Introduction
Att få hög kvalitet DNA för genetiska studier är viktigt i sjukdomsgenen forskningsprocessen. Blod, även om det krävs en invasiv förfarande och dessutom vara dyrare än saliv samling, är att föredra för att skapa odödliga cellinjer som en oändlig källa av DNA, eller iPSCs för funktionella studier, och ibland blod DNA används när cellinjer är inte tillgängliga. Men att få blod kräver en utbildad phlebotomist och blod har en kortare halveringstid än saliv 1. DNA från saliv är billigare och lättare att få, eftersom det kan samlas in och skickas via post utan att det behövs en phlebotomist och därigenom öka potentiella ämnes pooler långt utanför upptagningsområdet för sjukhus och laboratorier 2. Studie inskrivning kan förbättras när individer har möjlighet att ge ett salivprov i stället för blod 3, 4. Oro över kvantitet och kvalitet av DNA från saliv kan ha begränsat sin utbredda osse trots många studier nya studier som visar lämplighet hela saliv, med ett genomsnitt på 4,3 x 10 5 celler per milliliter, för DNA-testning framför de äldre buckala kompresser metoder som inte beviljats betydande mängder saliv 2, 3, 4, 5, 6. Även en blygsam litteraturen existerar visar lämplighet hela saliv härlett DNA för genotypning tillämpningar, inklusive microarray-baserade metoder 8, 9, 10, har inga studier undersökt nästa generations sekvensering (NGS). Målet för optimering hela denna saliv DNA-extraktion Protokollet var att maximera kvantitet och kvalitet för genetik applikationer på ett kostnadseffektivt sätt som lätt genomförs i laboratorier med vanliga reagens och förbrukningsvaror.
DNA-extraktion från saliv kräver flera förfaranden: 1) insamling och lagring, 2) cellysering, 3) RNas behandling, 4) proteinutfällning, 5) etanolutfällning, 6) DNA rehydrering. DNA Stabilization Buffertlösning, beskriventidigare 2, fungerar tillfredsställande sätt utan ändring. Inga försök att optimera RNas behandling och DNA rehydrering steg gjordes. För varje återstående steg har flera variabler som kan påverka avkastningen identifieras. Varje variabel manipulerades individuellt och förbättrad avkastning och kvalitet bedömdes statistiskt. För variabler som visades för att förbättra avkastningen och / eller DNA-kvalitet, de optimala värden som ingår i det slutliga protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Innan ge salivprov alla ämnen gav informerat samtycke enligt riktlinjerna för behandling av mänskliga ämnen på Nationwide barnsjukhuset.
1 Saliv Insamling och lagring
- Före saliv samling, se till att en persons mun är fri från mat eller andra främmande ämnen genom att ha motivet skölja ur munnen med vatten och undvika att äta eller dricka under 30 minuter innan provtagningen.
- Öppna en 15 ml centrifugrör med 2,5 ml DNA stabiliseringsbuffert 2 och se till att undvika att röra insidan av locket eller röret, och har motivet spotta 2,5 ml saliv i buffertlösningen. Obs: Samla mer än 2,5 ml saliv kan leda till prov degradering från en otillräcklig förhållande på prov till DNA stabiliseringsbuffert. Samla för lite saliv minskar förväntade avkastningen från protokollet. För att utvärdera insamlingsvolymer, använd de numrerade gradienter på sidan av than rör.
- Sätt tillbaka locket och blanda genom inversion tills blandningen homogeniseras. Kraftig skakning är inte nödvändigt. Förvara proverna vid RT för kortvarig lagring eller 4 ° C för långtidslagring (> 3 månader).
2. inledande förberedelser och Cell Lysis
- Före start av utvinning, värma vattenbad till 37 ° C, och förbereda en ishink. Tre 15 ml koniska centrifugrör kommer att behövas för varje extraherat prov. De tre rören kommer att användas för att hålla cellen och proteinpellet, den sista extraherade gDNA och isopropanol och etanol överstående.
