Introduction
Ottenere DNA di alta qualità per gli studi genetici umani è essenziale nel processo di scoperta del gene della malattia. Sangue, anche se richiede una procedura invasiva e anche di essere più costoso di raccolta della saliva, è favorito per la creazione di linee cellulari immortalizzate come una fonte infinita di DNA, o iPSCs per studi funzionali, e, talvolta, il DNA del sangue viene utilizzato quando le linee cellulari non sono disponibili. Tuttavia, il prelievo di sangue richiede un flebotomo addestrato e il sangue ha una emivita più breve di saliva 1. DNA dalla saliva è meno costoso e più facile da ottenere, dal momento che può essere raccolto e inviato attraverso la posta elettronica, senza la necessità di un flebotomo, aumentando così i potenziali soggetti piscine ben oltre il bacino di utenza di ospedali e laboratori 2. Studio iscrizione può essere migliorata quando i soggetti hanno la possibilità di dare un campione di saliva al posto del sangue 3, 4. Preoccupazioni circa la quantità e la qualità del DNA dalla saliva possono aver limitato la sua diffusione di noie nonostante i numerosi studi recenti studi che mostrano l'idoneità di tutta la saliva, con una media di 4,3 x 10 5 cellule per millilitro, per il test del DNA rispetto ai più tamponi buccali metodi che non abbiano conseguito notevoli quantità di saliva 2, 3, 4, 5, 6. Mentre una modesta letteratura esistente che mostra l'idoneità di tutta la saliva DNA derivato per le applicazioni di genotipizzazione compresi i metodi basati su microarray 8, 9, 10, nessuno studio ha esaminato sequenziamento di nuova generazione (NGS). L'obiettivo di ottimizzare l'intero protocollo di estrazione del DNA della saliva è stato quello di massimizzare la quantità e la qualità per le applicazioni della genetica in un modo economicamente efficace che può essere facilmente implementato in laboratorio con reagenti e materiali di consumo comuni.
Estrazione del DNA dalla saliva richiede diverse procedure: 1) raccolta e conservazione, 2) la lisi cellulare, 3) trattamento RNasi, 4) la precipitazione delle proteine, 5) precipitazione in etanolo, 6) reidratazione del DNA. La soluzione di DNA Stabilizzazione tampone, descrittoin precedenza 2, funzioni adeguatamente senza alterazione. Nessun tentativo di ottimizzare il trattamento RNasi e DNA fasi di reidratazione è stata fatta. Per ogni passo rimanente, diverse variabili che potrebbero influenzare il rendimento sono stati identificati. Ogni variabile è stato manipolato individualmente e miglioramento della resa e la qualità è stata valutata statisticamente. Per le variabili che sono stati mostrati per migliorare il rendimento e / o la qualità del DNA, i valori ottimali sono stati inclusi nel protocollo finale.
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Protocol
NOTA: Prima di fornire campioni di saliva tutti i soggetti hanno dato il consenso informato conforme alle linee guida per il trattamento di soggetti umani all'ospedale dei bambini a livello nazionale.
1 Saliva Raccolta e conservazione
- Prima della raccolta della saliva, assicurarsi che la bocca del soggetto è libero di cibo o altre sostanze estranee avendo il soggetto sciacquare la bocca con acqua ed evitando di mangiare o bere per 30 minuti prima di raccogliere il campione.
- Aprire una provetta da centrifuga da 15 ml con 2,5 ml di tampone di DNA stabilizzazione 2 avendo cura di evitare di toccare l'interno del tappo o il tubo, e hanno il soggetto sputare 2,5 ml di saliva nella soluzione tampone. Nota: Raccolta di oltre 2,5 ml di saliva può portare al degrado del campione da un rapporto di insufficiente di campione di tampone di stabilizzazione del DNA. Raccolta troppo poco di saliva riduce i rendimenti attesi dal protocollo. Per valutare i volumi di raccolta, utilizzare i gradienti numerati sul lato di tegli tubo.
- Rimettere il tappo e miscelare per inversione fino a quando la miscela è omogeneizzato. Agitazione vigorosa non è necessario. Conservare i campioni a temperatura ambiente per la conservazione a breve termine o 4 ° C per la conservazione a lungo termine (> 3 mesi).
