Summary
ووضعت دوامة ميكروفلويديك منصة Electroporation للمساعدة للتسليم متتابعة من الجزيئات متعددة في السكان الخلية متطابقة مع التحكم جرعة دقيقة ومستقلة. حجم استنادا خطوة تنقية الخلية المستهدفة Electroporation للسبقت النظام ساعد على تعزيز كفاءة تسليم الجزيئية وبقاء الخلية المصنعة.
Abstract
تلقت Electroporation للباهتمام متزايد في السنوات الماضية، لأنها هي تقنية قوية جدا لإدخال جسديا تحقيقات الجزيئية الخارجية غير نفيذ في الخلايا. تقارير هذا العمل منصة Electroporation للميكروفلويديك قادرة على أداء العديد تسليم جزيء إلى خلايا الثدييات مع مراقبة دقيقة والمعلمة الجزيئية التي تعتمد على. قدرة النظام على عزل الخلايا مع توزيع حجم موحد يسمح لأقل من التباين في كفاءة Electroporation للفي نظرا لقوة الحقل الكهربائي. وبالتالي تعزيز قابلية العينة. وعلاوة على ذلك، تتيح ميزة عملية التصور من أجل مراقبة عملية امتصاص الجزيئية فلوري في الوقت الحقيقي، والذي يسمح الجزيئية التعديلات المعلمة التسليم الفوري في الموقع لتعزيز الكفاءة. لإظهار قدرات العظمى من منصة عنها، الجزيئات ذات أحجام مختلفة والشحنات الكهربائية (مثل ديكستران مع ميغاواط من 3،000 و 70،000 دا) كانتتسليمها إلى خلايا سرطان الثدي النقيلي مع الكفاءات تسليم عالية (> 70٪) لجميع الجزيئات التي تم اختبارها. وقد أثبتت منصة وضعت إمكاناتها لاستخدامها في توسيع مجالات البحث حيث Electroporation للتقنيات يمكن أن تكون مفيدة على رقاقة.
Introduction
في السنوات الأخيرة، أصبح استخدام النبضات الكهربائية لتسهيل تسليم عصاري خلوي من الجزيئات خارج الخلية وسيلة جذابة بالتلاعب خلايا الثدييات. 1 هذه العملية، التي تعرف أيضا باسم Electroporation لل، permeabilizes عكسية الغشاء الخلوي، مما يسمح للجزيئات الغشاء بطبيعتها غير منفذة للوصول الوسط بين الخلايا إلى الخلايا. لأنه يمكن إدخال تقريبا أي جزيء في العصارة الخلوية عبر خلق المسام مؤقتة في غشاء من أي نوع من الخلايا باستخدام Electroporation لل، تم الإبلاغ عن هذه التقنية بأنها أكثر استنساخه، قابلة للتطبيق عالميا، وأكثر كفاءة من الطرق الأخرى بما في ذلك بوساطة فيروس والكيميائية والنهج البصرية. 2-3 وقد استخدمت هذه التقنية لإدخال جزيئات الفلورسنت، 4 5 المخدرات والأحماض النووية 6-7 مع الحفاظ على خلايا قابلة للحياة وسليمة. ونظرا لهذه الفوائد، اعتمد Electroporation للباعتباره العمل المشتركatory تقنية الحمض النووي لترنسفكأيشن، في الجسم الحي العلاج الجيني 8 والدراسات التطعيم الخلية. هو عليه، ومع ذلك، لا يزال من الصعب على Electroporation للأنظمة التقليدية في وقت واحد لتحقيق الكفاءة والجدوى العملية للعينات مع عدم تجانس كبير الحجم بسبب قوة الحقل الكهربائي اللازمة ل electroporation الناجح يرتبط بشكل وثيق مع قطر الخلية. وعلاوة على ذلك، تلك النظم لا تسمح مراقبة دقيقة من المبالغ الجزيئية متعددة يجري تسليمها بسبب الاعتماد على السائبة العشوائية عملية التسليم الجزيئية. 