Abstract
आंतरिक जानवरों fertilizing में, लाभदायक तरल पदार्थ आमतौर पर एक साथ वीर्य या स्खलन के गठन, शुक्राणु के लिए जोड़ा है. पौष्टिक और सक्रिय शुक्राणु इसके अलावा, रज में घटक भी शुक्राणु दाता के निषेचन की सफलता को बढ़ाने के लिए महिला के शरीर क्रिया विज्ञान को प्रभावित कर सकते हैं. कई अध्ययनों अलग लिंगों के साथ प्रजातियों में इस तरह के प्रभाव की सूचना दी है, जबकि कुछ अध्ययनों से एक साथ उभयलिंगी जानवरों में इस को संबोधित किया. इस वीडियो प्रोटोकॉल मॉडल जीव के रूप में एक एक साथ उभयलिंगी मीठे पानी घोंघा, महान तालाब घोंघा Lymnaea stagnalis, का उपयोग कर, gastropods में लाभदायक तरल पदार्थ के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. प्रक्रिया पूरी प्रोस्टेट ग्रंथि के अर्क का उपयोग कर दिखाया गया है, जबकि व्यक्तिगत घटकों लाभदायक तरल पदार्थ का (यानी, प्रोटीन, पेप्टाइड, और अन्य यौगिकों) उसी तरह से परीक्षण किया जा सकता है. अंडा बिछाने पर बोल पड़ना घटकों की प्राप्ति के प्रभाव अंडे बिछाने की आवृत्ति के मामले में मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैऐसे प्रत्येक अंडे जनता के भीतर अंडे संख्या के रूप में महिला प्रजनन प्रदर्शन का अधिक सूक्ष्म अनुमान है. परिणाम लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन यौन चयन के लिए उनके महत्व पर प्रकाश डाला, यह एक साथ उभयलिंगी में महिला प्रजनन उत्पादन को प्रभावित करता है.
Introduction
स्थानांतरण पर, शुक्राणु आमतौर पर पुरुष गौण ग्रंथियों द्वारा निर्मित लाभदायक तरल पदार्थ के साथ कर रहे. कुछ बोल पड़ना घटकों पौष्टिक और सक्रिय शुक्राणु 1 में भूमिका निभाते हैं, दूसरों के शुक्राणु दाता 2-4 की निषेचन सफलता को बढ़ाने के क्रम में महिला शरीर क्रिया विज्ञान प्रभावित करते हैं. एक प्रजाति अत्यधिक अनेक है और कुशल शुक्राणु भंडारण और शुक्राणु पाचन है जब इस तरह के प्रभाव विशेष रूप से, यौन चयन के माध्यम से, के लिए चुने गए हैं. ऐसी परिस्थितियों के अंतर्गत, शुक्राणु दाताओं अंडे 5 के निषेचन के लिए भारी प्रतिस्पर्धा. पुरुष निषेचन की सफलता के लिए लाभदायक द्रव पदार्थों के महत्व के लिए प्रचुर मात्रा में correlational सबूत नहीं है, प्रत्यक्ष प्रमाण अधिक दुर्लभ है और कुछ अध्ययनों से शारीरिक परिवर्तन और / या 6 शामिल पदार्थों की गहराई में delved है.