2. Preparazioni iniziali e lisi cellulare
- Prima di iniziare l'estrazione, riscaldare a bagnomaria a 37 ° C, e preparare un secchio di ghiaccio. Saranno necessari tre provette da 15 ml per centrifuga coniche per ogni campione estratto. I tre tubi saranno utilizzati per contenere il cellulare e proteine pellet, la finale estratto gDNA, e le isopropanolo ed etanolo surnatanti.
- Recupera campioni di stoccaggio, e campioni di invertire tempi diversi poi vortice a media velocità per 15 secondi.
- Dispensare 2.5 ml di campione in un ambiente pulito 15 ml tubo da centrifuga, e aggiungere 5 ml di Cell Lysis Solution. Mescolare il campione 50 volte per inversione, e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
3. RNA rimozione
- Aggiungere 40 ml di RNasi A Solution a 100 mg / ml, e incubare a 37 ° C per 15 min.
- Togliere il campione dal bagno di 37 ° C e acqua fredda su ghiaccio per 3 min.
- Dopo l'incubazione RNasi A, aumentare la temperatura del bagno d'acqua a 65 ° C per la fase di reidratazione DNA del protocollo.
4. Proteine e lipidi di rimozione
- Aggiungere 50 ml di soluzione di proteinasi K a 20 mg / ml, mescolare più volte per inversione, e incubare a temperatura ambiente per un minimo di 30 min. Nota: Questo è un possibile punto di pausa per il protocollo. Dopo l'aggiunta della soluzione di proteinasi K, il campione può essere conservato a 4 ° C fino al momento dell'estrazione può essere completata. Conservare a 4 ° C per un massimo di 24 ore non è stato dimostrato di avere un effetto significativo sui rendimenti di estrazione o la qualità del DNA. Stoccaggio a lungo termine in questa fase non è stata valutata.
- Aggiungere 1,7 ml di proteina Precipitazione Solution, mescolare vigorosamente nel vortex per 20 secondi ad alta velocità, e posto in ghiaccio per 10 min. Una volta che i campioni sono raffreddati in ghiaccio per 10 minuti, centrifugare per 10 minuti a 3000 xg e 4 ° C. Le proteine precipitate devono formare un pellet stretto per continuare. Se il pellet non è stretto o la soluzione è ancora torbida, i campioni possono essere raffreddati in ghiaccio per 5 minuti di più e centrifugazione ripetuti. I campioni devono essere tenuti in ghiaccio per garantire un pellet stretto.
5. isolamento e la purificazione di gDNA
- In un ambiente pulito 15 ml tubo da centrifuga, pipetta 5 ml di isopropanolo e 8 ml di puro Soluzione glicogeno a 20 mg / ml.
- Versare il surnatante contenente il gDNA dal punto 4.3 nella provetta contenente la soluzione di isopropanolo e glicogeno, lasciando dietro di sé la proteina pellet precipitato. Una volta aggiunto il surnatante, mescolare delicatamente il campione di 50 volte per inversione e centrifugare per 30 minuti a 3000 xg e 4 ° C.
- Versare lentamente il surnatante in una provetta pulita 15 ml. Dopo la rimozione del surnatante, aggiungere 1 ml di etanolo al 70% perlavare il pellet lentamente a dondolo e spostando delicatamente la etanolo sopra il pellet precipitato più volte. Conservare l'etanolo nel tubo.
- Dopo il lavaggio iniziale, centrifugare il campione per 1 min a 2.000 xg e 20 ° C. Questa fase di centrifugazione può essere fatta sia a 4 ° C o 20 ° C. Nessun effetto significativo della temperatura è stato dimostrato per questo passo.
- Dopo il lavaggio iniziale e la centrifugazione del pellet, versare lentamente il lavaggio etanolo dal tubo ed eliminare, quindi eseguire un secondo lavaggio ripetendo i punti 5.3 e 5.4.
- Dopo la rimozione del supernatante dal secondo lavaggio, permettere il pellet asciugare all'aria per 15 min.
- Se il campione non si è completamente asciugato, aria secca per altri 15 min.
6. reidratazione di gDNA
- Una volta che il campione si è asciugato, aggiungere 300 ml di Tris-EDTA per reidratare il pellet gDNA secca.
- Vortex il campione per 5 secondi a velocità media e posto in un65 ° C in bagno di acqua calda per 1 ora.
- Rimuovere i campioni dal bagnomaria e incubare O / N a RT.
NOTA: Tutti i prodotti ei reagenti utilizzati sono elencati nella tabella dei materiali, così come Tabella 4.
