Abstract
I internt befrugtende dyr, er sædvæsken normalt tilføjes det spermatozoer, der tilsammen danner sæd eller ejakulere. Udover nærende og aktivering sæd, kan komponenterne i sædvæsken også påvirke kvindelige fysiologi at forøge befrugtning succes sperm donor. Mens mange undersøgelser har rapporteret sådanne virkninger i arter med separate køn, har kun få undersøgelser behandlet dette i samtidig tvekønnede dyr. Denne video protokol præsenterer en metode til at studere virkningerne af sædvæsken i havsnegle ved hjælp af en samtidig tvekønnede ferskvand sneglen, den store dam sneglen Lymnaea stagnalis, som model organisme. Mens proceduren er vist ved hjælp af komplet prostata ekstrakter kan de enkelte komponenter (dvs. proteiner, peptider og andre forbindelser) i sædvæsken testes på samme måde. Virkninger af modtagelsen af ejakulere komponenter på æglægning kan kvantificeres i form af hyppighed af æglægning ogmere subtile estimater af kvindelige reproduktive ydeevne såsom æg numre inden for hver ægmasser. Resultaterne viser, at sædvæsken proteiner påvirker kvindelige reproduktive output i denne samtidige hermafrodit, fremhæve deres betydning for seksuel selektion.
Introduction
Ved overdragelsen er spermatozoer som regel ledsaget af sædvæske produceret af mandlige accessoriske kirtler. Mens nogle ejakulere komponenter spiller roller i nærende og aktivering af sperm 1 andre påvirke kvindelige fysiologi for at øge befrugtning succes sæddonor 2-4. Sådanne virkninger er specielt udvalgt til via seksuel selektion, når en art er meget promiskuøs og har en effektiv opbevaring af sæd og sperm fordøjelsen. Under sådanne betingelser, sæddonorer konkurrerer kraftigt til befrugtning af æg 5. Mens der er rigeligt Correlational bevis for betydningen af sædvæsken stoffer til mandlig befrugtning succes, direkte beviser er mere sjældne, og kun få studier har dykket i detaljer med den fysiologiske forandringer og / eller stoffer involveret 6.
I arter med separate køn (dvs., mænd og kvinder, gonochorists) der er et par godt undersøgt model species, når det kommer til sammensætning sædvæsken og deres virkninger. Som eksempler kan nævnes bananfluen, Drosophila melanogaster 6, malariamyggen, Anopheles gambiae 7, og den røde mel bille, Tribolium castaneum 8. Sådanne sædvæsken undersøgelser er meget sjældnere, når det kommer til arter, som samtidig er tvekønnede (dvs. individer er funktionelt mandlige og kvindelige på samme tid), selv om denne form for reproduktion er fælles i hele dyreriget 9. Det mest bemærkelsesværdige tvekønnede eksempel på overførsel af et tilbehør kirtel stof er nok nedskydningen af såkaldte kærlighed-dart i snegle 2,10, hvor stoffet er overført af den sæddonor via subkutan injektion 11,12, dvs ikke sammen med spermatozoer. Men der er mange samtidige hermafroditter, der overfører mandlige tilbehør kirtel produkter sammen med deres sæd,såsom modelarter, der anvendes her, den store dam snegl Lymnaea stagnalis. Tidligere forskning har allerede vist, at modtagelsen af sædvæsken påvirker den kvindelige reproduktive produktionen af denne art 13-15, og flere af de involverede sædvæsken proteiner er blevet identificeret 16,17.
Det overordnede mål for denne protokol, som er en udvidelse af de metoder, rapporteret i Koene m.fl. 16, er at teste effekten af sædvæsken proteiner på forskellige parametre for æglægning i havsnegle. Dette opnås ved dissektion af prostata (dvs. han tilbehør kirtel producerer sædvæsken) af seksuelt isoleret donor snegle fra en standardiseret laboratorium kultur. For det andet er donorens sæd opsamlet fra sædblærerne og forskellige behandling løsninger er lavet. Efterfølgende test snegle bedøvet og intravaginalt injiceret med en testopløsning (for eksempelprostata ekstrakt alene, prostata ekstrakt med sæd, alene sæd, bæremedium alene). Disse test snegle derefter overvåges for de følgende dage til uger, under standardbetingelser, for at optage æglægning. Ægmasser indsamles, digitalt scannet til at tælle og måle forskellige parametre, og derefter sætte i individuelle hætteglas til udrugning. Efter omkring to uger, er de nyfødte tælles og digitalt scannet. Alle scanninger af både ægmasser og larver, analyseres derefter ved hjælp af et frit tilgængeligt billede analyse software pakke.