प्रजातियों में अलग लिंगों (यानी, पुरुषों और महिलाओं, gonochorists) के साथ कुछ अच्छी तरह से जांच की मॉडल तकनीक और नवीनता रहे हैंयह लाभदायक तरल पदार्थ की संरचना और उनके प्रभाव की बात आती है तों. उदाहरण फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 6, मलेरिया मच्छर, एनोफ़ेलीज़ gambiae 7, और लाल आटा बीटल, Tribolium castaneum 8 शामिल हैं. यह प्रजनन की इस विधा जानवरों के साम्राज्य 9 भर में आम है, भले ही (यानी, व्यक्तियों एक ही समय में कार्यात्मक पुरुष और महिला हैं) एक साथ उभयलिंगी हैं कि प्रजातियों के लिए आता है जब इस तरह के लाभदायक तरल पदार्थ के अध्ययन बहुत दुर्लभ हैं. एक सहायक ग्रंथि पदार्थ के स्थानांतरण की सबसे उल्लेखनीय उभयलिंगी उदाहरण शायद पदार्थ चमड़े के नीचे इंजेक्शन 11,12, यानी, नहीं के माध्यम से शुक्राणु दाता द्वारा स्थानांतरित कर रहा है, जहां भूमि घोंघे 2,10, में तथाकथित प्रेम डार्ट्स की शूटिंग है शुक्राणु के साथ. लेकिन उनके शुक्राणु के साथ पुरुष उपग्रंथि उत्पादों हस्तांतरण कि एक साथ कई hermaphrodites, वहाँ रहे हैंइस तरह यहां इस्तेमाल मॉडल प्रजाति के रूप में, महान तालाब Lymnaea stagnalis घोंघा. पिछले अनुसंधान पहले ही लाभदायक तरल पदार्थ की प्राप्ति इस प्रजाति की मादा प्रजनन उत्पादन 13-15 को प्रभावित करती है कि प्रदर्शन किया है, और इसमें शामिल लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन की कई 16,17 पहचान की गई है.
Koene एट अल 16 में सूचित किया तरीकों का एक विस्तार है जो इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य, gastropod मोलस्क में अंडे बिछाने के विभिन्न मानकों पर लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए है. यह प्रोस्टेट ग्रंथि (यानी, लाभदायक तरल पदार्थ के उत्पादन पुरुष उपग्रंथि) एक मानकीकृत प्रयोगशाला संस्कृति से यौन पृथक दाता घोंघे की की विच्छेदन के द्वारा पूरा किया है. दूसरा, दाता के शुक्राणु लाभदायक vesicles से इकट्ठा किया जाता है और विभिन्न उपचार समाधान बना रहे हैं. बाद में, परीक्षण घोंघे anaesthetized रहे हैं और intravaginally उदाहरण के लिए एक परीक्षण समाधान (इंजेक्शन के साथअकेले प्रोस्टेट ग्रंथि निकालने, शुक्राणु के साथ प्रोस्टेट ग्रंथि निकालने, लड़का शुक्राणु, अकेले वाहक मध्यम). ये परीक्षण घोंघे तो अंडा बिछाने रिकॉर्ड करने के लिए, मानक परिस्थितियों में, सप्ताह के लिए निम्न दिनों के लिए निगरानी कर रहे हैं. अंडा जनता डिजिटली गिनती और विभिन्न मापदंडों को मापने के लिए स्कैन, एकत्र, और फिर अंडे सेने के लिए व्यक्तिगत शीशियों में डाल रहे हैं. के बारे में दो सप्ताह के बाद, hatchlings गिना और डिजिटल रूप से स्कैन कर रहे हैं. अंडा जनता और hatchlings दोनों के सभी स्कैन,, तो एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं.
इस प्रोटोकॉल के लिए महान तालाब घोंघा, Lymnaea stagnalis, की प्रयोगशाला तनाव एम्स्टर्डम में नजरों से देख विश्वविद्यालय में विकसित किया जाता है, जो प्रयोग किया जाता है. इस प्रजाति यौन चयन और hermaphrodites में प्रजनन के बारे में सवालों की जांच के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है. जानवर के अपेक्षाकृत बड़े आकार यह प्रयोगात्मक बहुत सुलभ बना देता है. इसके अलावा, क्योंकि यह कई ख में एक मॉडल प्रजाति के रूप में प्रयोग किया जाता हैiological विषयों हम पहले से ही इन जानवरों के मूल जीव विज्ञान के बारे में बहुत कुछ पता है. इस विधि सामान्य रूप में लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं कि यौन चयन की प्रक्रिया के बारे में प्रश्नों का अध्ययन करने में मदद मिलेगी. इन एक साथ hermaphrodites हैं क्योंकि इसके अलावा, यह वे लिंगों 16,17 अलग हो रहे हैं, जहां प्रजातियों में कर के रूप में इस तरह के प्रोटीन समान और / या अलग अलग तरीकों से काम करते हैं कि क्या पता करने के लिए संभव है.