9 ومن أجل معالجة هذه القضايا، وضعت العديد من المجموعات منصات Electroporation للميكروفلويديك، وتقدم ميزة انخفاض الفولتية poration، أفضل كفاءة ترنسفكأيشن، وتخفيض كبير في معدل وفيات خلية، والقدرة على تقديم جزيئات متعددة وأدلى 10-13 هذه المزايا من الممكن نظرا لآثار أقدام صغيرة من أنظمة Electroporation للالميكروسكيل الذين الملعب قطب كهربائيأطوال هي ملليمتر الفرعية، والحد بشكل كبير الفولتية المطلوبة للتسليم ناجحة. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه النظم Electroporation للالميكروسكيل تحقيق توزيع الحقل الكهربائي موحد وسريع تبديد الحرارة المتولدة، مما أسفر عن انخفاض معدل وفيات خلية مع تعزيز كفاءة التسليم. استخدام مواد شفافة لهذه الرقائق مزيد يسمح الرصد الموقعي لعملية Electroporation للللتعديلات المعلمة سريعة في. 2،12 ومع ذلك، ومراقبة دقيقة والجرعة الجزيئي والخلوي التي تعتمد على السيطرة المعلمة، اللازمة لالناشئة البحوث والتطبيقات العلاجية، 6، 14-16 لا تزال دون حل.
ويعرض هذا العمل نظام Electroporation للميكروفلويديك بمساعدة دوامة، قادرة على تقديم جزيئات متعددة بالتتابع إلى السكان متطابقة سبق اختيارهم من الخلايا المستهدفة. يتم عزل الخلايا مع توزيع حجم موحدة قبل Electroporation للاستخدام الاشتراكية عنها سابقا-زي انتقائية آلية محاصرة. 17-18 من خلال وجود توزيع موحد الحجم والتباين أقل في الكفاءة وتعزيز Electroporation للبقاء في نظرا لقوة الحقل الكهربائي تحققت 19 وعلاوة على ذلك، التحريض باستمرار خلايا المحاصرين باستخدام الدوامات الميكروسكيل سمحت للتسليم موحد للجزيئات عبر العصارة الخلوية بأكملها، بالاتفاق مع النتائج المعلنة سابقا باستخدام منصة أخرى بمساعدة دوامة Electroporation لل20 لإثبات أن هذا النظام سيكون ينطبق على مجموعة واسعة من الجزيئات المستخدمة عادة في التطبيقات البيولوجية والجزيئات مع مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية تم تسليمها إلى خلايا سرطان الثدي النقيلي. بالإضافة إلى ذلك، مع المعونة من عملية الرصد في الوقت الحقيقي، وهذا العمل يوفر المزيد من الأدلة لوضع حد للجدل منذ وقت طويل بشأن آلية تسليم الجزيئي خلال electrporation، ويجري في الغالب الكهربائي بوساطة مقابل بوساطة نشر 14 10،19 6،14،21-22 والتطبيقات التي تتطلب لفهم متعمق من الآليات الجزيئية Electroporation للتسليم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلية التحضير
- لوحة 1 × 10 5 خلية / مل من النقيلي خط خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 في حجم 10 مل لكل زراعة الأنسجة T75 قارورة في يبوفيتش L-15 المتوسطة تستكمل مع 10٪ (V / V) مصل بقري جنيني و 1 ٪ البنسلين، الستربتومايسين.
- احتضان MDA-MB-231 الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع CO 0٪ 2 البيئة.
- خلايا الحصاد للتجارب بعد 2 أيام البذر عن طريق علاج الخلايا مع 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 2 دقيقة وتعطيل النشاط الأنزيمي التربسين وذلك بإضافة 8 مل من وسائط النمو.
- خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز و resuspend في الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة (DPBS، 1X، دون 2+ الكالسيوم والمغنيسيوم 2+) إلى تركيز النهائي من 5 × 10 5 خلية / مل.
2. تصميم وتصنيع جهاز
ملاحظة: قناع، افتراءات القالب الرئيسي وعملية أرفق متناهية هي التي ستجرى داخل غرفة نظيفة بينما يمكن تنفيذ polydimethylsiloxane (PDMS) متناهية عملية الصب على الفوق المختبر منتظم.
- تصميم جهاز ميكروفلويديك كما هو موضح في الشكل 1 مع أوتوكاد. يجب أن تتكون الجهاز من مدخل مع منافذ حقن متعددة، والمرشحات الخشنة واثنين بالقصور الذاتي التركيز قنوات مستقيمة متوازية مستطيلة (L = 7 ملم، W = 40 ميكرون، وH = 70 ميكرون). تتكون قناة مستقيمة فردية من 5 غرف Electroporation لل، التي يتم وضعها 800 ميكرون وبصرف النظر (W C = 400 ميكرون) مع اثنين عبر الثقوب لأقطاب الألومنيوم. غرفتين المجاورة Electroporation للعرضيا حصة حفرة لالقطب السالب. دمج قناتين على التوالي بمأخذ في اتجاه مجرى النهر من منطقة Electroporation لل.
- تحويل الملف CAD مع أنماط الصغيرة إلى ملف GDSII باستخدام LinkCAD. إرسال أنماط الصغيرة على بعد 5 "س 5" الضوئية الرئيسية فارغةباستخدام قناع الكاتب الليزر. تطوير قناع باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. ملاحظة: تتضمن عملية التنمية قناع مقاومة للضوء تطوير والكروم الحفر ومقاومة الإزالة. بدلا من ذلك، وأنماط الصغيرة المطبوعة على قرار شفافية عالية (> 20،000 نقطة في البوصة) يمكن شراؤها من الشركة المصنعة طرف ثالث واستخدامها بوصفها الضوئية الرئيسية. ميزات الميكروسكيل النهائية على الضوئية الرئيسية ينبغي أن تكون شفافة لتتناسب مع قطبية من مقاومة للضوء سلبي.
- صنع قالب الصب من تصميم الجهاز باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة القياسية 23 مع طبقة مقاومة للضوء سلبي نسج على 4 بوصة رقاقة السيليكون في 2،000 دورة في الدقيقة لسمك النهائي من 70 ميكرون.
- Prebake الرقاقة مع مقاومة للضوء سلبي لمدة 20 دقيقة في 95 درجة مئوية.
- الاتصال قناع مع رقاقة وكشف مصدر الأشعة فوق البنفسجية (17.4 ميغا جول / سم 2) لمدة 80 ثانية باستخدام قناع اليجنر.
- تطوير رقاقة يتعرض لمدة 4 دقائق في مطور SU-8.
- قياسسمك مقاومة للضوء نموا باستخدام profilometer السطح.
- مزيج دقيق 10: 1 نسبة من المطاط الصناعي لعلاج وكيل (طقم سيليكون المطاط الصناعي) ويسكب الخليط على صب القالب لتوليد النسخ المتماثلة PDMS. ديغا والمطاط الصناعي الصب لمدة 30 دقيقة وعلاج صب القالب مع المطاط الصناعي نزع الغاز في الفرن على 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- Delaminate علاجه نسخة PDMS مع أنماط متناهية من العفن وكمة ثقوب للمداخل، ومنفذ كهربائي الإدراج باستخدام ملزمة دبوس. ملاحظة: القطع العادي قطرها حافة ملزمة دبوس ينبغي أن تكون 0.76 مم، كاف لعقد بإحكام أنابيب نظرة خاطفة (OD من 1/32 ") وأقطاب الألومنيوم (OD من 0.029") في المكان.
