Introduction
Innhenting av høy kvalitet DNA for menneske genetiske studier er viktig i sykdomsgenet funnet prosessen. Blod, selv krever en invasiv prosedyre og også å være dyrere enn spytt samling, er foretrukket for å skape udødeliggjorte cellelinjer som uendelig kilde til DNA eller iPSCs for funksjonelle studier, og noen ganger blod-DNA blir brukt når cellelinjer som ikke er tilgjengelige. Men å skaffe blod krever et trenet phlebotomist og blod har en kortere halveringstid enn spytt en. DNA fra spytt er rimeligere og enklere å få tak i, siden det kan samles inn og sendes i posten uten behov for en phlebotomist, og dermed øke potensielle lagt bassenger godt utover nedslagsfeltet for sykehus og laboratorier to. Study påmelding kan forbedres når motivet har muligheten til å gi en spyttprøve i stedet for blod 3, 4. Bekymringer om mengden og kvaliteten av DNA fra spytt kan ha begrenset sin omfattende osse til tross for tallrike studier nylige studier som viser egnetheten av hele spytt, med et gjennomsnitt på 4,3 x 10 5 celler pr milliliter, etter DNA-testing over de eldre bukkale vattpinner metoder som ikke oppnår betydelige mengder av spytt 2, 3, 4, 5, 6.. Selv en beskjeden litteraturen eksisterer viser egnetheten av hele spytt avledet DNA for genotyping applikasjoner inkludert mikromatrisebasert metoder 8, 9, 10, har ingen studier undersøkt neste generasjon sekvensering (NGS). Målet for optimalisering av hele denne spytt DNA-ekstraksjon protokollen var å maksimere kvantitet og kvalitet for genetikk applikasjoner på en kostnadseffektiv måte som er lett implementeres i laboratorier med felles reagenser og forbruksmateriell.
DNA-ekstraksjon fra spytt krever flere prosedyrer: 1) innsamling og lagring, 2) cellelyse, 3) RNase behandling, 4) protein nedbør, 5) etanol nedbør, 6) DNA rehydrering. DNA Stabilization Buffer løsning, beskrevettidligere 2, funksjoner tilstrekkelig uten endringer. Ingen forsøk på å optimalisere RNase behandling og DNA rehydrering trinn ble laget. For hver gjenværende trinn ble flere variabler som kan påvirke avkastningen identifisert. Hver variabel ble manipulert individuelt og forbedring i utbytte og kvalitet ble vurdert statistisk. For variabler som ble vist å forbedre utbyttet og / eller DNA-kvalitet, ble de optimale verdier som inngår i den avsluttende protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Før gi spyttprøver alle fag ga informert samtykke i samsvar med retningslinjene for behandling av mennesker på Nationwide Children Hospital.
1. Spytt innsamling og oppbevaring
- Før spytt samling, sikre at faget munn er fri for mat eller andre fremmede stoffer ved å ha faget skylle munnen med vann og unngå å spise eller drikke i 30 min før samle prøven.
- Åpne et 15 ml sentrifugerør med 2,5 ml av DNA-stabilisering buffer 2 å sørge for å unngå å berøre innsiden av hetten eller røret, og har emnet spytt 2,5 ml spytt inn i bufferløsningen. Merk: Innhenting av mer enn 2,5 ml spytt kan føre til nedbrytning prøven fra en utilstrekkelig forholdet mellom prøve til DNA stabilisering buffer. Samle for lite spytt vil redusere forventet avkastning fra protokollen. For å evaluere innsamlingsvolum, bruker du de nummererte gradienter på siden av than-røret.
- Sett på hetten og bland ved å snu opp inntil blandingen er homogenisert. Sterk rysting er ikke nødvendig. Oppbevar prøvene ved RT for korttidslagring eller 4 ° C for langtidslagring (> 3 måneder).
2. Første forberedelser og Cell Lysis
- Før start av ekstraksjon, oppvarming av et vannbad til 37 ° C, og lage en is bøtte. Tre 15 ml koniske sentrifugerør vil være nødvendig for hver ekstraherte prøven. De tre rør blir brukt til å holde cellen og protein pellet, den endelige ekstrahert gDNA, og isopropanol og etanol supernatanter.