Protocol
1. ब्रीडिंग सुविधा
- नजरों से देख विश्वविद्यालय में एक तरह एक प्रयोगशाला संस्कृति से Lymnaea stagnalis (एल) के वयस्क नमूने प्राप्त.
- निरंतर पानी एक्सचेंज है जो प्रजनन की सुविधा (molluscarium) और प्रयोगात्मक टैंक, दोनों में 20 डिग्री सेल्सियस पर कम तांबा पानी बनाए रखें.
- 12 घंटा: 12 घंटे में / प्रकाश अंधेरे चक्र निर्धारित करें.
- प्रजनन के लिए, वयस्क घोंघे कीटनाशक मुक्त सलाद यथेच्छ खिलाने TetraPhyll (मछली खाना) के गुच्छे के साथ युवा किशोरों खिलाओ. एक 24 घंटे की समय सीमा के भीतर रखा जाता है जो अंडा जनता से शुरू, अपनी उम्र के हिसाब से अलग टैंक में घोंघे बनाए रखें.
- घोंघे वे के प्रभाव से बचने के लिए, वापस नहीं कर रहे प्रजनन टैंक से हटा रहे हैं एक बार थोड़ा अलग परिस्थितियों में और साथ ही pseudoreplication को रोकने के लिए रखा गया है.
2. विच्छेदन
- 1 सप्ताह के लिए घोंघे अलग, और था सुनिश्चित करने के लिए, जी भरकर उन्हें खिलानेटी वे पूर्ण शुक्राणु और लाभदायक तरल पदार्थ भंडार है.
- एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप, पिन के साथ एक विच्छेदन प्लेट, छोटे शल्य कैंची, मोटे और ठीक संदंश, एक 50 मिमी 2 MgCl समाधान, इंजेक्शन सुई (0.3 मिमी x 13 मिमी) और कुछ कागज तौलिए से भरा एक 10 मिलीलीटर सिरिंज तैयार करें.
- MgCl (31.6 ± 2.1 मिमी और गीला वजन 0.55 ग्राम ± 2.89 की की एक खोल लंबाई के साथ वयस्क घोंघे के लिए आम तौर पर 3 मिलीग्राम या अधिक) 2 समाधान इंजेक्शन द्वारा एक घोंघा euthanize. एक 45 डिग्री के कोण पर इंजेक्शन की सुई के साथ पैर घुसना और घोंघा आराम और (सेकंड के भीतर) विस्तारित रहता है जब तक धीरे लगातार दबाव लागू करने से इंजेक्षन. इंजेक्शन की सुई निकालें और घोंघा (मूंछ वापसी पलटा अनुपस्थित है कि क्या जाँच करके, उदाहरण के लिए) euthanized है या नहीं.
- ध्यान से मोटे संदंश का उपयोग करके अपने वक्रता निम्नलिखित खोल हटा दें. आधे रास्ते, धीरे संदंश के साथ scraping द्वारा खोल से columellar मांसपेशी अलग. धीरे टी मोड़वह खोल के समापन का निर्देश अपने खोल से बाहर घोंघा.
- विच्छेदन की थाली पर घोंघा प्लेस और पैर के पीछे के अंत नीचे पिन. फिर, सिर के माध्यम से एक पिन डाल दिया और विच्छेदन की सुविधा के लिए घोंघा पर कुछ तनाव में डाल दिया.
- बाद में विच्छेदन के लिए एक संदर्भ बिंदु होगा जो महिला gonopore, स्थानीयकरण.
- शल्य कैंची और ठीक संदंश का प्रयोग, बस आच्छादन की बढ़त के तहत, पहले चीरा और महिला gonopore की ओर काटा. कैंची 'ब्लेड से एक शरीर दीवार के नीचे धकेल दिया जाता है, तो केवल शरीर दीवार, और आंतरिक अंगों में से कोई भी कट जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए यह थोड़ा ऊपर उठा. सिर की ओर gonopore ऊपर कटौती जारी है और एक सीधी रेखा में कटौती.