Til denne protokol laboratoriet stamme af den store dam snegl, Lymnaea stagnalis, der anvendes, som er avlet på VU University i Amsterdam. Denne art tjener som en model for at undersøge spørgsmål om seksuel selektion og reproduktion i hermafroditter. Dyrets relativt store størrelse gør det eksperimentelt meget tilgængelige. Hertil kommer, fordi det bliver brugt som model art i mange biological discipliner vi allerede ved en masse om de grundlæggende biologi af disse dyr. Denne metode vil bidrage til at undersøge spørgsmål om processer seksuel selektion, der er medieret via sædvæsken proteiner i almindelighed. Hertil kommer, fordi disse er samtidige hermafroditter, er det muligt at tage fat om disse proteiner handle i tilsvarende og / eller forskellige måder, som de gør i arter, hvor kønnene er adskilt 16,17.
Protocol
1.. Breeding Facility
- Opnå voksne fisk af Lymnaea stagnalis (L.) fra et laboratorium kultur som den ved VU University.
- Bevare lavt kobberindhold vand ved 20 ° C i både avl faciliteten (molluscarium) og eksperimenterende tanke, der har kontinuerlig vandudskiftning.
- Sæt lys / mørke cyklus på 12 timer: 12 timer.
- Til avl, fodre voksne snegle pesticidfri salat ad libitum, fodre de unge unge med TetraPhyll (fisk fødevarer) flager. Vedligehold snegle i separate tanke i henhold til deres alder, startende fra ægmasser som er lagt inden for en 24 timers tidsramme.
- Når snegle fjernes fra avl tanke de ikke returneres, for at undgå virkningerne af at have været holdt under lidt andre betingelser samt at forebygge pseudoreplication.
2. Dissektion
- Isoler snegle til 1 uge, og fodre dem ad libitum, for at sikre that de har fuld sperm og sædvæsken butikker.
- Forbered en stereo mikroskop, en dissektion plade med ben, små kirurgiske sakse, grove og fine tænger, en 10 ml sprøjte fyldt med en 50 mM MgCl2 løsning, kanyler (0,3 mm x 13 mm), og nogle papirhåndklæder.
- Aflive en snegl ved indsprøjtning af MgCl2-opløsning (generelt 3 ml eller mere for voksne snegle med en shell længde på 31,6 ± 2,1 mm og våd vægt på 2,89 ± 0,55 g). Trænge ind i foden med kanylen i en 45 ° vinkel og injicere ved forsigtigt at anvende pres kontinuerligt, indtil sneglen slapper af og forbliver udvidet (inden for sekunder). Tag kanylen og kontrollere, om sneglen er aflivet (for eksempel ved at kontrollere, om tilbagetrækning fangarm refleks er fraværende).
- Fjern forsigtigt skallen efter dens krumning ved hjælp af grove pincet. Halvvejs forsigtigt frigøre columellar muskel fra skallen ved at skrabe med pincet. Vride forsigtigt than sneglen ud af sin skal, efter afviklingen retning af skallen.
- Placer snegl på dissektion plade og pin ned bagenden af foden. Derefter placere en stift gennem hovedet og sætte nogle spændinger på sneglen til at lette dissektion.
- Lokalisere den kvindelige gonopore, der vil senere blive et referencepunkt for dissektion.
- Brug af kirurgiske sakse og fine pincet, gør det første snit lige under kanten af kappen og skær mod kvindelige gonopore. Når en af sakse 'vinger skubbet under kroppen væggen, løft det lidt op for at sikre, at kun kroppen væggen, og ingen af de indre organer, er skåret. Fortsæt med at skære over gonopore mod hovedet og skære i en lige linje.
- Lokalisere prostata (posterior) og sædblærer (anterior). Dissekere disse ud omhyggeligt og holde dem på is. Brug disse til at gøre test-opløsninger, der indeholder sædvæsken og / eller sæd. Brug fysiologiske Lymnaea saline (5,83 mmol / l CaCl2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L MgCl2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L NaCl, 37,53 mmol / L KCl) som bærer medium.
- Saml sædvæsken der er til stede i lumen af prostata samt sæd fra sædblærer. Efterfølgende suspendere både i saltvand i separate hætteglas ved forsigtigt at udtrykke deres indhold og fjernelse af orgel væv med en pincet. Hold på is og bruge den samme dag. Senere blande disse suspensioner at skabe de forskellige behandlingsmetoder løsninger.