- Hämta prover från lagring, och vänd prov flera gånger sedan virvel vid medelhastighet under 15 sek.
- Fördela 2,5 ml av provet i en ren 15 ml centrifugrör och tillsätt 5 ml Cell Lysis Solution. Blanda provet 50 gånger genom inversion och inkuberas vid RT i 30 min.
3.-RNA Borttagande
- Lägg 40 ^ il RNas A Solmepannor vid 100 mg / ml och inkubera vid 37 ° C under 15 min.
- Avlägsna provet från 37 ° C vattenbad och kyl på is under 3 min.
- Efter RNas A inkubation, öka temperaturen på vattenbadet på 65 ° C för DNA rehydrering steget av protokollet.
4. Protein och Lipid Removal
- Lägg 50 pl proteinas K-lösning vid 20 mg / ml, blanda flera gånger av inversion, och inkubera vid rumstemperatur i minst 30 minuter. Observera: Detta är en möjlig pauser punkten för protokollet. Efter tillsats av proteinas K-lösning, kan provet förvaras vid 4 ° C fram till extraktion kan slutföras. Förvaring vid 4 ° C i upp till 24 timmar inte visat sig ha en signifikant effekt på utvinning avkastningen eller DNA-kvalitet. Långtidslagring i detta skede har inte utvärderats.
- Lägg 1,7 ml av Protein Nederbörd Solution, skaka kraftigt under 20 sek i hög hastighet, och placera på is i 10 min. När proverna har svalnat på is under 10 min, centrifugera i 10 min vid 3000 x g och 4 ° C. De utfällda proteinerna ska bilda en tät pellet för att fortsätta. Om pelleten inte är tät eller om lösningen är fortfarande grumlig, kan proverna kyldes på is under 5 minuter mer och centrifugeringen upprepades. Proverna måste hållas på is för att säkerställa en tät pellet.
5. Isolering och rening av gDNA
- Till en ren 15 ml centrifugrör, pipett 5 ml isopropanol och 8 | il av ren Glykogen lösning vid 20 mg / ml.
- Häll supernatanten innehållande gDNA från steg 4,3 till röret innehållande isopropanol och Glykogen Solution, lämnar bakom den utfällda proteinpellet. När den överstående har tillsatts, blanda försiktigt provet 50 gånger genom inversion och centrifugera i 30 minuter vid 3000 xg och 4 ° C.
- Häll supernatanten långsamt i en ren 15 ml rör. Efter avlägsnande av supernatanten, tillsätt 1 ml 70% etanol för atttvätta pelleten genom att långsamt gunga och försiktigt flytta etanolen över utfällda pellets flera gånger. Behåll etanolen i röret.
- Efter den inledande tvätt, centrifugera provet under 1 min vid 2000 x g och 20 ° C. Denna centrifugeringssteg kan göras på antingen 4 ° C eller 20 ° C. Ingen signifikant effekt av temperatur har visat för detta steg.
- Efter den inledande tvätt och centrifugering av pelleten, långsamt hälla den etanoltvätt från röret och göra sig av, och utför sedan en andra tvätt genom att upprepa steg 5,3 och 5,4.
- Efter avlägsnandet av den överstående vätskan från den andra tvättningen, tillåta pelleten lufttorka i 15 min.
- Om provet inte helt har torkat, lufttorka under ytterligare 15 minuter.
6. Rehydrering av gDNA
- När provet har torkat, lägg 300 pl Tris-EDTA att rehydrera den torkade gDNA pellet.
- Vortex provet i 5 sek vid medelhastighet och lägg i en65 ° C varmt vattenbad under 1 timme.
- Avlägsna proven från vattenbadet och inkubera O / N vid RT.
