresed להעריך פיצול. לא כל הצירופים האפשריים של המשתנים הוערכו אינטראקציות סטטיסטיות (N = 169 שילובים), ובמקום זאת בוחר להעריך את ההשפעה השולית של כל משתנה בנפרד. השפעות נבדקו באמצעות רבת דרך ANOVA החוזרים ונשנים-צעדים ואפקטים משוערים נגזרו ממשוואת הרגרסיה שוות ערך. כל ההשפעות משמעותיות מסוכמות בטבלה 1, מוצגים כאברבךשינוי גיל בתשואה (ng / μl לכל מ"ל של קלט רוק) או איכות DNA (260/280 ו260/230).

תמוגה תא (שלב 2) הייתה מותאמת על ידי הערכה: 1) הנוכחות / היעדרות של דגירה C ° 50 (1 שעות) לפני תא תמוגה כדי להבטיח ששפלת proteinase K ותמוגה תא בתיווכו של מאגר האחסון הלכו להשלמה, 2 נוכחות) / היעדר המגון ידי vortexing צעד (מהירות בינונית, 15 שניות), ו3) זמן דגירה פתרון תמוגה (5 לעומת 30 דקות). הדגירה תמוגה תא 30 דקות עלתה תשואה בשיעור ממוצע של .3.5% (p <.01) אבל לא היה לי משתנה תמוגה תא אחר השפעה משמעותית על תשואה. Vortexing ירד היחס 260/280 ידי מובהק סטטיסטי (p <.001) אך קטן 0.03 כמעט.

ממטרים חלבון (שלב 4) שקדמו על ידי עיכול proteinase K לשבש שרשרות של חומצות אמינו, לשפר את יעילות ממטרים חלבון ושחרור נתפסו DNA. הסכום של proteinase K היה מגוון של פי עשר.טמפרטורת צנטריפוגה הופחתה מ 20 מעלות צלזיוס עד 4 מעלות צלזיוס. הגדלת כמות proteinase K גרמה לירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית בתשואה (8.7%) והן 260/280 ו260/230 היחסים גם השתפרו מעט.

משקעים אתנול (שלב 5) היה השלב האחרון של הפרוטוקול שנבדק. הסכום של מוביל גליקוגן (0, 8 μl) היה מגוון, כפי שהיה בזמן צנטריפוגה סך הכל (5 לעומת 30 דקות 11). רק זמן צנטריפוגה מושפע באופן משמעותי תשואה, עם עלייה ממוצעת של 290%. הספין כבר ירד גם היחס 260/280 מעט (0.05). אין השפעה משמעותית של גליקוגן בתשואה נצפתה במהלך הניסויים; למרות שהכמות הכוללת של DNA בעקירות אלה היו מספיק גדול שגליקוגן לא בדרך כלל לשמש. למרות חוסר ההשפעה בדגימות אלה, הוא עדיין ממליץ להשתמש גליקוגן כדי למזער את הסיכון של תשואות מופחתות בכל פעם שקלט רוק הנפח נמוך מניתן כאן או אם יסדואר הוא מכל סיבה אחרת להאמין תשואה תהיה נמוכה.

בדיקה ויזואלית של דגימות DNA נציג (איור 1) הצביעה על כך שDNA שחולץ היה לא מקוטע מאוד לכל הליך מיצוי DNA רוק, אלא הראתה להקת משקל ראויה מולקולרית גבוהה בלי מריחות מעידות על DNA המושפל. לאחר RNase עיכול, הפרוטוקול שהופק 260/280 ממוצע של 1.74.

איור 1
איור 1 איכות של DNA נגזר רוק. ארבעה נהלי חילוץ יושמו לאותו אוסף הרוק. דוגמאות (א) היו electrophoresed על ג'ל 0.8% agarose (250 DNA ng). כל הווריאציות של פרוטוקולי מיצוי DNA הרוק לגרום למשקל מולקולרי גבוה DNA (> 20 kb), ללא עדות של השפלה. ליין: ladde DNA 1r, 2 ו -3 דגימות Oragene prepIT L2P פרוטוקול, 4 & 5 Gentra Puregene גוף נוזלי פרוטוקול, 6 & 7 הפרוטוקול מותאם ללא צעד הסרת RNA, 8 ו -9 בפרוטוקול מותאם לשלב להסיר RNA. נתיבים 2-7 ישירות פרוטוקולים מקבילים באותו דגימות רוק. נתיבים 8 & 9 מראים כי צעד הסרת RNA לא להציג את השפלת DNA. דוגמאות (ב) electrophoresed על ג'ל 2% agarose (150 DNA ng). שיא RNA קל הוא נצפים קרובים לתחתית של ג'ל בנתיבים 2 עד 7 (אמנות כאמור לעיל). נתיבים 8 & 9 להראות את האפקטיביות של צעד הסרת RNA.