- प्रोस्टेट ग्रंथि (पीछे) और लाभदायक vesicles (पूर्वकाल) स्थानीयकरण. ध्यान से इन काटना और बर्फ पर रखने के लिए उन्हें. लाभदायक तरल पदार्थ और / या शुक्राणु युक्त परीक्षण समाधान करने के लिए इन का उपयोग करें. शारीरिक Lymnaea साल का प्रयोग करेंine (5.83 mmol / एल 2 CaCl · 2H 2 हे, 3.76 mmol / एल 2 MgCl · 6 2 हे, 42.69 mmol / एल NaCl, 37.53 mmol / एल KCl) एक वाहक माध्यम के रूप में.
- प्रोस्टेट ग्रंथि के लुमेन के साथ ही लाभदायक vesicles से शुक्राणु में मौजूद है कि लाभदायक तरल पदार्थ ले लीजिए. इसके बाद धीरे उनकी सामग्री व्यक्त करने और एक संदंश के साथ अंग के ऊतकों को निकाल कर अलग शीशियों में खारा में दोनों को निलंबित. बर्फ पर रखें और उसी दिन का उपयोग करें. बाद में, विभिन्न उपचार समाधान बनाने के लिए इन निलंबन मिश्रण.
3. Intravaginal इंजेक्शन
- Intravaginal इंजेक्शन प्रक्रिया शुरू करने से पहले, (शैल की नोक फिट करने के लिए बनाया) एक सिलिकॉन खोल ढालना तैयार, 1 मिमी सीरिंज, 1 मिमी की एक व्यास के साथ 10-12 सेमी सिलिकॉन टयूबिंग, (इंजेक्शन सुई पा 0.3 मिमी x 13 मिमी ), मोटे संदंश और एक तेज इंजेक्शन की सुई के साथ लगे एक 50 मिमी 2 MgCl समाधान के साथ भरा ही 10 मिलीलीटर सिरिंज.
- कुछ उपचार में लाभदायक तरल पदार्थ (या व्यक्ति लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन) को जोड़ने के लिए आवश्यक शुक्राणु, ले लीजिए; एक जैविक रूप से प्रासंगिक खुराक एक प्रोस्टेट ग्रंथि और इंजेक्शन प्रति लाभदायक पुटिका के 1/3 के बराबर होती है.
नोट: प्रतिनिधि परिणाम खंड (चित्रा 1) में तीन अलग अलग उपचार के साथ एक प्रयोग के परिणामों से पता चला रहे हैं: कंट्रोल लड़की (वाहक मध्यम, यानी, खारा), Ovipostatin (पहचान लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन में से एक) और Ovipostatin शुक्राणु के साथ साथ. इसके अलावा, अन्य प्रजातियों में जैविक रूप से प्रासंगिक खुराक अनुमान लगाने के लिए, हाल ही में mated और 16 यौन पृथक बनी कि व्यक्तियों है कि व्यक्तियों की प्रोस्टेट ग्रंथि के वजन में अंतर को निर्धारित. - तैयार परीक्षण से हर समाधान के लिए 1 मिलीलीटर सीरिंज तैयार करें. एक समाधान के साथ प्रत्येक सिरिंज भरें और अंदर कोई हवाई बुलबुले हैं कि सुनिश्चित करते हैं.
- प्रत्येक सिरिंज पर एक पा इंजेक्शन की सुई से फिट है.
- इंजेक्शन एक 1 उपयोग करने के लिए10 सेमी की एक न्यूनतम लंबाई के साथ मिमी व्यास सिलिकॉन ट्यूब.
- ध्यान ट्यूब बेध नहीं यकीन कर रही है, इंजेक्शन की सुई से अधिक सिलिकॉन ट्यूब स्लाइड, और धीरे सिरिंज पर दबाव लागू करने से ट्यूब से हवा निकाल देते हैं.
- बिंदु 2.3 के रूप में ही प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एक घोंघा बेहोश करना. इस बार 50 मिमी 2 MgCl से अधिक 2-3 मिलीलीटर इंजेक्षन करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें.