OBS: Alla produkter och reagenser som används är listade i material tabell samt tabell 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bestämma optimala parametrar för DNA-extraktion en serie av parvisa DNA-extraktioner utfördes. En enda salivprov delades och varje portion testas med ett av två möjliga värden för en given variabel. Minst åtta replikat av varje parad testet utfördes (t ex var en enda salivprov i lika delar för att testa extraktion både med och utan initial 50 ° C inkubation). Optimering byggde på fyra standardmått: totala DNA avkastning, det 260/280 värde, 260/230 värde, och visuell inspektion av elektrofores DNA att bedöma fragmentering. Inte alla möjliga kombinationer av variablerna bedömdes statistiska interaktioner (N = 169 kombinationer), väljer i stället att bedöma marginaleffekten av varje variabel för sig. Effekter testades med en flervägs upprepade-mätningar ANOVA och beräknade effekter härrör från motsvarande regressionsekvationen. Alla signifikanta effekter sammanfattas i tabell 1, visas som averåldersförändring i avkastning (ng / l per ml saliv ingång) eller DNA-kvalitet (260/280 och 260/230).
Cell-lys (steg 2) har optimerats genom att bedöma: 1) närvaron / frånvaron av en 50 ° C inkubation (1 h) före cell-lys för att säkerställa att proteinas K nedbrytning och cellys medierad av lagringsbufferten gick till fullbordan, 2 ) närvaro / frånvaro av en homogenisering genom virvelbildning steg (medelhastighet, 15 sek), och 3) lyslösning inkubationstid (5 kontra 30 min). Den 30 min cellslys inkubation ökad avkastning med i genomsnitt 3,5% (p <0,01), men inga andra cellslys variabel hade en signifikant effekt på avkastningen. Vortexblandning minskade 260/280 förhållandet genom en statistiskt signifikant (p <0,001) men praktiskt litet 0,03.
Proteinutfällning (steg 4) föregås av proteinas-K-spjälkning för att störa aminosyrakedjor, förbättra proteinutfällning effektivitet och frigöra infångade DNA. Mängden proteinas K varierades tio gånger.Centrifugering temperatur reducerades från 20 ° C till 4 ° C. Ökning av mängden av proteinas K orsakade en statistiskt signifikant minskning i utbyte (8,7%) och även något förbättrade både 260/280 och 260/230 nyckeltal.
Etanol nederbörd (steg 5) var den sista etappen av den undersökta protokollet. Mängden av glykogenbärare (0, 8 | il) varierades, som var den totala centrifugeringstiden (5 vs 30 min 11). Endast centrifugeringstid kraftigt påverkat avkastning, med en genomsnittlig ökning på 290%. Ju längre spinn minskade också 260/280 faktorn något (0,05). Ingen signifikant effekt av glykogen på avkastningen observerades under experimenten; även om den totala mängden DNA i dessa extraktioner var tillräckligt stor att glykogen normalt inte skulle användas. Trots avsaknaden av effekt i dessa prov, är det ändå rekommendera att använda glykogen för att minimera risken för minskad avkastning när saliv ingångsvolymen är lägre än ges här eller om finse är en annan anledning att tro avkastningen kommer att vara låg.
Visuell kontroll av de representativa DNA-prover (Figur 1) visade att den extraherade DNA inte kraftigt fragmenterades för någon saliv DNA-extraktion förfarande, utan visade en lämplig högmolekylära band utan kladd indikerar nedbrutet DNA. Efter RNas A uppslutning, producerade protokollet i genomsnitt 260/280 av 1,74.
Figur 1 Kvalitet på saliv härlett DNA. Fyra extraktion applicerades på samma saliv samlingen. (A) Prover underkastades elektrofores på en 0,8% agarosgel (250 ng DNA). Alla varianter av saliv DNA extraktion protokoll resulterar i hög molekylvikt (> 20 kb) DNA, utan några tecken på försämring. Lane: en DNA ladder, 2 & 3 Oragene prepIT L2P Protocol prover, 4 & 5 Gentra Puregene Body Fluids Protocol, 6 & 7 den optimerade protokoll utan RNA borttagning steg, 8 & 9 den optimerade protokoll med RNA bort steget. Spår 2-7 är direkt analoga protokoll på samma salivprov. Lanes 8 & 9 visar att RNA borttagning steg inte medför DNA nedbrytning. (B) Prov underkastades elektrofores på en 2% agarosgel (150 ng DNA). En liten RNA topp är observerbar nära botten av gelén i körfält 2 till 7 (konventioner som ovan). Lanes 8 & 9 visar effektiviteten av RNA-avlägsnande steget.