- خلق قنوات ميكروفلويديك محاطة PDMS الترابط النماذج المقلده، لشريحة زجاجية المعالجة في نظافة الأكسجين البلازما لمدة 7 ثانية على تردد الراديو السلطة وضغط الأكسجين الجزئي من 75 W و 500 mTorr، على التوالي.
3. التجارب التدفق
- إدراجأقطاب الألومنيوم (0.029 "OD) والأنابيب منفذ نظرة خاطفة (1/32" OD) في الأماكن المخصصة عبر ثقوب في متناهية (انظر الشكل 3B).
- ربط المعدات الكهربائية 18 المسؤولة عن توليد عالية الجهد نبضات قصيرة مربع الموجة إلى أقطاب الألومنيوم (انظر الشكل 3C) التي هي على اتصال مع تدفق الحلول في قالب PDMS. ملاحظة: يجب أن تتكون المعدات من مولد النبض ومكبر للصوت عالية الجهد المدمج في المنزل 18.
- إعداد أربعة 50 مل أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي DPBS بشكل فردي، مع حلول الخلايا والجزيئات الحيوية، ونعلق كل أنبوب لحامله قنينة منها متصلا نظام التحكم في التدفق الهوائية (انظر الشكل 3A) 18
- ربط مدخل أنابيب نظرة خاطفة من أصحاب القارورة في الثقوب مدخل منها في الجهاز ميكروفلويديك.
- تعيين حجم البقول مربع الموجة، V، 100 V من أجل أن يكون التعبير عن عدم الرضا الكهربائيةقوة دينار، E = V / L الإلكترونية، عبر غرفة Electroporation للمعادلا ل0.7 كيلوفولت / سم. ملاحظة: هنا، L e هو المسافة بين نقطتين حيث الأقطاب الموجبة والسالبة على اتصال مع الحل المتدفقة (انظر الشكل 1).
- ضبط منظم الضغط إلى 40 رطل. ملاحظة: يتم استخدام مصدر النيتروجين قابل للتعديل يدويا واحد للضغط بشكل موحد كل قارورة العينة ويستخدم مشعب عالية السرعة في الوقت المناسب لتفعيل الموانئ حل الفردية باستخدام برنامج ابفيف مبنية خصيصا 18
- لصمام التحكم، افتح البرنامج ابفيف مبنية خصيصا المسمى صمام عداء، ثم انقر فوق تشغيل من القائمة المنسدلة بعنوان تعمل.
- تشغيل الصمامات عن طريق النقر على كل أيقونة صمام المقابلة. ملاحظة: رمز صمام يجب أن يتحول إلى اللون الأخضر عندما يتم تنشيطه. سوف النقر فوق رمز نشط تعطيل وإغلاق صمام. رمز صمام مغلق ينبغي أن يتحول الرمادي.
- فتح صمام الخزان DPBS (أي.، غسل الحل) لرئيس سرعة تدفق اللازمة لمستقر خلية للاحتباس الجيل دوامة لمدة 1.5 دقيقة.
- التبديل ميناء حل فعال من الحل غسل إلى حل الخلية إلى خلايا فخ في غرفة Electroporation لللمدة 30 ثانية (أي الخطوة الاحتباس الخلية).
- تدفق كل من غسل وخلية الحلول من خلال جهاز في وقت واحد لمدة 10 ثانية قبل خطوة محاصرة خلية لضمان تدفق undisrupted خلال خطوات التحول الحل. ملاحظة: ينبغي تكرار هذه الخطوة شارك في تدفق وجيزة في كل خطوة تبديل الحل.
- تشغيل ميناء غسل ومسح الجهاز لمدة 20 ثانية لإزالة الخلايا غير تلويث المحاصرين.
- حقن محلول يحتوي على جزيء الأول من الفائدة (0.2 ملغ / مل من 3،000 دا جزيئات ديكستران محايد وأنيوني أو 1.5 ملغ / مل من 70،000 دا جزيء ديكستران محايد) في الجهاز.