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Representative Results
Per determinare i parametri ottimali per il DNA estrazione è stata effettuata una serie di estrazioni di DNA appaiati. Un singolo campione di saliva è stato diviso e ogni porzione sottoposta a uno dei due valori possibili per un dato variabile. Almeno otto repliche di ciascun test accoppiato state eseguite (ad esempio, un singolo campione di saliva è stato aliquotato per testare l'estrazione con e senza iniziale 50 ° C incubazione). L'ottimizzazione è basata su quattro metriche standard: rendimento totale del DNA, il valore di 260/280, il valore di 260/230, e ispezione visiva del DNA elettroforesi per valutare la frammentazione. Non tutte le combinazioni possibili delle variabili sono state valutate le interazioni statistiche (N = 169 combinazioni), optando invece per valutare l'effetto marginale di ogni variabile individualmente. Gli effetti sono stati testati utilizzando un multi-way misure ripetute ANOVA ed effetti stimati sono stati ricavati dalla equazione di regressione equivalente. Tutti gli effetti significativi sono riassunti nella Tabella 1, indicato come Avercambiamento età del rendimento (ng / ml per ml di ingresso saliva) o la qualità del DNA (260/280 e 260/230).
Lisi cellulare (fase 2) è stato ottimizzato valutando: 1) la presenza / assenza di una incubazione a 50 ° C (1 ora) prima della lisi cellulare per garantire che proteinasi K degradazione e lisi cellulare mediata dal buffer di memorizzazione andato a completamento, 2 ) presenza / assenza di una omogeneizzazione vortex passo (velocità media, 15 sec), e 3) tempo di soluzione di lisi di incubazione (5 vs 30 min). Il 30 min lisi cellulare incubazione aumentato la resa in media del 3,5% (p <.01), ma nessuna altra variabile lisi cellulare ha avuto un effetto significativo sulla resa. Vortex diminuito il rapporto 260/280 da un aumento statisticamente significativo (p <.001), ma praticamente piccolo 0.03.
Proteine precipitazioni (fase 4) è preceduta da proteinasi K digestione di interrompere le catene di aminoacidi, migliorando l'efficienza precipitazione delle proteine e rilasciando catturato il DNA. La quantità di proteinasi K era vario dieci volte.Temperatura di centrifugazione è stato ridotto da 20 ° C a 4 ° C. Aumentando la quantità di proteinasi K ha causato una riduzione statisticamente significativa del rendimento (8,7%), e anche un po 'migliorato sia i rapporti di 260/280 e 260/230.
Etanolo precipitazioni (punto 5) è stata l'ultima tappa del protocollo in esame. La quantità di glicogeno vettore (0, 8 ml) era varia, come è stato il tempo di centrifugazione totale (5 vs 30 min 11). Solo il tempo di centrifugazione influenzato significativamente la resa, con un incremento medio del 290%. Lo spin è più diminuito anche il rapporto leggermente (0.05) 260/280. Nessun effetto significativo del glicogeno sul rendimento è stato osservato durante gli esperimenti; se la quantità totale di DNA in queste estrazioni era sufficientemente grande che glicogeno non sarebbe usato tipicamente. Nonostante la mancanza di effetto in questi campioni, è ancora consiglia di utilizzare il glicogeno per ridurre al minimo il rischio di una diminuzione della resa ogni volta che saliva volume di ingresso è inferiore qui o se ther determinatoe è un altro motivo di credere rendimento sarà basso.
Ispezione visiva dei campioni di DNA rappresentativi (Figura 1) ha indicato che il DNA estratto non è stato molto frammentato per qualsiasi procedura di estrazione del DNA della saliva, ma piuttosto mostrato un gruppo ad alto peso molecolare appropriato senza sbavature indicativo di DNA degradato. Dopo RNase A digestione, il protocollo ha prodotto una media di 260/280 1.74.