- एक स्थिर स्थिति में रखने के लिए खोल मोल्ड में घोंघा निर्धारित करना.
- (इस स्थान भी मीठे पानी घोंघे की अन्य प्रजातियों के लिए लागू होता है) स्पष्ट रूप से सही मूंछ और पुरुष gonopore को पशु, पूर्वकाल के सही पक्ष पर एक सफेद स्थान के रूप में दिख रहा है जो महिला gonopore, जानें. अबाधित पहुंच है सुनिश्चित करें.
- सिलिकॉन ट्यूब के अंत पकड़ और धीरे महिला gonopore में सिलिकॉन ट्यूब के लगभग 2-4 मिमी सम्मिलित करने के लिए एक संदंश का प्रयोग करें.
- ध्यान से सिरिंज के लिए दबाव लागू करते हैं और परीक्षण समाधान के 0.03 मिलीलीटर इंजेक्षन. आधे से एक मिनट रुकोट्यूब को हटाने से पहले महिला पथ में प्रसार करने के लिए ट्यूब में दबाव अनुमति देने के लिए ute.
- यह नजर रखी जा सकती है, जहां उसके अलगाव के कंटेनर, के लिए इलाज घोंघा लौटें, और यह प्रयोगात्मक टैंक में बेहोश करने की क्रिया से उबरने के लिए अनुमति देते हैं.
4. Bioassay
- पहचान के लिए प्रत्येक घोंघा लेबल और अपनी खोल लंबाई मापने. बाद के प्रजनन उत्पादन बढ़ाता है जब प्रासंगिक है जो आकार का एक अच्छा संकेत है.
- प्रयोगात्मक टैंक के भीतर पानी आदान प्रदान के लिए अनुमति देने के लिए छिद्रित है कि एक 460 मिलीलीटर कंटेनर में पृथक प्रत्येक घोंघा रखें. यह कुशल पानी आदान प्रदान के लिए अनुमति देने के लिए, पानी के प्रवाह की दिशा में छेद के साथ, सही ओरिएंटेशन में सभी कंटेनरों जगह महत्वपूर्ण है.
- Bioassay के दौरान, सलाद की एक मानकीकृत राशि के साथ नियमित रूप से घोंघे खिलाओ. सलाद में कटौती करने के लिए एक दौर, धातु छेदने का प्रयोग करें. इस प्रोटोकॉल में 19.6 सेमी 2 का सलाद डिस्क एक अनुमान लगाती है, जो उपयोग किया जाता हैवे ज़्यादा से ज़्यादा एक दिन में खा सकते हैं माउंट.
- एक रंग के फ्लैट की ओर का उपयोग कर एक अंडा जन लीजिए और कंटेनर की दीवार से अंडा जन परिमार्जन. अंडा जन एकत्र करने के लिए चम्मच पक्ष का प्रयोग करें.
नोट: बस निर्धारित किया गया है कि अपारदर्शी अंडा जनता (वे बिछाने के बाद कुछ ही घंटों के भीतर पारदर्शी हो) स्कैनिंग के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. वे प्रति सप्ताह 2-3 अंडे जनता उत्पादन के बाद से इस प्रोटोकॉल में मॉडल प्रजातियों के लिए, Lymnaea stagnalis, हर दिन, अंडा जनता के लिए जाँच करें. यह अन्य प्रजातियों में अलग कर सकते हैं. - स्कैनर चालक युक्त (लैपटॉप) कंप्यूटर, एक फ्लैट बिस्तर स्कैनर, एक मानक मिलीमीटर पैमाने पर, एक रंग, प्लेट और गिलास टाइल के हस्तांतरण का उपयोग कर डिजिटल एकत्र अंडा जनता स्कैन करें.
- स्थानांतरित प्लेटों पर प्रत्येक अंडे जन रखें और प्लेट पूरा कर रहे हैं जब तक दोहराएँ. बाद में, अंडा जनता कागज तौलिया पर सूखी थपका और स्थानांतरित प्लेटों पर के रूप में एक ही क्रम में कांच टाइल पर उन्हें स्थानांतरण.
