Abstract
В внутренне удобрения животных, семенной жидкости, как правило, добавляется к сперматозоидов, вместе образуя сперму или эякулята. Кроме питательный и активации спермы, компоненты в семенной жидкости также может влиять на женскую физиологию, чтобы увеличить оплодотворения успех донора спермы. Хотя многие исследования показали, такие эффекты в видов с отдельными полов, в немногих исследованиях затрагивается это в одновременно гермафродитных животных. Этот протокол видео представлен метод для изучения последствий семенной жидкости в брюхоногих, используя одновременно гермафродиты пресноводных улиток, великий пруд улитки Lymnaea stagnalis, а модельный организм. Хотя процедура показана с помощью полные железы экстракты, отдельные компоненты (например, белки, пептиды и другие соединения) из семенной жидкости могут быть проверены таким же образом. Последствия получения эякулята компонентов на откладки яиц может быть определена количественно с точки зрения частоты откладки яиц иболее тонкие оценки женской репродуктивной производительности, таких как номера яичных внутри каждого яйца масс. Результаты показывают, что семенной жидкости белки влияют женскую репродуктивную выход в этой одновременной гермафродита, подчеркнув их важность для полового отбора.
Introduction
При передаче, сперматозоиды обычно сопровождаются семенной жидкости производимого мужчин придаточных желез. В то время как некоторые компоненты эякулята играют роль в питательный и активации спермы 1, другие влияют женской физиологии с целью повышения оплодотворения успех донора спермы 2-4. Такие эффекты особенно отобраны, через половой отбор, когда вид весьма разнородный и имеет эффективное хранение спермы и сперматозоидов пищеварение. В таких условиях, доноров спермы конкурировать тяжело для оплодотворения яиц 5. В то время как имеется много корреляционный доказательства важности семенной жидкости веществ для мужского успеха оплодотворения, прямых доказательств реже и лишь в немногих исследованиях вникал в детали физиологического изменения и / или веществ, участвующих 6.
У видов с отдельными полов (например, самцов и самок; gonochorists) Есть несколько хорошо исследованы модели SPECIэс когда дело доходит до состава семенной жидкости и их последствий. Примеры включают дрозофилу, Дрозофилы 6, малярийного комара Anopheles, gambiae 7 и красную муку жука, Tribolium castaneum 8. Такие семенных исследования жидкости встречаются значительно реже, когда речь идет видов, являющихся одновременно гермафродиты (т.е. люди функционально мужчины и женщины в то же время), хотя этот способ воспроизводства существует во всем животном царстве 9. Наиболее заметным гермафродиты пример передачи аксессуар вещества железы, вероятно, стрельба из так называемых любовных дартс в сухопутные улитки 2,10, где вещество, переданных донора спермы через подкожной инъекции 11,12, т. е. не вместе с сперматозоидов. Но есть много одновременных гермафродиты, которые передают мужчин продукты аксессуар железы вместе с их спермы,таких как вида модель, используемая здесь, великий пруд улитки Lymnaea stagnalis. Предыдущие исследования уже показали, что получение семенной жидкости влияет на женскую репродуктивную вывод этого вида 13-15, и некоторые из вовлеченных семенной жидкости белков были идентифицированы 16,17.
Общая цель этого протокола, который является расширением из методов, представленных в Koene др. 16, заключается в проверке последствий семенной жидкости белков по различным параметрам откладки яиц в брюхоногих моллюсков. Это достигается путем рассечения железы (т.е. мужского аксессуара железы по производству семенной жидкости) сексуально изолированных доноров улиток из стандартизированной лабораторной культуре. Во-вторых, сперма донора собирают из семенных пузырьков и различных решений для обработки сделаны. Впоследствии испытаний улитки анестезируют и интравагинально вводят с помощью испытуемого раствора (например,простаты экстракт железы один, простаты экстракт железы спермой, в одиночку спермы, несущей только среду). Эти тестовые улитки затем контролировали в течение следующих дней до нескольких недель, в стандартных условиях, чтобы записать откладки яиц. Яичные массы собраны, сканируются для подсчета и измерения различных параметров, а затем положить в отдельных флаконах для вылупления. Примерно через две недели, птенцы подсчитываются и сканируются. Все сканы, обеих кладок и птенцов, которые затем анализируются с помощью свободно-доступное программное обеспечение для анализа изображений пакет.