3.. Intravaginal Injektion
- Inden du starter intravaginal indsprøjtning procedure, forberede en silicium shell-skimmel (lavet til at passe spidsen af skallen), 1 mm sprøjter, 10-12 cm silicium rør med en diameter på 1 mm, stumpe kanyler (0,3 mm x 13 mm ), grove pincet og den samme 10 ml sprøjte fyldt med en 50 mM MgCl2 opløsning forsynet med en skarp kanyle.
- Saml sæd, der er nødvendige for at føje til sædvæsken (eller individuelle sædvæsken proteiner) i nogle behandlinger; et biologisk relevant dosis lig med 1/3 af en prostata og sædblæren per injektion.
BEMÆRK: I den repræsentative resultater sektion (figur 1) er vist resultaterne af et eksperiment med tre forskellige behandlinger: Kontrol (carrier medium, dvs saltvand), Ovipostatin (en af de identificerede sædvæsken proteiner) alene og Ovipostatin ledsaget med sperm. Hertil kommer, at estimere biologisk relevante dosis i andre arter, fastlægge forskellen i vægten af prostata af personer, der for nylig har parret og enkeltpersoner, der forblev seksuelt isolerede 16. - Forbered 1 ml sprøjter for hver af de fremstillede testopløsninger. Fyld hver sprøjte med én løsning, og sikre, at der ikke er luftbobler indeni.
- Montér en stump kanyle på hver sprøjte.
- Til injektion bruge en 1mm i diameter silicium rør med en længde på 10 cm minimum.
- Skub forsigtigt silicium rør over kanylen, og sørg for ikke at gennembore røret, og fjern luften fra røret ved forsigtigt at anvende pres på sprøjten.
- Bedøve en snegl ved at følge den samme protokol som i punkt 2.3. Denne gang skal du sørge for ikke at injicere mere end 2-3 ml 50 mM MgCl2.
- Læg sneglen i skallen-formen til at holde det i en stabil position.
- Find den kvindelige gonopore, hvilket er klart synlig som en hvid plet på højre side af dyret, forreste til højre fangarm og mandlige gonopore (denne placering gælder også for andre arter af ferskvand snegle). Sørg for at have uhindret adgang til.
- Brug en pincet til at holde enden af silicium rør og indsæt forsigtigt cirka 2-4 mm af silicium rør i den kvindelige gonopore.
- Forsigtigt anvende pres på sprøjten og injicere 0,03 ml af testopløsningen. Vent en halv minute at tillade trykket i røret til at spredes i den kvindelige tarmkanalen før fjernelse af røret.
- Returner den behandlede snegl til sin isolation beholder, hvor det kan overvåges, og gør det muligt at komme sig fra sedation i den eksperimentelle tank.
4.. Bioassav
- Mærk hver snegl til identifikation og måle dens shell længde. Sidstnævnte er en god indikator for størrelsen, der er relevant, når kvantificere reproduktive output.
- Hold hver snegl isoleret i en 460 ml beholder, der er perforeret for at give mulighed for vandudveksling indenfor den eksperimentelle tank. Det er vigtigt at anbringe alle beholdere i den rigtige orientering med perforeringerne i retningen af vandstrømmen for at muliggøre en effektiv udveksling vand.
- Under bioassay, fodre snegle regelmæssigt med en standardiseret mængde af salat. Brug en rund, metal puncher at skære salat. I denne protokol anvendes salat skiver af 19,6 cm 2, der tilnærmer enmontere de maksimalt kan spise på én dag.
- Saml et æg masse ved hjælp af den flade side af en spatel, og skrabe æggemassen fra beholdervæggen. Brug skeen side at indsamle æggemassen.
BEMÆRK: Mat ægmasser der netop blevet lagt, kan ikke bruges til scanning (de bliver gennemsigtige inden for et par timer efter anlæggelsen). For modellen arter i denne protokol, Lymnaea stagnalis, så tjek for ægmasser hver dag, fordi de producerer 2-3 ægmasser ugen. Dette kan variere i andre arter. - Scan de indsamlede ægmasser digitalt, ved hjælp af en (bærbar) computer, der indeholder scannerdriveren, en flad seng scanner, en standard millimeter skala, en spatel, overføre plader og glas fliser.
- Placer hver æggemassen på overføringsmidlerne pladerne og gentag, indtil pladerne er fulde. Efterfølgende ising ægmasser tørre på køkkenrulle og overføre dem på glas fliser i samme rækkefølge som på de overdragende plader.