- Hente prøver fra lagring og invertere prøver flere ganger da vortex på middels hastighet i 15 sek.
- Tilsett 2,5 ml av prøven i en ren 15 ml sentrifugerør, og tilsett 5 ml Cell Lysis Solution. Bland prøven 50 ganger ved inversjon, og inkuber ved romtemperatur i 30 min.
3. RNA Fjerning
- Legg 40 mL av RNase A Soloppløsning ved 100 mg / ml, og inkuberes ved 37 ° C i 15 min.
- Fjern prøven fra 37 ° C vannbad og avkjøl på is i 3 min.
- Etter RNase A inkubering øke temperaturen på vannbadet til 65 ° C for den DNA rehydrering trinn av protokollen.
4. Protein og Lipoidfjerning
- Tilsett 50 ul proteinase K løsning på 20 mg / ml, bland flere ganger ved inversjon, og inkuber ved romtemperatur i minst 30 min. Merk: Det er en mulig midlertidig stopping point for protokollen. Etter tilsetningen av den Proteinase K løsning, kan prøven lagres ved 4 ° C inntil ekstraksjonen kan gjennomføres. Lagring ved 4 ° C i opp til 24 timer ble ikke vist å ha en betydelig effekt på utvinning gir etter eller DNA-kvalitet. Langtidslagring på dette stadiet er ikke evaluert.
- Legg 1,7 ml Protein presipiteringsoppløsning, vortex kraftig i 20 sekunder ved høy hastighet og sted på is i 10 min. Etter at prøvene er avkjølt på is i 10 minutter, sentrifuger i 10 minutter ved 3000 xg og 4 ° C. De utfelte proteiner må danne en tett pellet for å fortsette. Dersom pelleten ikke er tett eller oppløsningen er fremdeles regn, kan prøvene avkjølt på is i 5 min mer og sentrifugering gjentatt. Prøvene må holdes på is for å sikre en tett pellet.
5. isolering og rensing av gDNA
- Til en ren 15 ml sentrifugerør, pipette 5 ml isopropanol og 8 pl av ren Glykogen løsning ved 20 mg / ml.
- Hell av supernatanten inneholdende den gDNA fra trinn 4.3 i røret inneholdende isopropanol og Glykogen løsning, etterlater det utfelte protein pellet. Når supernatanten ble tilsatt, forsiktig blande prøven 50 ganger etter inversjon og sentrifuger i 30 minutter ved 3000 xg og 4 ° C.
- Hell av supernatanten langsomt inn i en ren 15 ml tube. Etter fjerning av supernatanten, tilsett 1 ml 70% etanol for åVask pelleten med sakte vuggende og forsiktig å bevege etanol over utfelte pellet flere ganger. Behold etanol i røret.
- Etter den første vask, sentrifuger prøven i 1 min ved 2000 xg og 20 ° C. Dette sentrifugeringstrinn kan utføres ved enten 4 ° C eller 20 ° C. Ingen signifikant effekt av temperatur er vist for dette trinnet.
- Etter den første vask og sentrifugering av pelleten, langsomt helles etanolvask fra røret og kasser, og deretter utføre en andre vask ved å gjenta trinn 5.3 og 5.4.
- Etter fjerning av supernatanten fra det andre vaske, at pelleten til å lufttørke i 15 minutter.
- Hvis prøven ikke er helt tørt, lufttørke for en annen 15 min.
6. Utvanning av gDNA
- Når prøven er tørket, tilsett 300 ul Tris-EDTA for å rehydrere det tørkede pellet gDNA.
- Vortex prøven i 5 sek på middels hastighet, og plasser i en65 ° C varmt vannbad i 1 time.
- Fjern prøven fra vannbadet og inkuberes O / N ved RT.
MERK: Alle produkter og reagenser som brukes, er oppført i Materials Table, samt tabell 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å bestemme optimale parametre for DNA-ekstraksjon en rekke sammenkoblede DNA ekstraksjon ble utført. En enkelt spyttprøve ble delt og hver del testet med en av to mulige verdier for en gitt variabel. Minst åtte replikater av hver sammenkoblet test ble utført (f.eks, ble en enkelt spyttprøve alikvotert å teste ekstraksjon både med og uten innledende 50 ° C inkubasjon). Optimalisering var basert på fire standard beregninger: total DNA avkastning, den 260/280 verdi, 260/230 verdi, og visuell inspeksjon av elektroforeset DNA for å vurdere fragmentering. Ikke alle mulige kombinasjoner av variablene ble vurdert statistiske interaksjoner (N = 169 kombinasjoner), velger i stedet å vurdere den marginale effekten av hver variabel individuelt. Virkninger ble testet ved hjelp av en multi-måte for gjentatte målinger ANOVA og beregnede effekter ble avledet fra det tilsvarende regresjonsligningen. Alle betydelige virkninger er oppsummert i Tabell 1, er vist som gjenalder endring i markedsrenten (ng / mL per ml spytt inngang) eller DNA-kvalitet (260/280 og 260/230).
Cellelyse (trinn 2) ble optimalisert ved å vurdere: 1) tilstedeværelse / fravær av en 50 ° C-inkubering (1 time) før cellelysering for å sikre at Proteinase K nedbrytning og cellelyse mediert av lagringsbuffer gikk til ferdigstillelse, 2 ) tilstedeværelse / fravær av en homogenisering ved å virvle trinn (middels hastighet, 15 sekunder), og 3) lysis løsning inkubasjonstiden (5 versus 30 min). Den 30 min cellelyse inkubering økt utbytte ved et gjennomsnitt på 3,5% (p <0,01), men ingen andre cellelyse variabel hadde en signifikant virkning på utbyttet. Virvling redusert 260/280 ratio med en statistisk signifikant (p <.001), men praktisk talt liten 0,03.
Protein nedbør (trinn 4) innledes med Proteinase K fordøyelse for å forstyrre aminosyrekjedene, forbedre protein ventet effektivitet og slippe fanges DNA. Mengden av proteinase K ble variert ti-fold.Sentrifugetemperaturen ble redusert fra 20 ° C til 4 ° C. Øke mengden av proteinase K forårsaket en statistisk signifikant nedgang i yield (8,7%) og også litt forbedret både 260/280 og 260/230 forholdstall.
Etanol nedbør (trinn 5) var den siste fasen av protokollen undersøkt. Mengden av glykogenbærer (0, 8 ul) ble variert, som var den totale tid sentrifugering (5 g i 30 min 11). Kun sentrifuge tid betydelig påvirket avkastning, med en gjennomsnittlig økning på 290%. Jo lenger spin også redusert 260/280 ratio litt (0,05). Ingen signifikant effekt av glykogen på yielden ble observert under forsøkene; selv om den totale mengden av DNA i disse ekstraksjoner var tilstrekkelig stor for at glykogen ikke vil vanligvis benyttes. Til tross for den manglende effekten i disse prøvene, er det fortsatt anbefale å bruke glykogen til å minimere risikoen for reduserte utbytter når spytt inngangsvolumet er lavere enn gitt her, eller hvis ndree er en hvilken som helst annen grunn til å tro at utbyttet blir lavt.
Visuell inspeksjon av de representative DNA-prøvene (figur 1) indikerte at det ekstraherte DNA ikke var sterkt fragmentert for enhver spytt DNA-ekstraksjon prosedyre, men i stedet viser en passende høy molekylvekt båndet uten smearing indikativ for nedbrutt DNA. Etter RNase A fordøyelsen, protokollen produserte i gjennomsnitt 260/280 på 1,74.
Figur 1. Kvalitet av spytt avledet DNA. Fire utvinning prosedyrer ble brukt på samme spytt samling. (A) Prøver ble elektroforesebehandlet på en 0,8% agarose-gel (250 ng DNA). Alle variasjoner av spytt DNA ekstraksjonsmetoder resultere i høy molekylvekt (> 20 kb) DNA, uten tegn på nedbrytning. Lane: 1 DNA ladder, 2 & 3 Oragene prepIT L2P Protocol prøver, 4 & 5 Gentra Puregene Body Fluids protokollen, 6 & 7 optimalisert protokoll uten RNA fjerningstrinn, 8 & 9 optimalisert protokoll med RNA fjerne trinn. Lanes 2-7 er direkte analoge protokoller på de samme spyttprøver. Søyle 8 og 9 viser at RNA fjerning trinnet ikke innføre DNA degradering. (B) Prøver ble elektroforesebehandlet på en 2% agarosegel (150 ng DNA). En svak RNA topp er observerbar nær bunnen av gelen i banene 2 til 7 (konvensjoner som ovenfor). Søyle 8 og 9 viser effekten av RNA-fjerningstrinnet.
RNA fjerning Step (trinn 3 med RNase A) er kritisk for nøyaktig kvantifisering av DNA. Under testingen ble konsekvent høyt RNA-innhold er observert, som bestemmes av forholdet av dobbelttrådet DNA til RNA målt ved en qubit 2.0 Fluorometer. I gjennomsnitt, nukleinsyre-innhold fra prøver uten RNase A besto behandlingen av 46,6% (± 0,4) RNA. Prøver som gjennomgikk den RNA-fjerning Trinn leses som "<20 ng / ml", som er den lavest mulige avlesningen for qubit sin RNA deteksjon.
Den oppnådde gjennom denne optimaliserte protokoll DNA var av tilstrekkelig kvalitet for høy gjennomstrømning sekvense når tilleggs RNase A trinn ble anvendt. For å oppnå målrettede resequencing data, ble en tilpasset Agilent SureSelect Target Enrichment kit brukt på 24 prøver, målretting 2,6 Mb av sekvensen. High throughput sekvensering ble utført på 12 strekkode (indeksert) prøver per kjørefelt. Sekvens leser ble BWA-justert til hg19 referansen genom 12, deretter anvendelse av GATK 13 basis kvalitet poengsum rekalibrering, indel omstilling, duplisere fjerning, SNP oppdagelse og genotyping samtidig på tvers av alle 24 prøver ble utført ved hjelp av beste praksis vanskelig filtrering parameterverdier 14. Alle 24 prøver ga høy kvalitet NGS data (tabell 2). Reads som gikk Illumina standardfiltre og hadde Q> 20, 91,4% justert i forhold til sekvens berikelse målet regioner, noe som gir et gjennomsnitt på målet dekning dybde på> 30x dekning på Q> 100, godt innenfor de nødvendige rammer for sjeldne SNP-funnet i hver prøve. Den gjennomsnittlige tråd balansen var 49,9%. Sammenligning variant samtaler med Illumina microarray genotyper ga en konkordans på 98,9%.
| Kandidat Variabel | ng / mL | 260/280 | 260/230 |
| Vortex | ns | -0.03 *** | ns |
| x30 min Cell Lysis Inkubasjon | 3,5% ** | ns | ns |
| Proteinase K x10 | -8.7% * | -0.05 *** | -0.03 *** |
| 30 min spin | 290,2%*** | -0.05 *** | ns |
| Glykogen | ns | ns | -0.37 *** |
Tabell 1. Effekt Størrelse Optimalisert Variabel på antall / kvaliteten Metrics. Alle effektstørrelser er i enhetene som er oppført i kolonneoverskriften. p-verdier fra ANOVA: * p <0,05; ** P <0,01; *** P <.001; ns ikke signifikant
| Kvalitet Metric | Verdi |
| Mållengden | 1708 kb |
| Target Dekket> 30x | 85.22% |
| SNPs i dbSNP | 92.55% |
| Array avtalen | 98.99% |
Tabell 2. Kvaliteten på høy gjennomstrømning Sequence fra Target berikelse.
| New Optimalisert Protocol | Element | Distributer | Catalog # | Innkjøpsenhet | Kostnad / enhet | Kost / Collection |
| 15 ml Sentrifuger Tubes | Fisher | 12-565-268 | 500 Tubes | $ 233,50 | $ 3,2690 | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | 1 L | $ 401,00 | $ 3,2080 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | 1 g | $ 713,00 | $ 1,5686 | |
| Protein presipiteringsoppløsning | Qiagen | 158912 | 350 ml | $ 350,00 | $ 2,7200 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | Case of 4 x 4 L | $ 486,71 | $ 0,2434 | |
| Glykogen løsning (20 mg / ml) | EZ-BIORESEARCH | S1003 | 1 ml | $ 51,00 | $ 0,8160 | |
| 70% etanol | Fisher | 04-355-305 | Case of 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ 0,0325 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | 1 L | $ 68,67 | $ 0,0412 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | 1 kg | $ 34,65 | $ 0.000004 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | 100 ml | $ 57,84 | $ 0,0116 | |
| EDTA (0,5 M) Løsning | Fisher | 03-500-506 | 100 ml | $ 33,60 | $ 0,0134 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | 100 g | $ 59,95 | $ 0,0060 | |
| Totalkostnad | $ 11,93 | |||||
| Oragene | Element | Distributer | Catalog # | Innkjøpsenhet | Kostnad / enhet | Kost / Collection |
| 15 ml Sentrifuger Tubes | Fisher | 12-565-268 | 500 Tubes | $ 233,50 | $ 0,9340 | |
| 100% etanol | Fisher | BP2818-100 | 100 ml | $ 34,29 | $ 1,6459 | |
| 70% etanol | Fisher | 04-355-305 | Case of 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ 0,0081 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | 1 L | $ 68,67 | $ 0,0687 | |
| 1,5 ml tube | Genesee | 22-281A | 500 Tubes | $ 22,85 | $ 0,0457 | |
| Oragene Collection KIT | Oragene | OG-500 | 1 | $ 25,00 | $ 25,00 | |
| Totalkostnad | $ 27,70 | |||||
| Puregene | Element | Distributer | Catalog # | Innkjøpsenhet | Kostnad / enhet | Kost / Collection |
| 15 ml Sentrifuger Tubes | Fisher | 12-565-268 | 500 Tubes $ 233,50 | $ 0,9340 | ||
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | 1 L | $ 401,00 | $ 4,0100 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158918 | 650 ml | $ 73,10 | $ 7,8723 | |
| Protein presipiteringsoppløsning | Qiagen | 158912 | 350 ml | $ 350,00 | $ 4,0000 | |
| Isopropanol | Fisher | A4164 | Case of 4 x 4 L | $ 486,71 | $ 0,3650 | |
| Glykogen Solution | Qiagen | 158930 | 500 ml | $ 64,30 | $ 2,5720 | |
| 70% etanol | Fisher | 04-355-305 | Case of 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ 0,0975 | |
| DNA Hydration Solution | Qiagen | 158914 | 100 ml | $ 69,80 | $ 0,1396 | |
| NaCl | Fisher | AC19409-0010 | 1 kg | $ 34,65 | $ 0.000004 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | 100 ml | $ 57,84 | $ 0,0116 | |
| EDTA (0,5 M) Løsning | Fisher | 03-500-506 | 100 ml | $ 33,60 | $ 0,0134 | |
| Natriumdodecylsulfat- | Fisher | BP166-100 | 100 g | $ 59,95 | $ 0,0060 | |
| Totalkostnad | $ 19,99 |
Tabell 3. Kostnader sammenligning av optimalisert protokoll for å trekke ut DNA fra 2 ml hele spytt med andre kommersielt tilgjengelige protokoller. All reagenser og forbruksmateriell som kreves for DNA-ekstraksjon er vurdert ved hjelp av standard listepris tilgjengelig på internett som 30. september 2013 Merk at denne protokollen er skrevet for å trekke ut DNA fra 1,25 ml av hele spytt (dvs. 2,5 ml spytt og buffer , se trinn 2.3) som denne verdi representerer halvparten av det totale volum i spyttet samling rør. For kostnaden sammenligning ble 2 ml valgt da dette er den mengde forbundet med en felles kommersielt tilgjengelig kit (Oragene).