Figura 1 Qualità della saliva DNA derivato. Quattro procedure di estrazione sono stati applicati alla stessa collezione saliva. (A) I campioni sono stati elettroforesi su gel di agarosio al 0,8% (250 ng DNA). Tutte le variazioni dei protocolli di estrazione del DNA saliva provocano alto peso molecolare (> 20 kb) DNA, senza evidenza di degradazione. Lane: 1 ladde DNAr, 2 e 3 campioni Oragene prepIT L2P protocollo, 4 e 5 Gentra Puregene fluidi corporei protocollo, 6 e 7 del protocollo ottimizzato senza fase di rimozione RNA, 8 e 9 del protocollo ottimizzato con il passo RNA rimozione. Lanes 2-7 sono direttamente protocolli analoghi sugli stessi campioni di saliva. Corsie 8 e 9 mostrano che la fase di rimozione RNA non introduce degradazione del DNA. (B) I campioni sono stati sottoposti ad elettroforesi su un gel di agarosio al 2% (150 ng di DNA). Un leggero picco RNA è osservabile in prossimità del fondo del gel in corsia 2 a 7 (convenzioni come sopra). Corsie 8 e 9 mostrano l'efficacia della fase di rimozione dell'RNA.
Il Passo RNA rimozione (punto 3 con RNasi A) è fondamentale per la quantificazione precisa del DNA. Durante il test, costantemente elevato contenuto di RNA è stata osservata, come determinato dal rapporto di DNA a doppio filamento di RNA misurata da un qubit 2.0 Fluorometer. Su, il contenuto medio di acido nucleico da campioni senza RNase Un trattamento consisteva di 46,6% (± 0,4) RNA. I campioni sottoposti Passaggio RNA rimozione letta come "<20 ng / ml", che è la lettura più bassa per la rilevazione di RNA del Qubit.
Il DNA ottenuto attraverso questo protocollo ottimizzato era di qualità sufficiente per alta sequenziamento quando il RNase Un passo ulteriore è stato applicato. Per ottenere i dati resequencing mirati, un kit Agilent SureSelect target Enrichment personalizzato è stato applicato a 24 campioni, il targeting 2.6 Mb di sequenza. Alta velocità di sequenziamento è stato condotto su 12 con codice a barre (indicizzati) campioni per corsia. Sequenza di legge sono stati BWA-allineato al genoma di riferimento hg19 12, quindi l'applicazione di qualità GATK 13 Base punteggio ricalibrazione, Indel riallineamento, rimozione duplicati, la scoperta e genotipizzazione SNP contemporaneamente in tutti i 24 campioni è stata effettuata utilizzando il parametro migliore prassi di filtraggio dura Valori 14. Tutti i 24 campioni hanno prodotto di alta qualità NGS dati (Tabella 2). Di letture che passavano Illumina di filtri standard e aveva Q> 20, 91,4% allineata alle regioni di destinazione sequenza di arricchimento, fornendo una profondità media on-target copertura> 30x copertura a Q> 100, ben entro i limiti necessari per la scoperta di SNP rara in ogni campione. Il saldo medio filone è del 49,9%. Confrontando le chiamate variante con Illumina genotipi microarray ha prodotto una concordanza del 98,9%.
| Variabile Candidato | ng / ml | 260/280 | 260/230 |
| Vortice | ns | -0.03 *** | ns |
| X30 min cellulare Lysis Incubazione | 3,5% ** | ns | ns |
| Proteinasi K x10 | -8,7% * | -0.05 *** | -0.03 *** |
| 30 min di spin | 290,2%*** | -0.05 *** | ns |
| Glicogeno | ns | ns | -0.37 *** |
Tabella 1 Effetto Dimensione variabile ottimizzato sulla quantità / qualità metrica. Tutte le misure sono in effetti le unità elencate nella colonna. p-value di ANOVA: * p <.05; ** P <.01; *** P <.001; ns non significativo
| Quality Metric | Valore |
| Lunghezza di destinazione | 1.708 kb |
| Obiettivo coperto> 30x | 85.22% |
| SNPs in dbSNP | 92.55% |
| Accordo Array | 98.99% |
Tabella 2 Qualità High Throughput Sequenza da Target Enrichment.