שלב הסרת RNA (שלב 3 עם RNase) הוא קריטי עבור כימות מדויק של DNA. במהלך בדיקה, תוכן RNA גבוה באופן עקבי נצפה, כפי שנקבע על ידי היחס של גדילי הדנ"א כפול לרנ"א שנמדד על ידי קיוביט 2.0 fluorometer. על תוכן ממוצע, חומצות גרעין מדגימות ללא RNase טיפול מורכב מ46.6% (± 0.4) RNדוגמאות א 'שעברו שלב להסרת RNA לקרוא בשם "<20 ng / ml", המהווה את הקריאה הנמוכה ביותר האפשרית עבור זיהוי RNA של קיוביט.

DNA שהושג באמצעות פרוטוקול מותאם זה היה באיכות מספקת עבור סידור תפוקה גבוהה כאשר RNase נוסף צעד יושם. כדי להשיג נתונים resequencing ממוקדים, ערכת Agilent SureSelect יעד העשרה מותאמת אישית יושמה ל24 דגימות, מיקוד 2.6 Mb של רצף. רצף תפוקה גבוה נערך ביום 12 בדגימות המבורקד (צמודות) לכל נתיב. רצף קורא היו מיושר BWA לגנום התייחסות hg19 12, אז יישום של כיול איכות בסיס GATK 13 ציון, התכנסות indel, ההסרה כפולה, גילוי SNP וgenotyping בו זמנית בכל 24 הדגימות בוצע באמצעות פרמטר סינון קשה להתאמן הכי טוב ערכי 14. כל 24 הדגימות הניבו איכות גבוהה NGS נתונים (טבלה 2). של שקורא עבר Illuמינה של המסננים סטנדרטיים והיה לי Q> 20, 91.4% מיושרים לאזורי יעד העשרת רצף, מתן עומק כיסוי ממוצע על היעד של> 30x כיסוי בQ> 100, גם בתחומים החיוניים לגילוי SNP נדיר בכל דגימה. יתרת הגדיל הממוצעת הייתה 49.9%. שיחות גרסת השוואה עם גנוטיפים microarray Illumina הניבו התאמה של 98.9%.

משתנה מועמד ng / μl 260/280 260/230
וורטקס ns -0.03 *** ns
Cell דקות X30 תמוגה דגירה 3.5% ** ns ns
Proteinase K x10 -8.7% * -0.05 *** -0.03 ***
ספין 30 דקות 290.2% *** -0.05 *** ns
גליקוגן ns ns -0.37 ***

גודל .1 השפעת טבלה משתנה אופטימליים בכמות מדדים / איכות. כל גדלי ההשפעה הם ביחידות המופיעות בכותרת העמודה. p-ערכים מניתוח שונה: * p <.05; ** P <.01; *** P <.001; NS לא משמעותי

איכות מטרי ערך
אורך יעד 1,708 kb
יעד מקורה> 30x 85.22%
SNPs בdbSNP 92.55%
הסכם מערך 98.99%

לוח 2: איכות של תפוקה גבוהה רצף מהיעד העשרה.