Для этого протокола лабораторный штамм великого пруд улитки, Lymnaea stagnalis, используется, который разводят в VU университета Амстердама. Этот вид служит в качестве модельной системы для исследования вопросов о половой отбор и воспроизводство в гермафродитов. Относительно большой размер животного делает его экспериментально очень доступно. Кроме того, так как он используется в качестве модельных видов во многих бiological дисциплины мы уже знаем много о фундаментальной биологии этих животных. Этот метод поможет изучить вопросы о процессах полового отбора, которые опосредованных через семенной жидкости белков в целом. Кроме того, поскольку эти одновременные гермафродиты, можно обратиться ли такие белки действуют в аналогичных и / или различными способами, как в видов, где полов разделенных 16,17.
Protocol
1. Питомника
- Получить взрослых особей Lymnaea stagnalis (L.) из лабораторной культуры, как тот в VU университета.
- Поддерживайте с низким содержанием меди воды при 20 ° С, как в разведении (molluscarium) и экспериментальных танков, которые имеют постоянный обмен воды.
- Установите цикл свет / темнота в 12 часов: 12 час.
- Для разведения, кормления взрослых улиток пестицидов салат без ограничений, кормить молодых птенцов с TetraPhyll (корм для рыб) хлопья. Поддерживать улиток в отдельных цистернах в соответствии с их возрастом, начиная с кладок, которые заложены в сроки с 24 часами.
- После того, как улитки удаляются из рыборазводных аквариумах они не вернулись, чтобы избежать последствий остались лежать в несколько отличающихся условиях, а также для предотвращения pseudoreplication.
2. Вскрытие
- Изолировать улиток в течение 1 недели, и кормить их вволю, чтобы обеспечить тхат они имеют полный спермы и семенной жидкости магазинов.
- Подготовка Стерео микроскоп, рассечение тарелку с булавками, небольшие хирургические ножницы, грубые и тонкий пинцет, мл шприц 10, заполненный с MgCl 2 решения 50 мм, инъекционных игл (0,3 мм х 13 мм) и некоторые бумажные полотенца.
- Усыпить улитку путем введения MgCl 2 решение (как правило, 3 мл или больше для взрослых улиток с длиной раковины 31,6 ± 2,1 мм и сырой вес 2,89 ± 0,55 г). Проникнуть ногу с инъекционной иглой на ° углом 45 и ввести осторожно применяя давление непрерывно, пока улитка не расслабляет и остается продлен (в течение нескольких секунд). Снимите инъекционной иглы и проверить, является ли эвтаназии улитка (например, путем проверки щупальце вывод рефлекс отсутствует).
- Осторожно снимите оболочку после его кривизны с помощью грубых щипцов. На полпути, мягко отсоединить columellar мышцы от оболочки, очищая пинцетом. Аккуратно скрутить тон улитки из его оболочки, после направлении обертывани оболочки.
- Поместите улитку на вскрытии пластины и придавить заднюю часть стопы. Затем поместите булавку через голову и положить некоторую напряженность на улитку, чтобы облегчить рассечение.
- Локализация женский gonopore, которые в дальнейшем быть ориентиром для вскрытия.
- Используя хирургические ножницы и тонкий пинцет, сделать первый надрез, как раз под краем мантии и сократить к женской gonopore. Когда один из ножей ножниц "выталкивается под стенкой тела, немного приподнимите его, чтобы гарантировать, что только стенки тела, и ни один из внутренних органов, режется. Продолжить резки над gonopore к голове и вырезать по прямой.
- Локализация предстательной железы (задний) и семенные пузырьки (передние). Проанализируйте эти тщательно и держать их на льду. Используйте их, чтобы сделать тестовые растворы, содержащие семенной жидкости и / или сперму. Используйте физиологический Lymnaea салине (5,83 ммоль / л CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 ммоль / л MgCl 2 · 6H 2 O, 42,69 ммоль / л NaCl, 37,53 ммоль / л KCl) в качестве среды-носителя.
- Сбор семенную жидкость, которая присутствует в просвете железы, а также спермы из семенных пузырьков. Впоследствии приостановить как в физиологическом растворе в отдельных флаконах, осторожно выражая их содержание и удаление ткани органа с пинцетом. Держите на льду и использовать в тот же день. Позже, смешивать эти суспензий для создания различных решений по лечению.
3. Влагалищном впрыска
- Перед началом внутривлагалищного процедуру инъекции, подготовить кремния оболочки-формы (сделанный для приспособления кончик оболочки), 1 мм шприцы, 10-12 см кремния трубки диаметром 1 мм, притупляются инъекционных игл (0,3 мм х 13 мм ), грубые щипцы и той же 10 мл шприц наполнен мМ MgCl2 раствора 50 установлены с резким инъекционной иглой.