- (उल्टा प्रत्येक टाइल मुड़ेंअंडा जनता ग्लास टाइल के लिए छड़ी) और ध्यान से सिर्फ मिलीमीटर पैमाने के तहत, flatbed स्कैनर पर जगह होगी. वे सभी एक ही फोकस विमान के भीतर दिखाई दे रहे हैं ताकि समान रूप से अंडे वितरित करेंगे, जो अंडा जनता को समतल करने के लिए दबाव का एक सा लागू करें. सभी अंडे समान रूप से चपटा कर रहे हैं विश्वास दिलाता हूं कि दो किनारों के आसपास टेप की एक मानकीकृत राशि के साथ टाइल फ़िट.
- स्कैनर सेटिंग्स समायोजित करें. यह अपने अधिकतम करने के संकल्प को समायोजित एक पूर्वावलोकन स्कैन करना, कार्य क्षेत्र की फसल, और चमक और विपरीत समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है. अंडा जनता स्कैन करें.
- आगे के विकास और अंडे सेने के लिए अपने स्वयं के लेबल 20 मिलीलीटर कांच की शीशी में प्रत्येक अंडे जन रखें.
- ठीक से ऑक्सीजन इसे रखने के लिए हर दूसरे दिन शीशियों सेने में पानी को ताज़ा करें. इस क्रम में hatchling संख्या और आकार के अनुसार इस कार्य करें: (कोई hatchlings) बंद घनघोर / decanting (अंडे सेने की शुरुआत) बह निकला, और एक विंदुक (कई hatchlings) के साथ पानी बाहर निकालने.
- आज़ादी से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ImageJ (एनआईएच, यूएसए) और सेल काउंटर प्लगइन स्थापित करें.
- ओपन ImageJ के साथ ही करने के लिए डेटा स्थानांतरण करने के लिए एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम. फिर ImageJ में अंडा जनता की स्कैन की तस्वीर खुला.
- मिलीमीटर पैमाने पर नेविगेट करने के लिए ज़ूम उपकरण का उपयोग करके पैमाने पर सेट. में ज़ूम और स्क्रीन को भरने के लिए 1 मिमी के लिए खिड़की को समायोजित. 1 मिमी से संकेत मिलता है कि दो लाइनों के बीच की रेखा उपकरण का उपयोग कर एक रेखा खींचना. विश्लेषण करने के लिए नेविगेट करें, और पैमाने पर सेट. पॉप अप मेनू में मापा लंबाई विकल्प 1 के लिए जाना जाता दूरी को समायोजित करने और लंबाई की इकाई मिमी, दृश्य बन जाता है. बॉक्स ग्लोबल जाँच करें, और विंडो बंद करें.
- विश्लेषण करने के लिए नेविगेट द्वारा पसंद माप (लंबाई, चौड़ाई, परिधि) सेट, और इस क्षेत्र और Feret व्यास (लंबाई और चौड़ाई) का चयन करके माप सेट करें. पुष्टि करें और छवि विश्लेषण के साथ जारी रखने के लिए ठीक क्लिक करें.
- अंडे को मापने के लिए, Zoमापा जा करने की जरूरत है कि पहले अंडा द्रव्यमान का एक अंडे पर में ओम. 800% की एक ज़ूम सिफारिश की है. फिर, अण्डाकार उपकरण बिल्कुल अंडा, प्रेस Ctrl चारों ओर एक अंडाकार आकर्षित उपयोग कर डी + (दो बार एक ही अंडा मापने रोकने के लिए) छवि पर परिधि आकर्षित करने के लिए. फिर अंडाकार (लंबाई, चौड़ाई, परिधि) के गुणों के उपाय रिकॉर्ड करने के लिए Ctrl + M दबाएँ; एक पॉप अप स्क्रीन माप प्रदर्शित खोलता है.