בצו = = = רוחב cellpadding "0" cellspacing "0" "0" = "668">
פרוטוקול אופטימלי חדש פריט מפיצים # קטלוג יחידת רכש עלות / יחידה עלות / אוסף
15 מ"ל צנטריפוגה צינורות פישר 12-565-268 500 צינורות 233.50 $ 3.2690 $
תא תמוגה פתרון Qiagen 158,908 L 1 401.00 $ 3.2080 $
Proteinase K Sigma P6556 1 גרם 713.00 $ 1.5686 $
פתרון רטיבות חלבון Qiagen 158,912 350 מ"ל 350.00 $ 2.7200 $
Isopropanol פישר A416-4 מקרה של 4 x 4 L 486.71 $ .2434 $
גליקוגן פתרון (20 מ"ג / מ"ל) EZ-BioResearch S1003 1 מ"ל 51.00 $ .8160 $
אתנול 70% פישר 04-355-305 מקרה של 4 x 1 גל. 123.03 $ .0325 $
טריס-EDTA (TE) פישר BP2473-1 L 1 68.67 $ 0.0412 $
NaCl פישר AC194090010 1 קילוגרם 34.65 $ 0.000004 $
טריס HCl פישר BP1757-100 100 מ"ל 57.84 $ .0116 $
EDTA פתרון (0.5 M) פישר 03-500-506 100 מ"ל 33.60 $ .0134 $
נתרן Dodecyl סולפט פישר BP166-100 100 גרם 59.95 $ .0060 $
עלות כוללת 11.93 $
Oragene פריט מפיצים # קטלוג יחידת רכש עלות / יחידה עלות / אוסף
15 מ"ל צנטריפוגה צינורות פישר 12-565-268 500 צינורות 233.50 $ 0.9340 $
אתנול 100% פישר BP2818-100 100 מ"ל 34.29 $ 1.6459 $
אתנול 70% פישר 04-355-305 מקרה של 4 x 1 גל. 123.03 $ 0.0081 $
טריס-EDTA (TE) פישר BP2473-1 L 1 68.67 $ .0687 $
צינור 1.5 מ"ל Genesee 22-281A 500 צינורות 22.85 $ 0.0457 $
KIT Oragene האוסף Oragene OG-500 1 25.00 $ 25.00 $
עלות כוללת 27.70 $
Puregene פריט מפיצים # קטלוג יחידת רכש עלות / יחידה עלות / אוסף
15 מ"ל צנטריפוגה צינורות פישר 12-565-268 500 צינורות 233.50 $ 0.9340 $
תא תמוגה פתרון Qiagen 158,908 L 1 401.00 $ 4.0100 $
Proteinase K Qiagen 158,918 650 מ"ל 73.10 $ 7.8723 $
פתרון רטיבות חלבון Qiagen 158,912 350 מ"ל 350.00 $ 4.0000 $
Isopropanol פישר A4164 מקרה של 4 x 4 L 486.71 $ .3650 $
גליקוגן פתרון Qiagen 158,930 500 מ"ל 64.30 $ 2.5720 $
אתנול 70% פישר 04-355-305 מקרה של 4 x 1 גל. 123.03 $ 0.0975 $
DNA הידרציה פתרון Qiagen 158,914 100 מ"ל 69.80 $ 0.1396 $
NaCl פישר AC19409-0010 1 קילוגרם 34.65 $ 0.000004 $
טריס HCl פישר BP1757-100 100 מ"ל 57.84 $ .0116 $
EDTA פתרון (0.5 M) פישר 03-500-506 100 מ"ל 33.60 $ .0134 $
נתרן Dodecyl סולפט פישר BP166-100 100 גרם 59.95 $ .0060 $
עלות כוללת 19.99 $

לוח 3: השוואת עלות של הפרוטוקול מותאם כדי לחלץ דנ"א מ2 מ"ל של כל רוק עם פרוטוקולים זמינים מסחרי אחרים.ריאגנטים ll ומתכלים הנדרשים למיצוי DNA כבר הוערכו באמצעות רשימת מחירים סטנדרטיים זמינים באינטרנט החל מיום 30 בספטמבר 2013. הערה שפרוטוקול זה נכתב כדי לחלץ דנ"א מ1.25 מ"ל של כל רוק (כלומר, 2.5 מ"ל של רוק וחיץ , ראה שלב 2.3) כערך זה מייצג מחצית מהנפח הכולל בצינור איסוף רוק. להשוואת העלות, 2 מ"ל נבחר כזה הוא הסכום הקשורים לערכה נפוצה זמינה מסחרי (Oragene).

DNA ייצוב חוצץ (250 מ"ל)
רכיב נפח (מ"ל) [סופי]
1 M NaCl 1.461 גרם 0.1 M
טריס HCl 2.5 0.01 M
EDTA 0.5M 5 0.01 M
10% SDS 12.5 </ Td> 0.014 M
Proteinase K פתרון (20 מ"ג / מ"ל) 2.5 6.92x10 -6 M
DDH 2 O 227.5
Proteinase K פתרון (20 מ"ג / מ"ל)
רכיב נפח (מ"ל) [סופי]
אבקת proteinase K 500 מ"ג 6.92x10 -4 M
DDH 2 O 25
אתנול 70% (500 מ"ל)
רכיב נפח (מ"ל) [סופי]
אתנול 95% 368.5 12.63 M
DDH 2 O 131.5

לוח 4 מתכונים לריאגנטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההליך הנוכחי הוא פרוטוקול מיצוי DNA מותאם שהשתפר במידה ניכרת תשואה של DNA משקל המולקולרי הגבוה בהשוואה לשיטות סטנדרטית, מבלי להתפשר על איכות DNA. השלב הקריטי עם ההשפעה הגדולה ביותר על התשואה ביותר היה צעד 5.2, הכולל צעד צנטריפוגה כבר במהלך משקעים אתנול מכל פרוטוקול שפורסם סקר כאן, חוץ מאחד שלא הופץ באופן נרחב 11. לא חל שינויים באיכות DNA הקשורים לצנטריפוגה עוד זה התגלו, המצביע על כך שרוב DNA הזמינים מאוסף רוק שלם הוא לא מושפל וגבוה משקל מולקולרי.