- تطبيق خمس نبضات قصيرة (Δt = 30 مللي ثانية مع فترات 2 ثانية) فورا بعد الحقن للحل الجزيئي ومراقبة حجم ومدة النبضات الكهربائية المطبقة في الوقت الحقيقي باستخدام الذبذبات.
- كرر الخطوة 3.10 عدة مرات كما أن عدد جزيئات إضافية ليتم تسليمها. لكل تسليم الجزيئي، واحتضان خلايا لمدة 100 ثانية في المحلول الجزيئي ثم مسح الجهاز مع محلول الغسيل لمدة 100 ثانية لإزالة جزيئات الزائدة.
- الافراج عن الخلايا في 96 لوحة جيدا لتحليل المصب عن طريق خفض ضغط التشغيل أقل من 5 رطل. ملاحظة: حوالي 100 ميكرولتر من حل مع 100 خلية تم جمعها من كل إصدار.
- تشغيل تجريبي خطوات 3.9 خلال 3.16 ثلاث مرات لجمع ما يكفي من الخلايا لالتدفق الخلوي.
- أجهزة الطرد المركزي لوحة 96 جيدا تحتوي على خلايا المصنعة لمدة 5 دقائق في 228 × ز.
- إزالة طاف التي تحتوي على جزيئات الفلورسنت الزائدة.
- الخلايا resuspend في DPBS لتحليل التدفق الخلوي.
- خلايا الحمل في تدفق عداد الكريات لأجلك الجزيئيptake تحليل الكفاءة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تسليم electroporator ميكروفلويديك موازية وضعت الجزيئات مع أحجام متنوعة والشحنات الكهربائية في الخلايا الحية سرطان الثدي النقيلي. تم تحديد تسليم الجزيئي الناجح نوعيا من خلال رصد التغيرات في كثافة الفلورسنت من الخلايا التي تدور حول electroporated في الموقع وأكدته القياسات الكمية عبر تحليل التدفق الخلوي. الشكل 4A تبين أن 90٪ من الخلايا المعالجة للامتصاص 70،000 دا ديكستران محايد. للتحليل الإحصائي، أنشئ عتبة كثافة لكل fluorophore هذا أن الغالبية (> 99٪) من الخلايا الحية غير المجهزة يتم حساب تحت عتبة (انظر الشكل 4 (ج)). يتم تعريف الكفاءة كنسبة من عدد الخلايا أخذ بنجاح الجزيئات التي تهم العدد الكلي للخلايا المصنعة. الشكل 4B يوضح أن كفاءة لا تختلف بشكل كبير تبعا الجزيئيةالوزن أو رسوم الكهربائية (P> 0.1). تم تسليم جميع الجزيئات ديكستران اختبارها في العصارة الخلوية مع كفاءة أكبر من 70٪. بالإضافة إلى ذلك، الشكل 4D يسلك أن تسليم الجزيئي متتابعة أجريت بنجاح مع مزدوجة جزيء كفاءة تسليم 56٪ باستخدام أنيوني وdextrans محايدة مع الوزن الجزيئي متطابقة (MW = 3،000 دا). النظام الحالي يمكن معالجة الخلايا مع 10 أضعاف أعلى إنتاجية ومتعددة جزيء كفاءة تسليم من النظام ذكرت سابقا 18 وهذا التحسن لا يؤثر على تسليم واحد جزيء (82٪ و 70٪ للأنيوني ومحايد ديكستران، على التوالي).