नोट: अंडे को मापने के लिए अंडाकार उपकरण के उपयोग के सभी प्रजातियों के लिए लागू नहीं होता. गैर समान रूप से आकार के अंडे के साथ प्रजातियों के लिए, बजाय मुक्तहस्त चयन का उपयोग करें. - के रूप में आवश्यक के रूप में कई अंडे के उपाय और तब. Xls कार्यपत्रक के उपाय बचा. वैकल्पिक रूप से, सीधे एक वर्कशीट में डेटा की प्रतिलिपि.
- इसके बाद काउंटर खिड़की का उपयोग करके, एक अंडा मास के भीतर अंडे गिनती और मैन्युअल वर्कशीट में गिना जाता है डाल दिया.
- वैकल्पिक रूप से, सेल काउंटर प्लग की मदद से अंडे बड़े पैमाने पर प्रति व्यक्ति अंडे गिनती. इसके लिए, प्लग इन करने के लिए नेविगेटतो, विश्लेषण और सेल काउंटर का चयन करें. सेल काउंटर खिड़की 'को प्रारंभ' बॉक्स और प्रेस 'मूल रखने' की जांच, पॉप जाएगा. एक नए काउंटर खिड़की उपकरण पट्टी से crosshair उपकरण का चयन और सेल काउंटर मेनू में एक काउंटर प्रकार का चयन करें, प्रकट होता है. सेल काउंटर खिड़की में व्यक्तिगत अंडे पर क्लिक करके व्यक्तिगत अंडे गणना. सेल काउंटर मेनू में काउंटर प्रकार के बगल में कुल गिनती का निरीक्षण करें. एक स्प्रेडशीट के लिए मैन्युअल रूप से इस संख्या कॉपी या परिणाम दबाकर परिणाम प्राप्त करते हैं.
- यदि आवश्यक हो, काउंटर प्रकार जोड़कर एक गिनती घटना के भीतर अनेक अंडा जनता गणना.
Representative Results
चित्रा 1 नियंत्रण पदार्थ (खारा) या तो की intravaginal इंजेक्शन के बाद अंडे बिछाने जानवरों का प्रतिशत दिखाता है, Ovipostatin, या Ovipostatin शुक्राणु के साथ साथ. एन प्रत्येक उपचार के लिए 15 =; . विवरण और आँकड़ों के लिए Koene एट अल 16 देखें (स्रोत:. Koene एट अल 2010, एक PLoS से चित्रा 3).
चित्रा 1. Lymnaea stagnalis की अंडा उत्पादन बड़े पैमाने पर Ovipostatin का प्रभाव. ग्राफ नियंत्रण पदार्थ (खारा) या तो की intravaginal इंजेक्शन के बाद अंडे बिछाने जानवरों का प्रतिशत दिखाता है, Ovipostatin, या Ovipostatin शुक्राणु के साथ साथ. एन प्रत्येक उपचार के लिए 15 =; Koene एट अल देखते हैं. 2010 विवरण और आँकड़े. Koene एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण 2010 PLoS एक 5:. E10117.
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल लाभदायक तरल पदार्थ और कैसे एक जैविक रूप से सार्थक ढंग से इस परीक्षण करने के लिए इकट्ठा करने के लिए कैसे दिखाता है. यहाँ इस प्रक्रिया प्रोस्टेट ग्रंथि निकालने का उपयोग कर दिखाया जाता है, एक एकल शुद्ध लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन का प्रभाव भी उसी प्रक्रिया का पालन परीक्षण किया जा सकता है. जाहिर है, इस तरह के परीक्षणों में यह प्रक्रिया और / या वाहक मध्यम सवालों 14,16 में मानकों को प्रभावित नहीं करते, यह सुनिश्चित करने के लिए उचित नियंत्रण (नकली उपचार) में शामिल करने के लिए हमेशा महत्वपूर्ण है. इस विधि का प्रयोग, यह पहले से ही अंडा 14,16 बिछाने में कमी की मध्यस्थता करता है कि एक भी लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन, अर्थात् Ovipostatin, वहाँ है कि दिखाया गया है. प्रोस्टेट ग्रंथि में उत्पादित और शुक्राणु के साथ संभोग के दौरान तबादला इस प्रोटीन,, एक साथ उभयलिंगी में पहली बार पूरी तरह से विशेषता लाभदायक तरल पदार्थ घटक का प्रतिनिधित्व करता है और अब तक ज्ञात प्रोटीन के साथ कोई समानता नहीं दिखा है.