- Сбор спермы, необходимое для добавления в семенной жидкости (или отдельных семенной жидкости белков) в некоторых обработок; биологически значимым доза равна 1/3 предстательной железы и семенных пузырьков на инъекцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: в результатах разделе представительной (рис. 1) результаты эксперимента с тремя различными лечения показаны: Control (носитель среднего, т. е. физиологический), Ovipostatin (один из выявленных семенной жидкости белков) в покое и Ovipostatin сопровождается спермой. Кроме того, для оценки биологически соответствующую дозу у других видов, определить разницу в весе предстательной железы лиц, которые недавно сопряженных и отдельных лиц, которые остались сексуально-изоляции 16. - Подготовка 1 мл шприцы для каждого из подготовленных испытуемых растворов. Заполните каждый шприц с одним решением и убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха внутри.
- Установите притупленную инъекционной иглы на каждом шприце.
- Для инъекций используют 1мм Диаметр силиконовая трубка длиной минимум 10 см.
- Аккуратно вставьте кремния трубку на инъекционной иглой, следя, чтобы не проколоть трубку и удалите воздух из трубки, осторожно применяя давление на шприц.
- Анестезировать улитку, следуя той же протокол, что и в пункте 2.3. На этот раз убедитесь, что не вводят более 2-3 мл 50 мМ MgCl 2.
- Положите улитку в раковине-формы, чтобы держать его в устойчивом положении.
- Расположить женского gonopore, который четко видны в виде белой точки на правой стороне передней животных, в правый щупальцу и мужского gonopore (это положение также применимо к другим видам пресноводных улиток). Убедитесь в том, чтобы иметь беспрепятственный доступ.
- Используйте пинцет, чтобы удерживать конец силиконовой трубки и аккуратно вставьте примерно 2-4 мм в силиконовой трубки в женский gonopore.
- Осторожно надавливайте на шприц и впрыснуть 0,03 мл исследуемого раствора. Подождите половину минЮт, чтобы давление в трубе, чтобы распространиться в женский тракта, прежде чем снимать трубку.
- Вернуться обработанной улитку его изоляции контейнера, где он может быть контролируемой, и дать ему возможность оправиться от седации в экспериментальной бака.
4. Биопроб
- На каждом улитку для идентификации и измерить его длину оболочки. Последнее является хорошим показателем размера, которая имеет отношение, когда количественной репродуктивного выход.
- Храните каждый улитку изолированы в мл контейнер 460, который перфорированной для обеспечения водообмена в опытном танке. Важно, чтобы поместить все контейнеры в правильной ориентации, при этом перфорации в направлении потока воды, чтобы обеспечить эффективный обмен воды.
- Во время биотестирования, кормить улиток регулярно со стандартизированным количеством салата. Используйте круглую, металл перфоратор сократить салат. В этом протоколе салата диски 19,6 см 2 используются, которая приблизительно равна а,смонтировать они максимально может съесть в один день.
- Сбор в яичную массу с помощью плоской стороной шпателя и скрести яичную массу от стенки контейнера. Используйте ложку сторону собрать яичную массу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Непрозрачные кладки, которые только что были заложены не могут быть использованы для сканирования (они становятся прозрачными в течение нескольких часов после укладки). Для вида модели в этом протоколе, Lymnaea stagnalis, проверьте кладок каждый день, так как они производят 2-3 яичных массы в неделю. Это может отличаться у других видов. - Сканирование собранные яичные массы в цифровом виде, с использованием (ноутбук) компьютер, содержащий драйвер сканера, плоский сканер кровать, стандартный миллиметровая шкала, шпателя, передавая тарелки и стеклянные плитки.
- Место каждого яичную массу на передавших пластин и повторять, пока планшеты не полны. Впоследствии промокните кладки сухой на бумажном полотенце и передавать их на стеклянные плитки в том же порядке, что и на передающих пластин.
- Поверните каждую плитку с ног на голову (кладки будет прилипать к стеклянной плитки) и осторожно поместите его на планшет сканера, только под миллиметровой шкале. Нанесите немного давления, чтобы сгладить яичные массы, которая будет распространять яйца равномерно, чтобы они были видны все в том же фокальной плоскости. Установите плитки с стандартизированной количества ленты вокруг двух ребер, чтобы гарантировать, что все яйца сглажены одинаково.
- Настройте параметры сканирования. Важно настроить разрешение на максимуме, сделать предварительное сканирование, обрезать рабочую зону, а также настроить яркость и контрастность. Сканирование яичные массы.