| Nuovo protocollo ottimizzato | Voce | Distributore | Catalog # | Unità Acquisti | Costo / Unità | Cost / Collezione |
| 15 ml centrifuga Provette | Pescatore | 12-565-268 | 500 Tubi | $ 233,50 | 3,2690 dollari | |
| Cella Lysis Solution | Qiagen | 158.908 | 1 L | $ 401,00 | 3,2080 dollari | |
| Proteinasi K | Sigma | P6556 | 1 g | $ 713,00 | 1,5686 dollari | |
| Proteine Precipitazione Soluzione | Qiagen | 158.912 | 350 ml | $ 350,00 | 2,7200 dollari | |
| Isopropanolo | Pescatore | A416-4 | Caso di 4 x 4 L | $ 486,71 | 0,2434 dollari | |
| Il glicogeno Solution (20 mg / ml) | EZ-Bioresearch | S1003 | 1 ml | 51,00 dollari | 0,8160 dollaro | |
| 70% etanolo | Pescatore | 04-355-305 | Caso di 4 x 1 gal. | $ 123,03 | 0,0325 $ | |
| Tris-EDTA (TE) | Pescatore | BP2473-1 | 1 L | 68,67 dollari | $ 0,0412 | |
| NaCl | Pescatore | AC194090010 | 1 kg | 34,65 dollari | $ 0.000004 | |
| Tris HCl | Pescatore | BP1757-100 | 100 ml | 57,84 dollari | 0,0116 dollari | |
| EDTA (0.5 M) Soluzione | Pescatore | 03-500-506 | 100 ml | 33,60 dollari | 0,0134 dollari | |
| Sodio Dodecyl Sulfate | Pescatore | BP166-100 | 100 g | 59,95 dollari | 0,0060 dollari | |
| Costo totale | 11,93 dollari | |||||
| Oragene | Voce | Distributore | Catalog # | Unità Acquisti | Costo / Unità | Cost / Collezione |
| 15 ml centrifuga Provette | Pescatore | 12-565-268 | 500 Tubi | $ 233,50 | 0,9340 dollari | |
| 100% di etanolo | Pescatore | BP2818-100 | 100 ml | 34,29 dollari | 1,6459 dollari | |
| 70% etanolo | Pescatore | 04-355-305 | Caso di 4 x 1 gal. | $ 123,03 | 0,0081 dollari | |
| Tris-EDTA (TE) | Pescatore | BP2473-1 | 1 L | 68,67 dollari | 0,0687 dollari | |
| Provetta da 1,5 ml | Genesee | 22-281A | 500 Tubi | 22,85 dollari | $ 0,0457 | |
| Oragene Collection KIT | Oragene | OG-500 | 1 | 25,00 dollari | 25,00 dollari | |
| Costo totale | 27,70 dollari | |||||
| Puregene | Voce | Distributore | Catalog # | Unità Acquisti | Costo / Unità | Cost / Collezione |
| 15 ml centrifuga Provette | Pescatore | 12-565-268 | 500 Tubi $ 233,50 | 0,9340 dollari | ||
| Cella Lysis Solution | Qiagen | 158.908 | 1 L | $ 401,00 | 4,0100 dollari | |
| Proteinasi K | Qiagen | 158918 | 650 ml | 73,10 dollari | 7,8723 dollari | |
| Proteine Precipitazione Soluzione | Qiagen | 158.912 | 350 ml | $ 350,00 | 4,0000 dollari | |
| Isopropanolo | Pescatore | A4164 | Caso di 4 x 4 L | $ 486,71 | $ 0,3650 | |
| Glicogeno Soluzione | Qiagen | 158930 | 500 ml | 64,30 dollari | 2,5720 dollari | |
| 70% etanolo | Pescatore | 04-355-305 | Caso di 4 x 1 gal. | $ 123,03 | 0,0975 dollari | |
| DNA Idratazione Soluzione | Qiagen | 158.914 | 100 ml | 69,80 dollari | 0,1396 dollari | |
| NaCl | Pescatore | AC19409-0010 | 1 kg | 34,65 dollari | $ 0.000004 | |
| Tris HCl | Pescatore | BP1757-100 | 100 ml | 57,84 dollari | 0,0116 dollari | |
| EDTA (0.5 M) Soluzione | Pescatore | 03-500-506 | 100 ml | 33,60 dollari | 0,0134 dollari | |
| Dodecil solfato di sodio | Pescatore | BP166-100 | 100 g | 59,95 dollari | 0,0060 dollari | |
| Costo totale | 19,99 dollari |
Tabella 3 Confronto dei costi del protocollo ottimizzato per estrarre il DNA da 2 ml di tutta la saliva con altri protocolli disponibili in commercio. All reagenti e materiali di consumo necessari per l'estrazione del DNA sono stati valutati utilizzando normali prezzi di listino sono disponibili su internet al 30 settembre, 2013 Nota che questo protocollo è stato scritto per estrarre il DNA da 1,25 ml di tutta la saliva (ad esempio, 2,5 ml di tampone di saliva e , vedere il punto 2.3) in quanto questo valore rappresenta la metà del volume totale del tubo di raccolta della saliva. Per il confronto dei costi, 2 ml è stato scelto in quanto questa è la quantità associata con un kit disponibile in commercio comune (Oragene).