लग रहा है कि Ovipostaटिन प्राप्तकर्ता में अंडा उत्पादन बड़े पैमाने पर वीर्य में पदार्थों 13-15 बिछाने अंडे को प्रभावित कर सकते संकेत है कि पहले काम की पुष्टि होती है कम कर देता है. जैविक रूप से प्रासंगिक मात्रा में स्थानांतरित करके (3.2 16 देखें), एक खांसने यह अंडे में मनाया कमी बिछाने (चित्रा 1) mediates कि एक लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन, और नहीं शुक्राणुओं की उपस्थिति के लिए खुद को, है कि प्रदर्शन कर सकते हैं. प्राकृतिक matings के माध्यम से लाभदायक तरल पदार्थ के दोहराया रसीद अंडा 15 प्रति निवेश बढ़ जाती है कि यह देखते हुए, यह अब अंडे बिछाने के अन्य मानकों यों के लिए बेहद प्रासंगिक हो जाता है. प्रस्तुत प्रोटोकॉल अब ऐसा करना आवश्यक तरीके प्रदान करता है. कोई प्रभाव नहीं प्राप्तकर्ता 16 से रखी अंडे की सफलता सेने पर Ovipostatin का पाया गया था, हालांकि, इस प्रोटीन के साथ मिलकर काम करते हैं कि अन्य लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन हो सकता है. इसलिए, इस संदर्भ में मात्रा निर्धारित करने की आवश्यकता है कि मापदंडों - अगले आवृत्ति और अंडे की संख्या बिछाने के लिए - अंडे के आकार, hatc शामिलहिंग समय, hatchling विकास और hatchling आकार. इसके अलावा, यह ऐसे शुक्राणु भंडारण और उपयोग, साथ ही साथ महिला और पुरुष समारोह 14,17 दिशा में प्रजनन संसाधनों के आवंटन के रूप में अंडे बिछाने से अन्य महिला प्रक्रियाओं, पर प्रभाव को देखने के लिए संभव है. जाहिर है, प्रस्तुत विधि Lymnaea stagnalis में और अन्य ताजा पानी घोंघे में दोनों, इन फॉलोअप मुद्दों के समाधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है.
संक्षेप में, लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन का तबादला कि इस प्रोटोकॉल शो का उपयोग कर प्रयोगों इन एक साथ hermaphrodites में प्राप्तकर्ता की महिला प्रजनन के प्रदर्शन को प्रभावित. कुछ अध्ययनों से इस को संबोधित किया है कि को देखते हुए इसे और अधिक आम वर्तमान में वैज्ञानिक साहित्य में परिलक्षित होता है की तुलना में आंतरिक hermaphrodites fertilizing में होने की संभावना है. एक पूर्व मैथुनविषयक दोस्त चुनाव और शुक्राणु प्रतिस्पर्धा इन hermaphrodites 14, में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है यह जानता है कि विशेष रूप से जब जो highlighटीएस ऐसे पुरुष उपग्रंथि प्रोटीन की संभावित यौन इस प्रणाली में चयनित किया जाना है. अंत में, इस शोध वे अलग sexed-प्रजातियों के लिए कर रहे हैं के रूप में लाभदायक तरल पदार्थ प्रोटीन एक साथ hermaphrodites के लिए समान महत्व के हैं कि विकासशील धारणा का समर्थन करने में मदद करता है.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता के लिए, वॉयस ओवर के लिए मुख्यमंत्री Popelier, एस Ypenburg और सी. लेवेस्क एमआर HELMUS धन्यवाद. इस शोध को आर्थिक रूप से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO), कला और विज्ञान के रॉयल नीदरलैंड अकादमी (KNAW) और जापान छात्र सेवा संगठन (Jasso) द्वारा समर्थित है. इस प्रकाशन JMK को NWO के एक ओपन एक्सेस अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
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