- Место каждого яичную массу в своем собственном надписью стеклянный флакон 20 мл для дальнейшего развития и вылупления.
- Обновить воду в вылупления флаконы через день, чтобы держать его правильно кислородом. Сделайте это в соответствии с номерами птенцов и размер в следующем порядке: переливание / не слива (нет птенцов), переполненные (начало вылупления), и извлечение из воды с помощью пипетки (многие птенцов).
- Установите свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений ImageJ (NIH, США) и против клеток плагин.
- Открыть ImageJ а также программы электронных таблиц для передачи данных в. Затем откройте отсканированный картину кладок в ImageJ.
- Установите масштаб при помощи функции масштабирования, чтобы перейти к миллиметровой шкале. Увеличение и настроить окно для 1 мм, чтобы заполнить весь экран. Нарисуйте линию с помощью инструмента линии между двумя линиями, которые указывают на 1 мм. Перейдите Анализ и указан масштаб. В всплывающем меню опцию измеренная длина становится видимым, отрегулируйте известном расстоянии в 1 и единица длины в мм. Установите флажок Global, и закройте окно.
- Установка предпочитаемых измерений (длина, ширина, толщина), перейдя в анализируйте и указан Измерения выбрав Площадь и диаметр Фере (длина и ширина). Нажмите кнопку ОК для подтверждения и перехода с изображением анализов.
- Для измерения яйца, зоом в яйце на первой яйцемассы, которая должна быть измерена. Зум 800% рекомендуется. Затем, используя эллиптические инструмент нарисуйте овал именно вокруг яиц, нажмите Ctrl + D, чтобы нарисовать окружность на изображении (для предотвращения измерения те же яйца дважды). Затем нажмите Ctrl + M, чтобы записать меру свойств овала (длина, ширина, толщина); экран всплывающее открывает отображения измерений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование эллиптической инструмента для измерения яйца не относится ко всем видам. Для видов с неравномерно формы яиц, используйте от руки выборы вместо этого. - Измерьте, как много яиц, как необходимые, а затем сохранить меры,. Листа XLS. По желанию, скопировать данные непосредственно в таблицу.
- Впоследствии рассчитывать яйца внутри массы яиц, с помощью окна счетчика и поставить счетчики вручную в таблицу.
- С другой стороны, рассчитывать индивидуальные яиц в кладке с помощью клеточной счетчика плагина. Для этого перейдите к плагинов,затем, анализировать и выберите счетчик Cell. Окно счетчик клеток появится, проверить ", имейте в исходное 'окно и нажмите' инициализации. Появится новое окно счетчика, выберите инструмент перекрестие на панели инструментов и выберите тип счетчика в меню счетчика клеток. Всего отдельные яйца, нажав на отдельных яиц в окне счетчика клеток. Соблюдайте общее число рядом с типом счетчика в меню счетчика клеток. Скопируйте этот номер вручную в электронную таблицу или получить результаты, нажав результаты.
- Всего несколько массы яичные рамках одного события подсчета, добавив типы счетчиков, если это необходимо.
Representative Results
Рисунок 1 показывает процент животных несушек после интравагинального введения либо контрольного вещества (физиологический раствор), Ovipostatin или Ovipostatin сопровождается спермы. N = 15 для каждой обработки; см. Koene др. 16 для деталей и статистики (Источник: Рисунок 3 от Koene др. 2010, PLoS ONE.)..
Рисунок 1. Влияние Ovipostatin на яичной массового производства Lymnaea stagnalis. На графике показывает процент животных несушек после интравагинального введения либо контрольного вещества (физиологический раствор), Ovipostatin или Ovipostatin сопровождается спермы. N = 15 для каждой обработки; см. Koene и др.. 2010 подробная информация и статистика. Перепечатка с разрешения Koene др. 2010 PLoS ONE 5:. E10117.
Discussion
Представленный протокол показывает, как собрать семенную жидкость и как проверить это в биологически значимым образом. Хотя эта процедура здесь показано с помощью простаты экстракт железы, эффект одного очищенного белка семенной жидкости также могут быть проверены в соответствии с процедурой. Очевидно, что в таких испытаний это всегда важно включать соответствующие элементы управления (фиктивных лечения), чтобы гарантировать, что процедура и / или несущая среда не влияют на параметры в вопросах 14,16. Используя этот метод, он уже показал, что существует единая семенных белок жидкости, а именно Ovipostatin, что посредником снижение откладки яиц 14,16. Этот белок, произведенный в предстательной железе и переданы во время спаривания вместе с сперматозоидов, представляет собой первый полностью охарактеризованы семенной компонент жидкости в одновременном гермафродита и делает, до сих пор, не показывают никакого сходства с известными белками.