| DNA Stabilizzazione Buffer (250 ml) | ||
| Componente | Volume (ml) | [Finale] |
| 1 M NaCl | 1.461 g | 0.1 M |
| Tris HCl | 2.5 | 0,01 M |
| 0.5M EDTA | 5 | 0,01 M |
| 10% SDS | 12.5 </ Td> | 0.014 M |
| Proteinasi K Solution (20 mg / ml) | 2.5 | 6.92x10 -6 M |
| DDH 2 O | 227.5 | |
| Proteinasi K Solution (20 mg / ml) | ||
| Componente | Volume (ml) | [Finale] |
| Proteinasi K in polvere | 500 mg | 6.92x10 -4 M |
| DDH 2 O | 25 | |
| 70% etanolo (500 ml) | ||
| Componente | Volume (ml) | [Finale] |
| Etanolo 95% | 368,5 | 12.63 M |
| DDH 2 O | 131,5 | |
Tabella 4 Ricette per reagenti.
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Discussion
La presente procedura è un protocollo di estrazione del DNA ottimizzato che ha notevolmente migliorato la resa del DNA ad alto peso molecolare rispetto ai metodi standard, senza compromettere la qualità del DNA. La fase critica con l'effetto più grande sulla resa più era punto 5.2, che comprende una fase di centrifugazione più a lungo durante precipitazione in etanolo di qualsiasi protocollo pubblicato recensito qui, tranne uno che non è stato ampiamente distribuito 11. Non sono stati rilevati cambiamenti nella qualità del DNA associate a questa centrifugazione più lungo, che indica che la maggior parte del DNA disponibile tutta la collezione saliva non è degradato e alto peso molecolare.
Tutta la raccolta della saliva ha dei limiti in termini di qualità del campione, come il potenziale di contaminanti stranieri, che deve essere ridotto al minimo in fase di raccolta, e la presenza di proteine eccessivo nel campione che può essere un segno di un'infezione sottostante. Grandi quantità di proteine o straniere contaminanti possonorimanere nel DNA estratto finale rendendo così quantificazione imprecisa. Se ci sono proteine residui o contaminanti dopo la reidratazione (punto 6) si sospetta, un campione di pulizia può essere eseguita a partire dalla fase di precipitazione delle proteine con volumi di reagente in scala in modo da riflettere il volume di ingresso del campione. Un'altra limitazione del protocollo è il tempo necessario per eseguire la procedura. Campioni multipli possono essere eseguiti in parallelo; tuttavia, si raccomanda di non più di 24 estrazioni parallele essere eseguite contemporaneamente. Ciò è particolarmente importante per il passo precipitazione delle proteine, in cui il campione deve rimanere freddo per garantire un pellet stretto e funzionante più di 24 campioni può consentire pellet tempo di ri-sciogliere.
Il protocollo qui presentato è il più efficace metodo di costo considerato (vedi tabella 3). Anche se questo protocollo fa uso di reagenti del kit di estrazione Puregene, viene utilizzato un volume più piccolo di quanto raccomandato nel protocollo Puregenesenza compromettere la resa di estrazione ed è questa riduzione di reagenti che spinge i risparmi sui costi relativi al protocollo. Si noti che il costo calcolato per l'estrazione utilizza il prezzo di listino per ogni articolo e non riflette eventuali sconti. Il costo per estrazione con il protocollo ottimizzato può essere ridotta ulteriormente con gli ordini all'ingrosso o sconti tramite rappresentanti aziendali.
La prova è stato fornito anche che questo protocollo è adatto per l'uso con il sequenziamento di nuova generazione. I dati ottenuti forniscono un'ulteriore prova dell'utilità di campioni di saliva per la ricerca genetica umana in molte malattie in cui il sangue non è normalmente disponibile. Mentre il sangue e cellule linea DNA derivato continua ad essere la fonte preferita di materiale genetico per le prove, tutta la collezione saliva è una valida alternativa quando tali fonti non siano disponibili, quando l'arruolamento dei pazienti è affetto da incasso o del salasso non è disponibile o impraticabile.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) Solution | Fisher | 03-500-506 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
References
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