RNA Borttagning Steg (steg 3 med RNas A) är kritiskt för exakt kvantifiering av DNA. Under provningen, var genomgående hög RNA halt observerats, som bestäms av förhållandet mellan dubbelsträngat DNA till RNA mäts med ett Qubit 2,0 Fluorometer. I genomsnitt nuk syrahalt från prover utan RNas bestod En behandling av 46,6% (± 0,4) RNA. Prov som genomgick RNA Borttagning Steg läsas som "<20 ng / ml", vilket är den lägsta möjliga behandlingen för Qubit s RNA upptäckt.
Det erhållna genom denna optimerat protokoll DNA var tillräckligt god kvalitet för hög genomströmning sekvense när ytterligare RNas Ett steg tillämpades. För att uppnå riktade mordningsuppgifter, var en anpassad Agilent SureSelect Target Enrichment kit appliceras på 24 prover, inriktning 2.6 Mb i sekvens. Hög genomströmning sekvensegenomfördes på 12 streckkodade (indexerade) prover per körfält. Var BWA-linje till hg19 referens genomet 12, sedan tillämpa GATK 13 bas kvalitetsresultat omkalibrering, INDEL omläggningen, duplicera avlägsnande, SNP upptäckt och genotypning samtidigt över alla 24 prover utfördes med hjälp av bästa praxis hårt filtreringsparameter Sequence läser värden 14. Samtliga 24 prover gav hög kvalitet NGS-data (tabell 2). Av läser som passerade Illumina standardfilter och hade Q> 20, 91,4% i linje med målregionerna sekvens anrikning, ger ett genomsnitt på mål täckningsdjup> 30x täckning vid Q> 100, väl inom de gränser som är nödvändiga för sällsynta SNP upptäckt i varje prov. Den genomsnittliga strängbalans var 49,9%. Jämföra variant samtal med Illumina microarray genotyper gav en konkordans på 98,9%.
| Kandidat Variabel | ng / ul | 260/280 | 260/230 |
| Vortex | ns | -0,03 *** | ns |
| x30 min Cell Lysis Inkubation | 3,5% ** | ns | ns |
| Proteinas K x10 | -8.7% * | -0,05 *** | -0,03 *** |
| 30 min centrifuge | 290,2%*** | -0,05 *** | ns |
| Glykogen | ns | ns | -0,37 *** |
Tabell 1 Effekt storlek Optimerad Variabel på Mängd / kvalitetsmetrik. Samtliga effektstorlekar är i de enheter som anges i kolumnrubriken. p-värden från ANOVA: * p <.05; ** P <0,01; *** P <.001; ns ej signifikant
| Quality Metric | Värde |
| Target längd | 1,708 kb |
| Mål Täckt> 30x | 85,22% |
| SNP i dbSNP | 92,55% |
| Array avtal | 98,99% |
Tabell 2 Kvalitet på hög genomströmning sekvens från Target Enrichment.
| Ny Optimerad protokoll | Föremål | Fördelare | Katalog # | Inköpsenheten | Kostnad / enhet | Kostnad / Samling |
| 15 ml centrifugrör | Fisher | 12-565-268 | 500 Tubes | $ 233,50 | $ 3,2690 | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158.908 | 1 L | $ 401,00 | $ 3,2080 | |
| Proteinas K | Sigma | P6556 | 1 g | $ 713,00 | $ 1,5686 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158.912 | 350 ml | $ 350,00 | $ 2,7200 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | Fall av 4 x 4 L | $ 486,71 | $ 0,2434 | |
| Glykogen lösning (20 mg / ml) | EZ-Bioresearch | S1003 | 1 ml | $ 51,00 | $ 0,8160 | |
| 70% Etanol | Fisher | 04-355-305 | Fall av 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ 0,0325 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | 1 L | $ 68,67 | $ 0,0412 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | 1 kg | $ 34,65 | $ 0.000004 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP1757-100 | 100 ml | $ 57,84 | $ 0,0116 | |
| EDTA (0,5 M) lösning | Fisher | 03-500-506 | 100 ml | $ 33,60 | $ 0,0134 | |
| Natrium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | 100 g | $ 59,95 | $ 0,0060 | |
| Totalkostnad | $ 11,93 | |||||
| Oragene | Föremål | Fördelare | Katalog # | Inköpsenheten | Kostnad / enhet | Kostnad / Samling |
| 15 ml centrifugrör | Fisher | 12-565-268 | 500 Tubes | $ 233,50 | $ 0,9340 | |
| 100% etanol | Fisher | BP2818-100 | 100 ml | $ 34,29 | $ 1,6459 | |
| 70% Etanol | Fisher | 04-355-305 | Fall av 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ 0,0081 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | 1 L | $ 68,67 | $ 0,0687 | |
| 1,5 ml rör | Genesee | 22-281A | 500 Tubes | $ 22,85 | $ 0,0457 | |
| Oragene Collection KIT | Oragene | OG-500 | 1 | $ 25,00 | $ 25,00 | |
| Totalkostnad | $ 27,70 | |||||
| Puregene | Föremål | Fördelare | Katalog # | Inköpsenheten | Kostnad / enhet | Kostnad / Samling |
| 15 ml centrifugrör | Fisher | 12-565-268 | 500 Tubes $ 233,50 | $ 0,9340 | ||
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158.908 | 1 L | $ 401,00 | $ 4,0100 | |
| Proteinas K | Qiagen | 158.918 | 650 ml | $ 73,10 | $ 7,8723 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158.912 | 350 ml | $ 350,00 | $ 4,0000 | |
| Isopropanol | Fisher | A4164 | Fall av 4 x 4 L | $ 486,71 | $ 0,3650 | |
| Glykogen Lösning | Qiagen | 158.930 | 500 ml | $ 64,30 | $ 2,5720 | |
| 70% Etanol | Fisher | 04-355-305 | Fall av 4 x 1 gal. | $ 123,03 | $ 0,0975 | |
| DNA Hydration Solution | Qiagen | 158.914 | 100 ml | $ 69,80 | $ 0,1396 | |
| NaCl | Fisher | AC19409-0010 | 1 kg | $ 34,65 | $ 0.000004 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP1757-100 | 100 ml | $ 57,84 | $ 0,0116 | |
| EDTA (0,5 M) lösning | Fisher | 03-500-506 | 100 ml | $ 33,60 | $ 0,0134 | |
| Natriumdodecylsulfat | Fisher | BP166-100 | 100 g | $ 59,95 | $ 0,0060 | |
| Totalkostnad | $ 19,99 |
Tabell 3 Kostnadsjämförelse för optimerat protokoll för att extrahera DNA från 2 ml hel saliv med andra kommersiellt tillgängliga protokoll. Alla reagens och förbrukningsvaror som behövs för DNA-extraktion har bedömts med hjälp av standardlistpriser finns på Internet den 30 september, 2013 Observera att detta protokoll är skriven för att extrahera DNA från 1,25 ml hel saliv (dvs 2,5 ml saliv och buffert , se steg 2.3) eftersom detta värde står för hälften av den totala volymen i saliven provröret. För kostnadsjämförelse ades 2 ml valdes eftersom detta är det belopp som är förknippade med ett gemensamt kommersiellt tillgängligt kit (Oragene).