Тот факт, что Ovipostaолово снижает массовое производство яйцо в получателя подтверждает более раннюю работу о том, что вещества, содержащиеся в сперме может повлиять яйценоскость 13-15. Передавая биологически соответствующих сумм (см. 3.2 16), можно убедительно продемонстрировать, что она является семенной жидкости белок, а не наличие сперматозоидов сами, что посредником наблюдаемое снижение яйцекладки (рис. 1). Учитывая, что повторяется получение семенной жидкости через естественные вязки увеличивает инвестиции за яйца 15, теперь он становится весьма актуальным для количественного другие параметры откладки яиц. Представленный протокол в настоящее время обеспечивает необходимые методы, чтобы сделать так. Хотя никакого эффекта не было найдено Ovipostatin на вылупления успех яиц, отложенных получателю 16, могут быть и другие семенной жидкости белки, которые действуют совместно с этого белка. Таким образом, параметры, которые должны быть количественно в этом контексте - рядом с возложения частоты и яичные номера - включают размер яйцо, hatcВремя Хин, развитие детеныша и размер детеныша. Кроме того, можно посмотреть на воздействие на других женских процессов, чем откладки яиц, таких как хранение спермы и использования, а также распределения репродуктивных ресурсов на дело женского и мужского функции 14,17. Очевидно, что данный способ является инструментом в решении этих последующих вопросов, как в Lymnaea stagnalis и в других улиток пресной воды.
В целом, эксперименты, использующие этот протокол, показывают, что переданные семенной жидкости белки влияют на женскую репродуктивную производительность получателя в этих одновременных гермафродитов. Учитывая, что несколько исследований обратились это, вероятно, будет намного более распространены в внутренне удобрения гермафродитов, чем в настоящее время отражены в научной литературе. Особенно, когда понимаешь, что предварительно совокупительный выбор партнера и спермы конкуренции, как было показано, играют важную роль в этих гермафродитов 14, который ВажнейшееTS потенциал таких мужских белков аксессуар железы, которые будут выбраны сексуально в этой системе. Наконец, это исследование помогает поддерживать развивающийся о том, что семенная жидкость белки имеют равное значение для одновременных гермафродитов, так и для отдельных-сексуально видов.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим MR Хельмус для голоса за кадром, CM Popelier, С. Ypenburg и С. Levesque для оказания технической помощи. Это исследование осуществляется при финансовой поддержке Нидерландской организации научных исследований (NWO), Нидерландской королевской академии искусств и наук (КНАВ) и Японским Студент Services Organization (Jasso). Эта публикация была поддержана Open предоставить доступ СВО к JMK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish food flakes | TetraPhyll | ||
| Stereo microscope | |||
| Small surgical scissors | WPI | ||
| Coarse and fine forceps | WPI | ||
| 10 ml syringe | |||
| Injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5.83 mmol/L CaCl2·2H2O | |||
| 3.76 mmol/L MgCl2·6H2O | |||
| 42.69 mmol/L NaCl | |||
| 37.53 mmol/L KCl | |||
| Two component Silicon | Sylgard | ||
| 1 mm syringes | |||
| Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
| Blunted injection needles (0.3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml perforated containers | |||
| Metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
| Spatula/spoon | |||
| (Laptop) computer | |||
| Flatbed scanner | |||
| Millimeter scale | |||
| Transferring plates | |||
| Glass tiles | |||
| 20 ml glass vials |
References
- Mann, T., Lutwak-Mann, C. Male reproductive function and semen. , Springer-Verlag. (1981).
- Arnqvist, G., Rowe, L. Sexual Conflict. , Princeton University Press. Princeton, New Jersey. (2005).
- Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. Sperm Biology, an Evolutionary Approach. , Elsevier. (2008).
- Koene, J. M., Ter Maat, A. Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection. Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).
- Parker, G. A. Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects. Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).
- Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. The seminal symphony: how to compose an ejaculate. Trends in Ecology & Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).
- Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases. Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).
- Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction. Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).
- Jarne, P., Auld, J. R. Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals. Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).
- Nakadera, Y., Koene, J. M. Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches. Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).
- Chase, R., Blanchard, K. C. The snail’s love-dart delivers mucus to increase paternity. Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).
- Koene, J. M., Chase, R. Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart. Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).
- Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study. Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).
- Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite. Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).
- Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis. Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).
- Koene, J. M., et al. Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite. PLoS ONE. (5), (2010).
- Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite. Current Biology. 24, 1-4 (2014).