- Vend hver flise på hovedet (detægmasser vil holde sig til glas fliser) og forsigtigt placere den på flatbed-scanneren, lige under millimeter skala. Påfør en smule pres for at glatte ægmasser, der vil distribuere æggene jævnt, så de er alle synlige inden for det samme fokus flyet. Monter fliser med en standardiseret mængde af tape omkring to kanter for at sikre, at alle æg er fladet lige.
- Juster scannerindstillingerne. Det er vigtigt at justere opløsningen til sin maksimale, lave en prøvescanning, beskære arbejdsområdet og justere lysstyrke og kontrast. Scan ægmasser.
- Placer hver æggemassen i sin egen mærket 20 ml hætteglas for yderligere udvikling og klækning.
- Refresh vandet i ruge hætteglas hver anden dag for at holde det ordentligt iltet. Gør dette i henhold til Hatchling tal og størrelse i følgende rækkefølge: dekantering / hælde off (ingen unger), overstrømmende (start af udklækning), og udvinde vandet ud med en pipette (mange larver).
- Installer den frit tilgængelige billede analyse software ImageJ (NIH, USA) og celletalsmåleren plugin.
- Åbent ImageJ samt et regneark til at overføre data til. Derefter åbner et scannet billede af ægmasser i ImageJ.
- Indstil skalaen ved at bruge zoom værktøj til at navigere til millimeter skala. Zoom ind og justere vinduet til 1 mm til at fylde op på skærmen. Tegn en linje ved hjælp af linje værktøj mellem de to linjer, der angiver 1 mm. Naviger til Analyser, og Set skala. I pop-up-menuen bliver den målte længde option synlige, justere kendte afstand til 1 og enhed af længde til mm. Kontrollér feltet Global, og luk vinduet.
- Indstil de foretrukne mål (længde, bredde, omkreds) ved at navigere til at analysere, og Set Målinger ved at vælge Område og Féret diameter (længde og bredde). Klik på OK for at bekræfte og fortsætte med billedet analyser.
- Til måling af æg, zoabout ind på et æg i den første æg masse, der skal måles. En zoom på 800% anbefales. Derefter bruger elliptiske værktøj tegne en oval præcis omkring ægget, skal du trykke på Ctrl + D for at trække omkredsen på billedet (for at undgå at måle det samme æg to gange). Tryk derefter på Ctrl + M for at optage det mål af egenskaberne for den ovale (længde, bredde, omkreds); et pop-up-skærmen åbnes visning af målingerne.
BEMÆRK: Brugen af den elliptiske værktøj til at måle æg ikke gælder for alle arter. For arter med ikke-ensartet formede æg, skal du bruge frihånd markeringer i stedet. - Mål så mange æg som nødvendige og derefter gemme foranstaltninger. Xls regneark. Eventuelt kopiere data direkte ind i et regneark.
- Efterfølgende tælle æggene inden en æggemassen, ved hjælp af tælleren vinduet og sætte tæller manuelt i regnearket.
- Alternativt tælle individuelle æg pr æg masse ved hjælp af cellen counter plug-in. For dette, skal du navigere til Plug-ins,derefter analysere og udvælge Celletalsmåler. Cellen tæller vindue vil poppe op, kontrollere »beholde original 'og tryk på' initialisere". Et nyt tæller vises, skal du vælge trådkors værktøj fra værktøjslinjen og vælge en tæller type i celletalsmåleren menuen. Tæl enkelte æg ved at klikke på de enkelte æg i celletalsmåleren vinduet. Overhold samlede optælling siden tælleren type i celletalsmåleren menuen. Kopier denne nummeret manuelt til et regneark eller opnå de resultater, ved at trykke på resultater.
- Tæl flere ægmasser inden for en optælling begivenhed ved at tilføje counter typer, hvis det er nødvendigt.
Representative Results
Figur 1 viser procentdelen af dyr æglæggende æg efter intravaginal injektion af enten kontrol substans (saltvand), Ovipostatin eller Ovipostatin ledsaget med sperm. N = 15 for hver behandling; se Koene m.fl. 16 for nærmere oplysninger og statistikker (Kilde: Figur 3 fra Koene m.fl. 2010, PLoS ONE.)..
Figur 1.. Virkning af Ovipostatin på æg masseproduktion af Lymnaea stagnalis. Grafen viser procentdelen af dyr æglæggende æg efter intravaginal injektion af enten kontrol substans (saltvand), Ovipostatin eller Ovipostatin ledsaget med sperm. N = 15 for hver behandling; se Koene et al. 2010 detaljer og statistik. Genoptryk med tilladelse fra Koene m.fl. 2010 PLoS ONE 5:. E10117.