| DNA Stabilization Buffer (250 ml) | ||
| Komponent | Volym (ml) | [Final] |
| 1 M NaCl | 1,461 g | 0,1 M |
| Tris-HCl | 2,5 | 0,01 M |
| 0,5 M EDTA | 5 | 0,01 M |
| 10% SDS | 12,5 </ Td> | 0,014 M |
| Proteinas K-lösning (20 mg / ml) | 2,5 | 6.92x10 -6 M |
| DDH 2 O | 227,5 | |
| Proteinas K-lösning (20 mg / ml) | ||
| Komponent | Volym (ml) | [Final] |
| Proteinas K pulver | 500 mg | 6.92x10 -4 M |
| DDH 2 O | 25 | |
| 70% Etanol (500 ml) | ||
| Komponent | Volym (ml) | [Final] |
| Etanol 95% | 368,5 | 12,63 M |
| DDH 2 O | 131,5 | |
Tabell 4 Recept för reagenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande förfarandet är en optimerad DNA-extraktion protokoll som har förbättrats avsevärt utbytet av högmolekylära DNA jämfört med standardmetoder, utan att kompromissa med DNA-kvalitet. Det kritiska steget med störst påverkan på avkastningen mest var steget 5.2, som innehåller en längre centrifugeringssteg under etanolprecipitation än någon publicerat protokoll omdömet här, utom en som inte fick stor spridning 11. Inga förändringar i DNA-kvalitet i samband med detta längre centrifugering upptäcktes, vilket tyder på att de flesta av de tillgängliga DNA från hela saliv samlingen är inte nedbruten och hög molekylvikt.
Hela saliv samlingen har begränsningar i prov kvalitet som potentialen för utländska föroreningar, som måste minimeras under insamlingsstadiet, och förekomsten av överdriven protein i provet som kan vara ett tecken på en underliggande infektion. Stora mängder protein eller främmande föroreningar kankvar i slut extraherade DNA vilket gör kvantifiering felaktig. Om det finns rest proteiner eller föroreningar efter rehydrering (steg 6) misstänks, ett prov städa upp kan utföras genom att starta på proteinfällningssteget med reagensvolymer skalade att spegla provingångsvolymen. En annan begränsning i protokollet är den tid som krävs för att utföra stegen. Flera prover kan köras parallellt; dock rekommenderas att inte mer än 24 parallella extraktioner köras samtidigt. Detta är särskilt viktigt för proteinfällningssteget, där provet måste vara kall för att säkerställa en tät pellet och kör mer än 24 prover kan tillåta pellets tid att åter upplösas.
Protokollet presenteras här är den mest kostnadseffektiva metoden beaktas (se tabell 3). Även om detta protokoll inte använda reagenser från Puregene utvinning kit, är en mindre volym än vad som rekommenderas i Puregene protokoll som användsutan att kompromissa extraktionsutbytet och det är denna minskning av reagenser som driver de kostnadsbesparingar i förhållande till protokollet. Observera att den beräknade kostnaden för utvinning använder listpriset för varje objekt och återspeglar inte eventuella rabatter. Kostnaden per extraktion med den optimerade protokollet kan reduceras ytterligare med större beställningar eller erbjudanden via företagets säljare.
Bevis har också förutsatt att detta protokoll är lämplig för användning med nästa generations sekvensering. Erhållna data ger ytterligare belägg för nyttan av salivprov för humangenetik forskning inom många sjukdomar där blodet inte är tillgängliga rutinmässigt. Även blod och cellinje härledd DNA fortsätter att vara den föredragna källan av genetiskt material för testning, är helt saliv samling ett lönsamt alternativ när sådana källor inte finns tillgängliga, inte är tillgänglig eller opraktiska när patientrekrytering påverkas av deras insamling eller flebotomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 | |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0.5 M) Solution | Fisher | 03-500-506 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
References
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
- Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet. European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).
- Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).
- Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16). Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).
- Dawes, C. Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth. Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).
- Bahlo, M., et al. Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).
- Hu, Y., et al. Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison. PLoS ONE. 7 (3), e33968 (2012).
- Simmons, T. R., et al. Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families. Human Heredity. 70, 232-244 (2010).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol precipitation of DNA. Focus. 7, 1-2 (1985).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- DePristo, M., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).