الرقم 1. (A) والتخطيطي للنظام Electroporation للميكروفلويديك، التي تتألف من مداخل للخلايا (كما تدل C)، والجزيئات (كما تدل M1 و M2) وsolut دافقأيون (كما تدل F)، قناتين على التوالي حيث يحدث بالقصور الذاتي التركيز، و 10 غرف Electroporation للمع أقطاب ومنفذا. (B) مظاهرة الصرف الحل في مدخل باستخدام محلول 1μM FITC وحل دافق (DPBS) إلى أن الحل الفعال يمكن حقنها بشكل موحد على جميع صفائف غرف المصب. ومما يعزز تباين الصورة من خلال تعديل الجدول نظرة متابعة (طرفية). الحانات هي مقياس 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. صورة من القطب 15 دبوس المستخدمة لتطبيق نبضة قصيرة عالية الجهد، ويتألف من 10 موجبة (+) وخمسة أقطاب سالبة (-). ومتباعدة كل القطب الموجب 2 مم وبصرف النظر عن القطب السالب، والبريدومتباعدة منظمة العمل ضد الجوع الكهربائي من نفس قطبية 1.35 ملم إربا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. تخطيطي للجهاز التجريبي، تتألف من (A) وحدة السوائل السيطرة، (ب) electroporator ميكروفلويديك، و (C) المعدات الكهربائية. (A) قوارير تحتوي على حلول مع الجزيئات والخلايا وعازلة نظيفة يتعرضن لضغوط فردي عند الطلب باستخدام ابفيف تسيطر نظام تدفق هوائي. يتم حقن المحلول من القارورة الضغط في electroporator ميكروفلويديك من خلال نظرة خاطفة أنابيب مع صمام الاختيار تركيبها. (B) و (C) ويتم إرسال إشارات كهربائية إلى أقطاب 15 دبوس في اتصال مع وحل خوار في نظام ميكروفلويديك خلال الخطوة Electroporation لل. يتم إنشاء نبضات كهربائية مع مدة برمجتها باستخدام مولد النبض وحجم نبض كهربائي يتم تضخيمه إلى 100 فولت بواسطة مكبر للصوت عالية الجهد. ويتم رصد جميع المعلمات الكهربائية المطبقة في الوقت الحقيقي باستخدام الذبذبات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم تتدفق 4. ممثل الخلوي البيانات. (A) إشارات الفلورسنت من MDA-MB-231 الخلايا التي تولت بنجاح جزيء 70،000 دا ديكستران أنيوني، مقارنة بما كان عليه من نظيره السيطرة. (B) والكفاءة لكل جزيء ديكستران نقل لا تظهر أهمية الجزيئية تعتمدالاختلاف (ص> 0.1). (C) التدفق الخلوي الممثل لمحات عن الخلايا، والتي لم تعالج Electroporation لل(السيطرة). يتم تعيين عتبة الفلورسنت مشيرا تسليم الجزيئي ناجحة من البيانات بحيث تم العثور على إشارات من عينات السيطرة تحت عتبة. (D) الممثل تدفق البيانات الخلوي للخلايا electroporated بالتتابع. صناديق خضراء، حمراء وصفراء في التدفق الخلوي مؤامرة وخط الفلورسنت الصور على الجانب الأيمن تمثل إشارات الفلورسنت من خلايا uptaking 3،000 دا ديكستران فقط محايد، أنيوني ديكستران فقط وكلا جزيئات ديكستران، على التوالي. شريط النطاق هو 100 م. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مع منصة Electroporation للبشكل متوازي جديدة، وتعزيز 10 أضعاف في الإنتاجية والكفاءة في تقديم متعددة جزيء تم تحقيقه بالإضافة إلى جميع المزايا التي يوفرها نظام غرفة واحدة وضعت سابقا. تشمل 18 المزايا المتاحة سابقا (ط) قبل تنقية استهداف الخلايا مع توزيع موحد لتعزيز حجم جدوى، (ب) التحكم جرعة الجزيئية الدقيقة والفردية، و (iii) انخفاض التيار الكهربائي التشغيلي. Fluorescently تم اختيار dextrans وصفت بأنها جزيئات من الفائدة لأنها متاحة بسهولة في مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية، وأنواع fluorophore مترافق، والشحنات الكهربائية. هذه الجزيئات الكلية هي مرشحين جيدين لمثل هذه الدراسة نظرا لأنها بطبيعتها غشاء كتيمة للخلايا الحية و لا تظهر السمسة 24 تركيز الأمثل للديكستران الفلورسنت، وفترة حضانة، وجرى تحديد المعلمات الكهربائية للنظام الحالي مسبق رس التجارب Electroporation لل. وكانت عملية التحسين بسيطة وفعالة بدلا نظرا لقدرة منصة لمراقبة عملية امتصاص الجزيئية في الوقت الحقيقي. التصور من هذه العملية هو مفيد جدا إذا كان يتم اختبار جزيء أو خلية نوع مع القليل إلى أي علم من المعلمات Electroporation لل. تم تعيين فترة حضانة لجميع الجزيئات اختبارها لتكون 100 ق التي خلايا المحاصرين في جميع غرف 10 تظهر إشارات كثافة الفلورسنت كشف في الوقت الحقيقي، مما يدل على الانتهاء من تسليم الجزيئي ناجحة. لاحظ أن هذا ليس الحد الأدنى من مدة الحضانة المطلوبة للتسليم الجزيئي.
كان هناك نقاش طويل الأمد فيما يتعلق بعملية تسليم الجزيئية باستخدام Electroporation لل، سواء بوساطة فقط من قبل نشر 4،19،25 أو بواسطة الكهربائي 26 تحديد الآلية المهيمنة التسليم الجزيئي ينطوي على سلسلة من الاختبارات الفردية شاقة، مقارنة رانه نتائجها اعتمادا على الأحجام الجزيئية، رسوم الكهرباء والمعلمات Electroporation لل. لأفضل لمعرفة المؤلفين، ولم يتم الإبلاغ عن هذه العمليات الأمثل شاقة مع النظم التقليدية Electroporation لل. 4،26-28 بسيطة القدرة الأمثل المعلمة النظام المتقدم سمحت لتحديد آلية تسليم الجزيئية المهيمنة، من خلال دراسة التغيرات في كفاءة Electroporation لل اعتمادا على المعلمات الجزيئية والكهربائية. وأظهرت النتائج أن كفاءة أنيوني 3،000 دا ديكستران لم تختلف بكثير من نظيره محايد لها (83 و 75٪ على التوالي)، مما يشير إلى أن امتصاص الجزيئي لوحظ ربما كان بوساطة نشر. خلافا للأنظمة Electroporation للأخرى، كانت الخلايا المصنعة تحريكها باستمرار طوال عملية Electroporation للفي هذا النظام. وقد لوحظ زيادة تدريجية في إشارات الفلورسنت من الخلايا التي تدور، أن يشير إلى أن انتشار يكون دوميناالإقليم الشمالي آلية التسليم. ارتفاع كفاءة امتصاص الجزيئي (90٪) من 70،000 محايدة دا جزيئات ديكستران يعني أيضا أنه حتى في الأوزان الجزيئية العالية حدوث عملية التسليم نتيجة لنشرها. وأخيرا، ناجح تسليم متتابعة من 3،000 دا جزيئات ديكستران أنيوني ومحايدة يتصلب الادعاء بأن تسليم الجزيئي يحدث بالرغم من تهمة الجزيئات. وتشير هذه النتيجة أيضا أن إعادة عزل الغشاء لم يكتمل بعد 3 دقائق من Electroporation لل(100 ثانية في تسليم الجزيئي).