יש אוסף רוק כל מגבלות באיכות דגימה כגון פוטנציאל למזהמים זרים, אשר צריך להיות ממוזערים בשלב האיסוף, ואת הנוכחות של חלבון מוגזם במדגם שיכול להיות סימן לזיהום בסיסי. כמויות גדולות של מזהמי חלבון או זר יכוליישאר בDNA שחולץ הסופי ובכך מה שהופך את הכימות מדויק. אם יש חלבונים או מזהמים הנותרת לאחר החזרת נוזלים (שלב 6) חשודים, מדגם לנקות יכול להתבצע על ידי החל משעת צעד הממטרים חלבון עם נפחים מגיב בקנה מידה על מנת לשקף את קלט נפח דגימה. מגבלה נוספת של הפרוטוקול היא את משך הזמן שנדרש כדי לבצע את הצעדים. דוגמאות רבות ניתן להפעיל במקביל; עם זאת, מומלץ שלא יותר מ 24 עקירות מקבילות שיופעלו בו זמנית. הדבר חשוב במיוחד לצעד הממטרים חלבון, שבו המדגם חייב להישאר קר כדי להבטיח גלולה הדוקה ופועלים יותר מ -24 דגימות עשויים לאפשר זמן כדורים מחדש להתמוסס.

הפרוטוקול המובא כאן הוא שיטת העלות האפקטיבית ביותר נחשבת (ראה טבלה 3). בעוד פרוטוקול זה עושה שימוש ריאגנטים מערכת חילוץ Puregene, נפח קטן יותר ממומלץ בפרוטוקול Puregene משמשמבלי להתפשר על תשואת מיצוי וזה הפחתה זו בחומרים כימיים שמניע את החיסכון בעלויות בהשוואה לפרוטוקול. שים לב שהעלות המחושבת להפקה משתמשת במחיר המחירון לכל פריט ואינו משקפת שום הנחות. העלות לחילוץ עם הפרוטוקול מותאם ניתן להפחית עוד יותר עם הזמנות בכמויות גדולות או הנחות באמצעות נציגי מכירות של חברה.

ראיות גם כבר ובלבד שפרוטוקול זה הוא מתאים לשימוש עם הרצף של הדור הבא. הנתונים שהתקבלו מספק ראיות נוספות לשימושיות של דגימות רוק למחקר גנטיקה של אדם במחלות רבות שבם דם אינו זמין באופן שיגרתי. בעוד DNA נגזר קו דם והתאים ממשיך להיות המקור המועדף של חומר גנטי לבדיקה, אוסף רוק שלם היא חלופה מעשית כאשר מקורות אלה אינם זמינים, כאשר גיוס חולה מושפע מהאוסף או לקיחת דמם אינו זמין ואין זה מעשי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 ml Centrifuge Tubes Fisher 12-565-268
Cell Lysis Solution Qiagen 158908
Proteinase K Sigma P6556
Protein Precipitation Solution Qiagen 158912
Isopropanol Fisher A416-4
Glycogen EZ-BioResearch S1003
70% Ethanol Fisher 04-355-305
Tris-EDTA (TE) Fisher BP2473-1
NaCl Fisher AC194090010
Tris HCl Fisher BP1757-100
EDTA (0.5 M) Solution Fisher 03-500-506
Sodium Dodecyl Sulfate Fisher BP166-100 
Analog Vortex Mixer Fisher 02-215-365
Centrifuge 5810R Eppendorf 5811 000.010

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
  2. Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
  3. Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
  4. Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
  5. Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
  6. Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
  7. Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
  8. Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
  9. Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
  10. Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
  11. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
  12. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  13. McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
  14. DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 90 אוסף דנ"א רוק מיצוי DNA רצף הדור הבא טיהור DNA DNA
איסוף והפקת DNA רוק לסידור הדור הבא
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goode, M. R., Cheong, S. Y., Li, N., More

Goode, M. R., Cheong, S. Y., Li, N., Ray, W. C., Bartlett, C. W. Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (90), e51697, doi:10.3791/51697 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter