Introduction
Opnåelse af DNA høj kvalitet til humane genetiske undersøgelser er afgørende i sygdomsgen opdagelse proces. Blod, men kræver en invasiv procedure, og er dyrere end spyt indsamling, foretrækkes til at skabe immortaliserede cellelinier som en uendelig kilde af DNA, eller iPSCs til funktionelle undersøgelser og undertiden blod DNA anvendes når cellelinjer er ikke tilgængelige. Men at få en blodprøve forudsætter en veluddannet bioanalytikeren og blod har en kortere halveringstid end spyt 1. DNA fra spyt er billigere og lettere at opnå, da det kan opsamles og sendes via e-mail uden behov for en bioanalytikeren og derved øge potentielle underlagt puljer langt ud over det opland af hospitaler og laboratorier 2. Undersøgelse indskrivning kan forbedres når motiverne har mulighed for at give en spyt prøve i stedet for blod 3, 4. Bekymringer om mængden og kvaliteten af DNA fra spyt kan have begrænset sin udbredte ose trods talrige undersøgelser nylige undersøgelser, der viser egnethed hele spyt, med et gennemsnit på 4,3 x 10 5 celler per milliliter, for DNA-test i løbet af de ældre buccale svaberprøver metoder, der ikke opnåede betydelige mængder af spyt 2, 3, 4, 5, 6. Selv en beskeden litteratur eksisterer viser egnetheden af hele spyt afledt DNA til genotypebestemmelse applikationer, herunder microarray-baserede metoder 8, 9, 10, har ingen undersøgelser undersøgt næste generation sekventering (NGS). Målet for at optimere hele denne spyt DNA-ekstraktion protokol var at maksimere kvantitet og kvalitet for genetik applikationer på en omkostningseffektiv måde, der er let gennemføres i laboratorier med fælles reagenser og hjælpematerialer.
DNA-ekstraktion fra spyt kræver flere procedurer: 1) indsamling og opbevaring, 2) cellelyse, 3) RNase behandling, 4) proteinudfældning, 5) ethanolfældning 6) DNA rehydrering. DNA stabilisering Bufferopløsning beskrevettidligere 2, fungerer tilstrækkeligt uden ændringer. Ingen forsøg på at optimere RNase behandling og DNA rehydrering trin blev foretaget. For hver af de resterende trin blev flere variabler, der kan påvirke udbyttet identificeret. Hver variabel blev manipuleret individuelt og forbedring af udbytte og kvalitet blev vurderet statistisk. For variabler, der blev vist at forbedre udbyttet og / eller DNA-kvalitet, blev de optimale værdier inkluderet i den endelige protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Før levere spytprøver alle fag gav informeret samtykke i overensstemmelse med de retningslinjer for behandling af humane fag på Nationwide Børnehospital.
1. Spyt Indsamling og opbevaring
- Forud for spyt samling, at emnet mund er fri for fødevarer eller andre fremmede stoffer ved at have emnet skylle munden med vand og undgå at spise eller drikke i 30 minutter før opsamling af prøven.
- Åbn et 15 ml centrifugeglas med 2,5 ml af DNA stabilisering buffer 2 og sørg for at undgå at berøre indersiden af hætten eller rør, og har emnet spytte 2,5 ml spyt i bufferen løsning. Bemærk: Indsamling mere end 2,5 ml spyt kan føre til prøve nedbrydning fra en utilstrækkelig forhold mellem prøve til DNA stabilisering buffer. Indsamling for lidt spyt vil reducere forventede afkast fra protokollen. At evaluere indsamling mængder, skal du bruge de nummererede stigninger på siden af than røret.
- Sæt hætten og bland ved inversion, indtil blandingen homogeniseres. Kraftig rystning er ikke nødvendig. Opbevar prøverne ved stuetemperatur til opbevaring kortsigtet eller 4 ° C i langtidsopbevaring (> 3 måneder).
2. indledende forberedelser og cellelyse
- Før igangsættelse af udvinding, varme et vandbad til 37 ° C, og forberede en ice bucket. Tre 15 ml koniske centrifugerør vil være behov for hver ekstraherede prøve. De tre rør vil blive anvendt til at holde cellen og proteinpellet den endelige ekstraheret gDNA, og isopropanol og ethanol supernatanter.
- Hent prøver fra opbevaring, og vend prøver flere gange derefter vortex ved middel hastighed i 15 sek.
- Dispensér 2,5 ml prøve i en ren 15 ml centrifugeglas, og der tilsættes 5 ml Cell Lysis Solution. Prøven blandes 50 gange ved inversion, og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
3. RNA-fjernelse
- Tilsæt 40 pi RNase A Solution på 100 mg / ml og inkuberes ved 37 ° C i 15 min.
- Fjern prøven fra 37 ° C vandbad og afkøles på is i 3 min.
- Efter RNase A inkubation øge temperaturen af vandbad til 65 ° C for DNA rehydratiseringstrinnet af protokollen.
4. Protein og lipid fjernelse
- Der tilsættes 50 ul af proteinase K opløsning på 20 mg / ml, bland flere gange ved inversion, og inkuberes ved stuetemperatur i mindst 30 minutter. Bemærk: Dette er en mulig pause punkt for protokollen. Efter tilsætning af Proteinase K Solution kan prøven opbevares ved 4 ° C indtil ekstraktion kan gennemføres. Opbevaring ved 4 ° C i op til 24 timer blev ikke vist sig at have en signifikant effekt på ekstraktionsudbytterne eller DNA kvalitet. Langsigtet opbevaring på nuværende tidspunkt er ikke blevet evalueret.
- Tilføj 1,7 ml proteinudfældning Solution, vortex kraftigt i 20 sekunder ved høj hastighed, og anbring på is i 10 min. Når prøverne er afkølet på is i 10 minutter, centrifugeres i 10 minutter ved 3000 x g og 4 ° C. De udfældede proteiner skal danne en tæt pille for at fortsætte. Hvis pellet ikke stramt eller opløsningen stadig er uklar, kan afkøles prøverne på is i 5 minutter mere og centrifugering gentages. Prøverne skal opbevares på is for at sikre en stram pille.
5. Isolering og oprensning af gDNA
- I en ren 15 ml centrifugerør, pipette 5 ml isopropanol og 8 pi ren glycogen opløsning på 20 mg / ml.
- Hæld supernatanten indeholdende gDNA fra trin 4.3 i røret med isopropanol og glykogen Solution, efterlader det bundfældede protein pellet. Når supernatanten er blevet tilsat, bland forsigtigt prøven 50 gange ved inversion og centrifugeres i 30 minutter ved 3000 x g og 4 ° C.
- Hæld supernatanten langsomt i et rent 15 ml rør. Efter fjernelse af supernatanten, tilsættes 1 ml 70% ethanol tilvask pellet ved langsomt at rokke og forsigtigt at bevæge ethanol over udfældede pellet flere gange. Fasthold ethanol i røret.
- Efter den første vask, centrifugeres prøven i 1 min ved 2.000 xg og 20 ° C. Denne centrifugeringstrin kan gøres på enten 4 ° C eller 20 ° C. Ingen signifikant effekt af temperatur er vist for dette skridt.
- Efter den første vask og centrifugering af pelleten, hældes langsomt ethanol vask fra røret og kasseres derefter udføre en anden vask ved at gentage trin 5.3 og 5.4.
- Efter fjernelse af supernatanten fra den anden vask skal pelleten lufttørre i 15 minutter.
- Hvis prøven ikke er helt tørt, lufttørre i yderligere 15 minutter.
6. Rehydrering af gDNA
- Når prøven er tørret, tilsættes 300 pi Tris-EDTA at rehydrere den tørrede gDNA pille.
- Vortex prøven i 5 sek ved middel hastighed og sted i en65 ° C varmt vandbad i 1 time.
- Fjern prøverne fra vandbadet og inkuberes O / N-ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Alle produkter og reagenser, der anvendes, er anført i Materialer tabel samt tabel 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme optimale parametre til DNA-ekstraktion af en række parrede DNA ekstraktioner blev udført. En enkelt spytprøve blev delt, og hver portion med en af to mulige værdier for en given variabel. Mindst otte gentagelser af hver parret test blev udført (fx blev en enkelt spytprøve alikvoter at teste ekstraktion både med og uden indledende 50 ° C inkubation). Optimering var baseret på fire standard målinger: total DNA udbytte, den 260/280 værdi, 260/230 værdi, og visuel inspektion af elektroforesebehandlede DNA til at vurdere fragmentering. Ikke alle mulige kombinationer af de variabler blev vurderet statistiske interaktioner (N = 169 kombinationer), vælger i stedet for at vurdere den marginale virkning af hver variabel individuelt. Virkninger blev testet ved hjælp af en multi-vejs gentagne forholdsregler ANOVA og estimerede effekter blev afledt fra den tilsvarende regressionsligning. Alle væsentlige virkninger er sammenfattet i tabel 1, er vist som averændring alder i udbytte (ng / ul pr ml spyt input) eller DNA-kvalitet (260/280 og 260/230).
Cellelyse (trin 2) blev optimeret ved at vurdere: 1) tilstedeværelsen / fraværet af en 50 ° C inkubation (1 time) forud for cellelyse at sikre, at proteinase K nedbrydning og cellelysis medieret af Opbevaringspufferen gik til færdiggørelse, 2 ) tilstedeværelse / fravær af en homogenisering ved hvirvelbehandling trin (medium hastighed, 15 sekunder), og 3) lyseopløsning inkubationstid (5 versus 30 min). 30 min cellelysering inkubation øget udbytte med et gennemsnit på 3,5% (p <.01), men ingen andre cellelyse variabel haft en betydelig effekt på udbyttet. Vortexing faldt 260/280 forholdet ved en statistisk signifikant (p <0,001), men næsten små 0,03.
Proteinudfældning (trin 4) indledes med proteinase K fordøjelse at forstyrre aminosyrekæder, forbedre proteinudfældning effektivitet og frigive indfanget DNA. Mængden af proteinase K blev varieret tifoldigt.Centrifugering temperatur blev reduceret fra 20 ° C til 4 ° C. Forøgelse af mængden af proteinase K forårsagede en statistisk signifikant fald i udbytte (8,7%) og også lidt forbedrede både 260/280 og 260/230 ratio.
Ethanoludfældning (trin 5) var den sidste etape af protokollen undersøgt. Mængden af glycogen bærer (0, 8 ul) blev varieret, var samlede centrifugering tid (5 versus 30 min 11). Kun centrifugering tid påvirket væsentligt udbytte, med en gennemsnitlig stigning på 290%. Jo længere tur faldt også 260/280 forholdet en anelse (0,05). Ingen signifikant effekt af glykogen på udbyttet blev observeret i forsøgene; om den samlede mængde DNA i disse ekstraktioner var så store, at glykogen ikke vil typisk blive anvendt. Trods den manglende effekt i disse prøver, er det stadig anbefales at bruge glykogen at minimere risikoen for nedsat udbytte, når spyt input volumen er lavere end angivet her, eller hvis there er nogen anden grund til at tro udbytte vil være lav.
Visuel inspektion af de repræsentative DNA-prøver (figur 1) viste, at den ekstraherede DNA ikke var stærkt fragmenteret til enhver spyt DNA ekstraktionsproceduren, men viste en passende høj molekylvægt bånd uden udtværing vejledende af nedbrudte DNA. Efter RNase A fordøjelse, protokollen gennemsnitligt produceret 260/280 på 1,74.
Figur 1. Kvaliteten af spyt afledt DNA. Fire ekstraktionsprocedurer blev anvendt til samme spyt samling. (A) Prøver blev elektroforeret på en 0,8% agarosegel (250 ng DNA). Alle variationer af spyt DNA ekstraktionsprotokoller resultere i høj molekylvægt (> 20 kb) DNA, uden tegn på nedbrydning. Lane: 1-DNA ladder, 2 & 3 Oragene prepIT L2P protokol prøver, 4 & 5 Gentra Puregene kropsvæsker Protocol, 6 & 7 den optimerede protokol uden RNA-fjernelse trin, 8 & 9 den optimerede protokol med RNA fjern trin. Banerne 2-7 er direkte analoge protokoller på samme spytprøver. Banerne 8 & 9 viser, at trin-RNA fjernelse den ikke indfører DNA-nedbrydning. (B) Prøver blev underkastet elektroforese på en 2% agarosegel (150 ng DNA). En lille RNA top observeres nær bunden af gelen i bane 2 gennem 7 (konventioner som ovenfor). Banerne 8 & 9 viser effektiviteten af trin-RNA fjernelse af.
RNA-fjernelse (trin 3 med RNase A) er afgørende for nøjagtig kvantificering af DNA. Under testen blev konsekvent højt indhold RNA observeret, som bestemt ved forholdet mellem dobbeltstrenget DNA til RNA målt ved en qubit 2,0 Fluorometer. I gennemsnit nukleinsyre indhold fra prøver uden RNase bestod En behandling på 46,6% (± 0,4) RNA. Prøver, der undergik RNA fjernelse Trin læses som "<20 ng / ml", som er den lavest mulige læsning for qubit'en RNA detektion.
DNA opnås gennem denne optimerede protokol var af tilstrækkelig kvalitet til high throughput sekventering, når de supplerende RNase A trin blev anvendt. For at opnå målrettede resekventering data blev en brugerdefineret Agilent SureSelect Target Berigelse kit anvendt på 24 prøver, der er målrettet 2,6 Mb sekvens. High throughput sekventering blev udført på 12 stregkoder (indekseret) prøver pr vognbane. Sekvens læser blev BWA-tilpasset til hg19 henvisningen genom 12, så anvendelsen af GATK 13 basen kvalitet score rekalibrering, Indel kursjustering, to eksemplarer fjernelse, SNP opdagelse og genotypebestemmelse samtidigt i alle 24 prøver blev udført ved hjælp af den bedste praksis hårdt filtrering parameterværdier 14. Alle 24 prøver gav høj kvalitet NGS data (Tabel 2). Af læser, der passerede Illumina standardbetingelser filtre og havde Q> 20, 91,4% tilpasset til de sekvens berigelse målområder, der giver et gennemsnit på target dækning dybde> 30x dækning på Q> 100, godt inden for de nødvendige grænser for sjældne SNP opdagelse i hver prøve. Den gennemsnitlige streng balance var 49,9%. Sammenligning variant opkald med Illumina microarray genotyper gav en konkordans på 98,9%.
| Kandidat Variabel | ng / ul | 260/280 | 260/230 |
| Vortex | ns | -0.03 *** | ns |
| x30 min cellelyse Inkubation | 3,5% ** | ns | ns |
| Proteinase K x10 | -8.7% * | -0.05 *** | -0.03 *** |
| 30 min centrifugering | 290,2%*** | -0.05 *** | ns |
| Glykogen | ns | ns | -0.37 *** |
Tabel 1. Effekt størrelse Optimeret Variabel på kvantitet / kvalitet Metrics. Alle effekt størrelser er i de enheder, der er opført i kolonneoverskriften. p-værdier fra ANOVA: * p <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001; ns ikke signifikant
| Quality Metric | Værdi |
| Target længde | 1.708 kb |
| Target Overdækket> 30x | 85.22% |
| SNPs i dbSNP | 92,55% |
| Array aftale | 98,99% |
Tabel 2. Kvaliteten af højkapacitets-sekvensen fra Target berigelse.
| Nyt Optimeret protokol | Vare | Distributer | Katalog # | Indkøb Enhed | Omkostninger / enhed | Omkostninger / Indsamling |
| 15 ml centrifugerør | Fisher | 12-565-268 | 500 Rør | $ 233,50 | 3,2690 dollar | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | 1 l | $ 401,00 | 3,2080 dollar | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | 1 g | $ 713,00 | 1,5686 dollar | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | 350 ml | $ 350,00 | 2,7200 dollar | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | Tilfælde af 4 x 4 L | $ 486,71 | $ ,2434 | |
| Glykogen Solution (20 mg / ml) | EZ-Bioresearch | S1003 | 1 ml | $ 51,00 | $ ,8160 | |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | Tilfælde af 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ ,0325 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | 1 l | $ 68,67 | $ ,0412 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | 1 kg | $ 34,65 | $ 0.000004 | |
| Tris-HCI | Fisher | BP1757-100 | 100 ml | $ 57,84 | $ ,0116 | |
| EDTA (0,5 M) Løsning | Fisher | 03-500-506 | 100 ml | $ 33,60 | $ ,0134 | |
| Natrium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | 100 g | $ 59,95 | $ ,0060 | |
| Total Cost | $ 11,93 | |||||
| Oragene | Vare | Distributer | Katalog # | Indkøb Enhed | Omkostninger / enhed | Omkostninger / Indsamling |
| 15 ml centrifugerør | Fisher | 12-565-268 | 500 Rør | $ 233,50 | $ ,9340 | |
| 100% ethanol | Fisher | BP2818-100 | 100 ml | $ 34,29 | 1,6459 dollar | |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | Tilfælde af 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ ,0081 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | 1 l | $ 68,67 | $ ,0687 | |
| 1,5 ml rør | Genesee | 22-281A | 500 Rør | $ 22,85 | $ ,0457 | |
| Oragene opsamlingskittet | Oragene | OG-500 | 1 | $ 25,00 | $ 25,00 | |
| Total Cost | $ 27,70 | |||||
| Puregene | Vare | Distributer | Katalog # | Indkøb Enhed | Omkostninger / enhed | Omkostninger / Indsamling |
| 15 ml centrifugerør | Fisher | 12-565-268 | 500 Rør $ 233,50 | $ ,9340 | ||
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | 1 l | $ 401,00 | 4,0100 dollar | |
| Proteinase K | Qiagen | 158918 | 650 ml | $ 73,10 | 7,8723 dollar | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | 350 ml | $ 350,00 | 4,0000 dollar | |
| Isopropanol | Fisher | A4164 | Tilfælde af 4 x 4 L | $ 486,71 | $ ,3650 | |
| Glykogen Solution | Qiagen | 158930 | 500 ml | $ 64,30 | 2,5720 dollar | |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | Tilfælde af 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ ,0975 | |
| DNA hydratiseringsopløsningen | Qiagen | 158914 | 100 ml | $ 69,80 | $ ,1396 | |
| NaCl | Fisher | AC19409-0010 | 1 kg | $ 34,65 | $ 0.000004 | |
| Tris-HCI | Fisher | BP1757-100 | 100 ml | $ 57,84 | $ ,0116 | |
| EDTA (0,5 M) Løsning | Fisher | 03-500-506 | 100 ml | $ 33,60 | $ ,0134 | |
| Natriumdodecylsulfat- | Fisher | BP166-100 | 100 g | $ 59,95 | $ ,0060 | |
| Total Cost | $ 19,99 |
Tabel 3. Omkostninger sammenligning af den optimerede protokol til at ekstrahere DNA fra 2 ml spyt med andre kommercielt tilgængelige protokoller. Alle reagenser og hjælpematerialer, der kræves for DNA-ekstraktion er blevet vurderet ved hjælp af standard listepriser tilgængelige på internettet fra den 30. september 2013 Bemærk, at denne protokol er skrevet for at udtrække DNA fra 1,25 ml spyt (dvs. 2,5 ml spyt og buffer , se trin 2.3) som denne værdi udgør halvdelen af det samlede volumen i spyt opsamlingsrør. For omkostningerne sammenligning blev 2 ml valgt som det er beløb i forbindelse med en fælles kommercielt tilgængeligt kit (Oragene).
| DNA-stabilisering buffer (250 ml) | ||
| Komponent | Volumen (ml) | [Sidste] |
| 1 M NaCI | 1,461 g | 0,1 M |
| Tris-HCI | 2.5 | 0,01 M |
| 0.5M EDTA | 5 | 0,01 M |
| 10% SDS | 12.5 </ Td> | 0,014 M |
| Proteinase K opløsning (20 mg / ml) | 2.5 | 6.92x10 -6 M |
| Hedeselskabet 2 O | 227,5 | |
| Proteinase K opløsning (20 mg / ml) | ||
| Komponent | Volumen (ml) | [Sidste] |
| Proteinase K pulver | 500 mg | 6.92x10 -4 M |
| Hedeselskabet 2 O | 25 | |
| 70% ethanol (500 ml) | ||
| Komponent | Volumen (ml) | [Sidste] |
| Ethanol 95% | 368,5 | 12.63 M |
| Hedeselskabet 2 O | 131,5 | |
Tabel 4. Opskrifter til reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende fremgangsmåde er et optimeret DNA-ekstraktion protokol, der har betydeligt forbedret udbytte af DNA med høj molekylvægt i forhold til standard metoder, uden at kompromittere DNA-kvalitet. Det kritiske trin med den største effekt på udbyttet mest var trin 5.2, som indeholder en længere skridt centrifugering under ethanoludfældning end nogen publicerede protokol revideret her, medmindre der blev ikke udbredt 11. Ingen ændringer i DNA-kvalitet, der er forbundet med dette længere centrifugering blev opdaget, hvilket indikerer, at de fleste af de tilgængelige DNA fra hele spyt samling er ikke nedbrudt og høj molekylvægt.
Hele spyt samling har begrænsninger i stikprøven kvalitet, såsom muligheden for udenlandske forureninger, som skal minimeres ved indsamlingen at, og tilstedeværelsen af overdreven protein i prøven, som kan være et tegn på en underliggende infektion. Store mængder protein eller udenlandske forurenende stoffer kanforbliver i den endelige ekstraherede DNA hvorved kvantificering unøjagtige. Hvis der er resterende proteiner eller forurenende stoffer efter rehydrering (trin 6) der er mistanke om en prøve rydde op kan udføres ved at starte på proteinudfældning skridt med reagenser skalerede at afspejle prøve input volumen mængder. En anden begrænsning af protokollen er den tid, der kræves for at udføre trinene. Flere prøver kan løbe parallelt; Det anbefales dog, at der ikke mere end 24 parallelle ekstraktioner køres samtidigt. Dette er især vigtigt for proteinet udfældningstrinnet, hvor prøven skal forblive kold for at sikre en stram pellet og køre mere end 24 prøver kan give pellets tid til at genopløse.
Protokollen præsenteres her, er den mest omkostningseffektive metode overvejes (se tabel 3). Mens denne protokol omfatter reagenser fra Puregene udvinding kit, er et mindre volumen end anbefalet i Puregene anvendte protokoluden at kompromittere udvinding udbytte, og det er denne reduktion i reagenser, der driver omkostningsbesparelser i forhold til protokollen. Bemærk, at de beregnede omkostninger til ekstraktion bruger prislisten for hvert element og afspejler ikke eventuelle rabatter. Omkostningerne pr ekstraktion med den optimerede protokol kan yderligere med bulk ordrer eller rabatter reduceres gennem virksomhedens sælgere.
Beviser er også blevet forudsat at denne protokol er egnet til brug med næste generation sekventering. De opnåede data giver yderligere bevis for nytten af spytprøver for human genetik forskning i mange sygdomme, hvor blodet er ikke rutinemæssigt til rådighed. Mens blod og cellelinje afledt DNA fortsætter med at være den foretrukne kilde til genetisk materiale til test, hele spyt samling er et levedygtigt alternativ, når sådanne kilder ikke er tilgængelige, når patientrekruttering er påvirket af deres samling eller tapning ikke er tilgængelig eller upraktisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) Solution | Fisher | 03-500-506 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
References
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