| DNA Stabilisering buffer (250 ml) | ||
| Komponent | Volum (ml) | [Final] |
| 1 M NaCl | 1,461 g | 0,1 M |
| Tris HCl | 2.5 | 0,01 M |
| 0.5M EDTA | 5 | 0,01 M |
| 10% SDS | 12.5 </ Td> | 0.014 M |
| Proteinase K løsning (20 mg / ml) | 2.5 | 6.92x10 -6 M |
| DDH 2 O | 227.5 | |
| Proteinase K løsning (20 mg / ml) | ||
| Komponent | Volum (ml) | [Final] |
| Proteinase K pulver | 500 mg | 6.92x10 -4 M |
| DDH 2 O | 25 | |
| 70% etanol (500 ml) | ||
| Komponent | Volum (ml) | [Final] |
| Etanol 95% | 368,5 | 12.63 M |
| DDH 2 O | 131.5 | |
Tabell 4. Oppskrifter for reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende fremgangsmåte er en optimalisert DNA-ekstraksjon protokoll som har betydelig forbedret utbytte av høy molekylvekt-DNA sammenlignet med standardmetoder, uten at det går DNA-kvalitet. Den kritiske trinnet med størst effekt på yielden mest var trinn 5.2, som inkluderer en lengre sentrifuge trinnet under etanol nedbør enn noen publisert protokollen anmeldt her, bortsett fra en som ikke var allment distribuert 11. Ingen endringer i DNA-kvalitet forbundet med denne lenger sentrifugering ble påvist, noe som indikerer at det meste av den tilgjengelige DNA fra spytt samlingen ikke er degradert og høy molekylvekt.
Hele spytt samlingen har begrensninger i prøvekvalitet som potensialet for fremmede forurensninger, som må reduseres til et minimum ved oppsamlingstrinnet, og tilstedeværelsen av for mye protein i prøven som kan være et tegn på en underliggende infeksjon. Store mengder protein eller utenlandske forurensninger kanforblir i den endelige DNA ekstrahert og dermed gjøre kvantifisering unøyaktig. Hvis det er resterende proteiner eller forurensninger etter rehydrering (trinn 6) er mistenkt, en prøverensing kan utføres ved å starte på protein utfellingstrinnet med reagensvolumene skalert for å reflektere volum prøveinngang. En annen begrensning av protokollen er hvor lang tid som kreves for å utføre trinnene. Flere prøver kan kjøres i parallell; Imidlertid anbefales det at ikke mer enn 24 parallelle ekstraksjoner kjøres samtidig. Dette er spesielt viktig for protein utfellingstrinnet, hvor prøven må være kald for å sikre en tett pellet og går mer enn 24 prøver kan tillate pellets tid til å re-oppløse.
Protokollen som presenteres her er den mest kostnadseffektive metoden anses (se tabell 3). Mens denne protokollen gjør bruk reagenser fra Puregene utvinning kit, er et mindre volum enn anbefalt i Puregene protokollen som brukesuten at det går utvinning yield og det er denne reduksjonen i reagenser som driver kostnadsbesparelser i forhold til protokollen. Legg merke til at den beregnede kostnaden for utvinning bruker listepris for hvert element, og reflekterer ikke eventuelle rabatter. Kostnaden per ekstraksjon med den optimaliserte protokollen kan bli ytterligere redusert med bulk bestillinger eller rabatter gjennom selskapets salgsrepresentanter.
Bevis er også forutsatt at denne protokollen er egnet for bruk med neste generasjon sekvensering. De oppnådde data gir ytterligere bevis på nytten av spyttprøver for human genetikk forskning i mange sykdommer der blod er ikke rutinemessig tilgjengelig. Mens blod og cellelinje avledet DNA fortsetter å være den foretrukne kilde til genetisk materiale for testing, er hele spytt samling et levedyktig alternativ når slike kilder ikke er tilgjengelige, når pasienten påmelding er påvirket av sin samling eller blodprøvetaking ikke er tilgjengelig eller upraktisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) Solution | Fisher | 03-500-506 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
References
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