Discussion
Den præsenterede protokol viser, hvordan at indsamle sædvæsken, og hvordan at teste dette i en biologisk meningsfuld måde. Selv om denne procedure her er vist ved hjælp af prostata ekstrakt, kan effekten af et enkelt renset sædvæsken protein også testes efter samme procedure. Det er klart, i sådanne tests er det altid vigtigt at medtage ordentlig kontrol (fingeret behandlinger) for at sikre, at proceduren og / eller transportøren medium ikke påvirker parametrene i spørgsmål 14,16. Ved hjælp af denne metode, er det allerede vist, at der er en enkelt flydende protein skelsættende, nemlig Ovipostatin, der medierer en reduktion i æglægning 14,16. Dette protein produceres i prostata og overføres under parring sammen med spermatozoer, repræsenterer den første fuldstændigt karakteriseret sædvæske komponent i en samtidig hermafroditiske og har hidtil ikke nogen lighed med kendte proteiner.
Konstateringen af, at Ovipostatin reducerer æg masseproduktion i modtageren bekræfter tidligere arbejde indikerer, at stoffer i sæden kan påvirke æglægning 13-15. Ved at overføre biologisk relevante beløb (3.2 16), kan man overbevisende, at det er en skelsættende væske protein, og ikke tilstedeværelsen af spermatozoer selv, der medierer den observerede reduktion i æglægning (Figur 1). Da gentagne modtagelse af sædvæsken via naturlige parringer øger investeringerne pr æg 15, det nu bliver meget relevant at kvantificere andre parametre i æglægning. Den præsenterede protokol nu giver de nødvendige metoder til at gøre det. Selv om der ikke blev ikke fundet effekt af Ovipostatin om klækning succes de betingelser, som modtageren 16 æg, kan der være andre sædvæsken proteiner, der fungerer i samspil med dette protein. Derfor parametre, der skal kvantificeres i denne sammenhæng - ved siden af om frekvens og æg numre - indeholde æg størrelse, hatching tid, hatchling udvikling og hatchling størrelse. Desuden er det muligt at se på virkningerne på andre kvindelige processer end æglægning, såsom opbevaring af sæd og skik, samt fordelingen af reproduktive ressourcer til den kvindelige og mandlige funktion 14,17. Det er klart, den præsenterede metode er medvirkende til at løse disse opfølgende spørgsmål, både i Lymnaea stagnalis og i andre ferskvand snegle.
I sum, eksperimenter med denne protokol viser, at der overføres sædvæsken proteiner påvirker den kvindelige reproduktive ydeevne på modtageren i disse samtidige hermafroditter. I betragtning af at kun få studier har behandlet dette, er det sandsynligt at være langt mere almindelig i internt befrugtende hermafroditter, end der er i øjeblikket til udtryk i den videnskabelige litteratur. Især når man indser, at pre-copulatory mate valg og sperm konkurrence har vist sig at spille en vigtig rolle i disse hermafroditter 14, som highlights potentiale af sådanne mandlige tilbehør kirtel proteiner til at blive seksuelt valgt i dette system. Endelig er denne forskning er med til at understøtte udviklingen af forestillingen om, at sædvæsken proteiner er lige vigtige for samtidige hermafroditter, da de er for separate-kønssorteret arter.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker hr. Helmus til voice-over, CM Popelier, S. Ypenburg og C. Levesque for teknisk bistand. Denne forskning er støttet af den nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO), Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) og Student Services Organization Japan (Jasso). Denne publikation blev støttet af en Open Access tilskud på NWO til JMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
- Mann, T., Lutwak-Mann, C. Male reproductive function and semen. , Springer-Verlag. (1981).
- Arnqvist, G., Rowe, L. Sexual Conflict. , Princeton University Press. Princeton, New Jersey. (2005).
- Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , Elsevier. (2008).
- Koene, J. M., Ter Maat, A. Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection. Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).
- Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. The seminal symphony: how to compose an ejaculate. Trends in Ecology & Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).
- Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases. Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).
- Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction. Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).
- Jarne, P., Auld, J. R. Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals. Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).
- Nakadera, Y., Koene, J. M. Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches. Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).
- Chase, R., Blanchard, K. C. The snail’s love-dart delivers mucus to increase paternity. Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).
- Koene, J. M., Chase, R. Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart. Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).
- Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study. Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).
- Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite. Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).
- Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis. Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).
- Koene, J. M., et al. Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite. PLoS ONE. (5), (2010).
- Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite. Current Biology. 24, 1-4 (2014).