منصة تسليم الجزيئي عرض يمكن أن يحقق بالتتابع نطاقات واسعة من الأحجام الجزيئية بغض النظر عن التهم الموجهة إليهم الكهربائية. لا يمكن أن يتحقق في الوقت المناسب صقل وتعديل المعلمات الفردية مع القليل من الجهد بمساعدة من قدرة عملية الرصد في الوقت الحقيقي. على أساس حجم عملية تنقية خلية النظام يلغي الحاجة لإعداد نموذج شاقة وتستغرق وقتا طويلا الطرد المركزي قبل وبعد electroporationالخطوات. وعلاوة على ذلك، وانخفاض التشغيلية الحالية للنظام يقلل بشكل كبير معدل وفيات الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويؤيد هذا العمل من قبل برنامج رولاند زميل جديد. فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتناني للعلماء والموظفين في معهد رولاند في جامعة هارفارد: كريس ستوكس لمساعدته في تطوير مبنية خصيصا، بمساعدة الحاسوب الإعداد السيطرة على ضغط، وديان Schaak، دكتوراه لها مدخل للتعامل مع عينة البيولوجي، وينفيلد هيل لتطوير الإعداد الكهربائية، Alavaro سانشيز، دكتوراه لمنح الوصول إلى تدفق عداد الكريات، سكوت بيفيس، كيني روجرز دون سبنسر وبالقطع لمكونات السباكة الميكانيكية اللازمة لإعداد الضغط. ملفقة الماجستير ميكروفلويديك في مركز لأنظمة النانو (CNS) في جامعة هارفارد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MDA-MB-231 cancer cell line | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Cellgro, Mediatech, Inc. | 10-045-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco, Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Cellgro, Mediatech, Inc. | 21-030 | |
| Trypsin | Gibco, Life Technologies | 25200-056 | |
| Flow Cytometer easyCyte HT | Millipore | 0500-4008 | |
| Oxygen Plasma Cleaner | Technics Micro-RIE | ||
| Dektak 6M surface profiler | Veeco | ||
| KMPR 1050 | Microchem | ||
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Compressed Nitrogen gas | Airgas | NI 300 | |
| High Pressure Regulator | McMaster-Carr | 6162K22 | |
| Downstream regulator | McMaster-Carr | 4000K563 | |
| High-speed 3/2way-8 valve manifold | Festo | ||
| Inline Check Valve | Idex Health and Science | CV3320 | |
| 5/32" OD x 3/32" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-156F-0 | |
| 1/4" OD X 0.17" ID Polyurethan tubes | Pneumadyne | PU-250PB-4 | |
| 1/16" PEEK tubings | Festo | P1533 | |
| 1/32" PEEK tubings | Idex Health and Science | P1569 | |
| PEEK tubing unions | Idex Health and Science | P881 | |
| Pulse Generator | HP | 8110A | |
| Aluminum Wire | Bob Martin Company | 6061 ALUM | |
| Oscilloscope | Agilent | DSO3062A | |
| 50 ml centrifuge tubes | VWR | 21008-178 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR | 21008-216 | |
| T75 culture flask | VWR | 82050-862 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic | Gibco, Life Technologies | D3307 | |
| Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D1819 | |
| Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral | Gibco, Life Technologies | D3329 |
References
- Nakamura, H., Funahashi, J. Electroporation Past present and future. Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).
- Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).
- Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation. Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).
- Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells. Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).
- Jaroszeski, M. J., et al. Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro. Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).
- Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology. Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).
- Heller, R., et al. Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation. DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).
- Boukany, P. E., et al. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).
- Wang, J., et al. Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma. In Vitro PLoS One. 7, (2012).
- Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel. Appl Phys Lett. 101, (2012).
- Wang, S. N., Lee, L. J. Micro-/nanofluidics based cell electroporation. Biomicrofluidics. 7, (2013).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, U649-U693 (2009).
- Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, U311-U313 (2007).
- Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices. Biomicrofluidics. 5, (2011).
- Yun, H. Y., Hur, S. C. Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation. Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).
- Gehl, J. Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).
- Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. Vortex-assisted DNA delivery. Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).
- Jia, F. J., et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).
- Dunbar, C. E. Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease. Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).
- Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake. Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).
- Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).
- Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).
- Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments. Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).
- Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions. Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).
